Die Veraenderungen des Immunsystems mit zunehmendem Alter, Immunseneszenz genannt, resultieren in erhoehter Infektanfaelligkeit. Infolge dessen leiden aeltere Menschen unter haeufigeren und schwerer verlaufenden Infekten, Autoimmunerkrankungen und vermindertem Impfschutz. Immunseneszenz entsteht nicht nur aufgrund chronologischen Alterns, sondern wird auch durch andere teils ungeklaerte Faktoren verursacht. Cytomegalievirus (CMV) ist ein Herpesvirus, dass in immunkompetenten Menschen lebenslang persistiert. Infolge chronischer Immunaktivierung traegt CMV zur beschleunigten Immunseneszenz bei. In dieser Arbeit wurden die Alters- und CMV-induzierten Veraenderungen in humanen T-Zellen analysiert. Dafuer wurden PBMC von 50 gesunden Spendern in drei verschiedenen Altersgruppen antigenspezifisch (CMV-Proteine pp65 und IE1 und protein purified derivate von Mycobacterium tuberculosis (PPD)) und polyklonal (OKT3) in vitro stimuliert. Ein 11-Farben-Panel wurde etabliert, um die simultane Expression der Differenzierungsmarker CD45RA und CD27 und der Aktivierungsmarker CD40L, IFNg, IL2 und TNF auf T-Zellen durchflusszytometrisch zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die antigenabhaengige Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen mit zunehmendem Alter und CMV-Infektion zunahm. Die Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen in CMV-positiven Spendern war ausserdem mit der Antwortgroesse gegen pp65 korreliert. Die pp65-spezifische, aber nicht die IE1-spezifische polyfunktionale T-Zell-Antwort nahm mit zunehmendem Alter der Probanden zu. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass CMV einen grossen Einfluss auf das Immunsystem gesunder Individuen hat. Die Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen ist nicht nur abhaengig von der Infektion mit CMV, sondern auch davon, wie das Immunsytem auf CMV reagiert. Polyfunktionale CMV-spezifische T-Zellen, die wahrscheinlich CMV kontrollieren, sind vorhanden und werden nicht von dysfunktionalen T-Zellen im Alter verdraengt. / Ageing of the immune system, also called immunosenescence, is a phenomenon that leads to increased susceptibility to infections in elderly people. Persistent cytomegalovirus (CMV) infection induces strong T cell responses in humans and is thought to be one of the driving forces of immunosenescence. In this work CMV-induced alterations in the T cell compartment of human individuals were analysed in terms of frequencies and absolute numbers per ml blood. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 50 donors in three different age groups were stimulated in vitro and examined for the phenotypic markers CD45RA and CD27 and the effector molecules CD40L, IFNg, IL2 and TNF by polychromatic flow cytometry. The frequency of responding polyfunctional T cells to stimulation with OKT3 or CMV peptide pools phosphoprotein 65 (pp65) or immediate-early protein1 (IE1) increased with the age of the donor. The memory subset distribution differed between CMV-seronegative and CMV-seropositive donors and was correlated with the response size in the CMV-seropositive group. Polyfunctional T cells expressed quantitatively and qualitatively more activation marker on a per cell level than monofunctional cells and therefore appeared to be more effective. Furthermore, polyfunctional T cells expressed reduced amounts of surface CD3, CD4 and CD8 compared to monofunctional or non-responding T cells. In summary, the results indicate that CMV has a significant influence on the immune system of healthy people. The memory subset composition of the entire T cell compartment depends on how the immune system responds to CMV (large or small responses) rather than the presence or absence of infection. Irrespectively of response size or age a robust population of polyfunctional CMV-specific T cells is present and may be in control of CMV.

Die von T-Helfer (Th) -Zellen produzierten Zytokine spielen eine entscheidende Rolle bei der Einleitung, der Aufrechterhaltung und der Regulation von Immunantworten. Bei der Untersuchung von Immunantworten hat sich eine vereinfachte Einteilung der Th-Zellen in zwei Klassen als hilfreich erwiesen: Th1 und Th2. Stabil differenziell exprimierte Oberflächenmoleküle werden benötigt, um lebende Th1- und Th2-Zellen identifizieren, auf Einzelzellebene charakterisieren und möglicherweise die von ihnen erzeugten Immunantworten modulieren zu können. Auf der Suche nach solchen Molekülen wurde in Zusammenarbeit mit der Firma Millennium Pharmaceuticals das Oberflächenmolekül TIM-3 entdeckt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass TIM-3 nicht nur von CD4+ Th-Zellen, sondern auch von CD8+ T-Zellen, gamma/delta-T-Zellen, sowie einigen Makrophagen und der Mehrheit der dendritischen Zellen in der Milz von Mäusen auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Die Expression von TIM-3 auf Th-Zellen ist klar mit einem aktivierten Phänotyp assoziiert. TIM-3 wird unter polarisierenden Bedingungen in vitro im Vergleich zu Th2-Zellen bevorzugt, jedoch nicht ausschließlich von Th1-Zellen exprimiert. Erstmals wurde auf Einzelzellebene die Zytokinproduktion TIM-3 exprimierender Th-Zellen untersucht. Die Analyse von Th0-Zellen, welche unter nichtpolarisierenden Bedingungen in vitro hergestellt wurden, ergab keine bevorzugte Produktion von Th1-Zytokinen und keine verminderte Expression von Th2-Zytokinen durch TIM-3 exprimierende Th-Zellen. Aufgrund der in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse erlaubt die Expression von TIM-3 allein daher nicht die Identifizierung von Th1-Zellen. Nach einer Infektion mit Toxoplasma gondii lag jedoch eine bevorzugte Assoziation zwischen der Expression von TIM-3 und der pathogenspezifischen Produktion von Interferon (IFN)-gamma, Interleukin (IL)-2 und Tumor Nekrose Faktor (TNF)-alpha vor. Somit korreliert die TIM-3 Expression auf Th-Zellen nur unter bestimmten Bedingungen mit einem Th1-Phänotyp. / The cytokines that are produced by T helper (Th) cells are decisive for the initiation, the maintenance and the regulation of immune responses. A simplified classification of Th cells has proven to be useful for the analysis of immune responses: Th1 and Th2. Stably and differentially expressed surface molecules are required for the identification of live Th1- and Th2-cells, their characterisation at the single cell level and the possible modulation of the immune responses that they induce. On the search for such molecules the surface molecule TIM-3 was discovered in collaboration with Millennium Pharmaceuticals. The present work shows that TIM-3 protein is not only expressed on the cell surface by CD4+ Th cells but also by CD8+ T cells and gamma/delta T cells as well as by some macrophages and the majority of the dendritic cells in the murine spleen. TIM-3 expression on Th cells is clearly associated with an activated phenotype. Under polarising conditions in vitro TIM-3 is expressed preferentially albeit not exclusively by Th1 cells compared to Th2 cells