Mikrotubuli sind filamentöse intrazelluläre Polymere, die als grundlegende Bestandteile subzellulärer Strukturen in Eukaryoten dienen. Diese Studie verwendet einen vergleichenden Ansatz, um zu untersuchen, wie sich die intrinsischen dynamischen und biochemischen Eigenschaften von Tubulin zwischen verschiedenen Spezies unterscheiden, und zeigt ihre Konsequenzen in zwei verschiedenen physiologischen Kontexten: 1) Bestimmung der Spindelgröße bei Fröschen der Gattung Xenopus und 2) Spezifität von Mikrotubuli-Inhibitoren für Plasmodium falciparum-Mikrotubuli über denen ihres menschlichen Wirts. In den Eiern der Froschgattung Xenopus wird die Länge der meiotischen Spindel biochemisch festgelegt und erreicht unabhängig von räumlichen Einschränkungen eine Obergrenze. Messungen der Dynamik von Xenopus-Mikrotubuli zeigen, dass X. laevis-Mikrotubuli sowohl schneller wachsen als auch länger leben als die von X. tropicalis. Darüber hinaus spielt die Quantifizierung der Länge und Massenverteilung der Xenopus-Mikrotubuli zusammen mit den Reaktionen der Eiextrakt-Spindelanordnung eine Rolle für die intrinsische Dynamik der Mikrotubuli bei der Modulation der Spindellänge. Mikrotubuli sind auch Wirkstofftargets bei Pilz- und parasitären Helmintheninfektionen und haben in den letzten Jahrzehnten die Aufmerksamkeit als potenzielles Wirkstoffziel beim Malariaparasiten Plasmodium falciparum auf sich gezogen. Um die Dynamik und Medikamentspezifität von Mikrotubuli von P. falciparum zu charakterisieren, haben wir Tubulin direkt von den Parasiten gereinigt. Zum ersten Mal wurden hier dynamische P. falciparum-Mikrotubuli in vitro rekonstituiert und eine parasitenspezifische Unterdrückung der Dynamik von Mikrotubuli durch Oryzalin und Amiprofos-Methyl direkt nachgewiesen. Diese Studie legt einen experimentellen Rahmen fest, um direkt auf parasitenspezifische Hemmung von Mikrotubuli zu testen, die bisher unter Verwendung bestehender in-vitro-Ansätze nicht beobachtet wurden. / Microtubules are filamentous intracellular polymers that are fundamental components of subcellular structures including the spindle, the cytoskeleton, and flagella in eukaryotes. This study uses a comparative approach to investigate how the intrinsic dynamic and biochemical characteristics of tubulin vary between species and demonstrates their consequences in two different physiological contexts: 1) Spindle size control in Xenopus frogs, and 2) The specificity of microtubule inhibitors for Plasmodium falciparum microtubules over those of their human host. In Xenopus frog eggs, the length of the spindle is biochemically controlled and reaches an upper limit independent of spatial constraints. In this study, in vitro measurements of Xenopus microtubule dynamics show that X. laevis microtubules are both faster-growing and longer-lived X. tropicalis, independent of the influence of microtubule-associated proteins. Furthermore, quantification of Xenopus microtubule length and mass distributions, combined with egg extract spindle assembly reactions, establishes a role for intrinsic microtubule dynamics in modulating spindle length. Microtubules are also established drug targets in fungal and parasitic helminth infections and have in the past decades drawn attention as a potential drug target in the malaria parasite Plasmodium falciparum. In order to characterize P. falciparum microtubule dynamics, structure, and drug specificity, we have used an affinity chromatography-based approach to purify tubulin directly from blood-stage parasites. For the first time, dynamic P. falciparum microtubules have been reconstituted in vitro and parasite-specific suppression of microtubule dynamics by oryzalin and amiprofos methyl has been directly demonstrated. This study establishes an experimental framework to directly test for parasite-specific microtubule inhibition, microtubule structure, and interactions with MAPs that previously have not observed using existing in vitro approaches.

Die innerste Schicht von Blutgefäßen wird durch Endothelzellen geformt. Dort haben sie das Potential neue Blutgefäße durch einen Prozess Namens Angiogenese zu bilden. In Krebspatienten wurde gezeigt, dass Medikamente, die auf Mikrotubuli zielen, die tumorassoziierte Angiogen ese hemmen. Diese Erkenntnis lässt auf eine Rolle der Mikrotubuli-Dynamik im Prozess der Angiogenese schließen. Die fein abgestimmte Mikrotubulus-Dynamik wird durch posttranslationale Tubulinmodifikationen, wie die durch die Vasohibin-1 katalysierte Mikrotubuli-Detyrosinierung, moduliert. Dennoch sind die Rollen der Mikrotubuli-Dynamik und -Detyrosinierung während der Angiogenese noch nicht verstanden. Ich konnte zeigen, dass Mikrotubuli in aussprossenden Zellen schneller und für kürzere Zeit wachsen, und dass sie in Abhängigkeit vom Blutfluss stabilisiert werden. Funktionelle Studien haben gezeigt, dass die Dynamik der Mikrotubuli eine Rolle bei der Streckung und Proliferation von Endothelzellen spielt und dadurch für die korrekte Gefäßmorphogenese notwendig ist. Vasohibin-1 detyrosiniert α-Tubulin und wird im Endothel von Zebrafischen stark exprimiert. Ich habe herausgefunden, dass endotheliales Tubulin vorwiegend in aus sprossenden Gefäßen der hinteren Kardinalvene detyrosiniert wird. Bei sekundären Aus sprossungen führte der Funktionsverlust von Vasohibin-1 zu einer allgemeinen Abnahme der Mikrotubuli-Detyrosinierung, was zu einem abnormalen Sprossungsverhalten führte. Es unter Verlust von Vasohibin-1 eine vermehrte Zellteilung und eine erhöhte Zellzahl in sekundären Aussprossungen gibt. Infolge dessen scheitern diese Zellen daran die Lymphgefäße zu bilden und bauen stattdessen überschüssige Verbindungen zwischen den Venen. Meine Erkenntnisse lassen vermuten, dass die Tubulin-Detyrosinierung spezifisch die Zellteilung in den sekundären Aussprossungen kontrolliert, um die Bildung der venösen und lymphatischen Gefäße im Zebrafisch-Schwanz zu erreichen. / Endothelial cells form the inner layer of blood vessels. There, they retain the potential to develop into new vessels through a process known as sprouting angiogenesis. Microtubule targeting drugs inhibit tumour-associated angiogenesis in cancer patients, suggesting a role of microtubule dynamics in this process. The fine-tuned microtubule dynamics are modulated by tubulin post translational modifications such as microtubule detyrosination, catalysed by Vasohibin-1. The role of the microtubule dynamics and detyrosination in angiogenesis remains elusive. The aim of my research is to increase the understanding of the role of microtubule dynamics and stability in vessel development and maturation by studying and manipulating the microtubule dynamics in the zebrafish embryo. In Chapter 3, I show that microtubules grow faster and for shorter periods in sprouting cells, and stabilise over time, in a flow-dependent manner. Functional studies showed that microtubule dynamics are necessary for the correct vessel morphogenesis, by playing a role in endothelial cell elongation and proliferation. In Capter 4, I show that Vasohibin-1 detyrosinates α-tubulin and is highly expressed in the endothelium of zebrafish. I found that endothelial tubulin is predominantly detyrosinated in sprouting vessels from the posterior cardinal vein of the zebrafish. In these secondary sprouts, Vasohibin-1 loss-of-function led to an overall decrease of microtubule detyrosination resulting in abnormal sprouting behaviour. High resolution imaging revealed increased cell division and cell numbers in Vasohibin-1 deficient secondary sprouts. These cells then failed to build the lymphatic vessels and instead populate superfluous connections between veins. I propose that tubulin detyrosination specifically controls cell division of secondary sprouts to achieve adequate formation of venous and lymphatic vasculature in the zebrafish trunk.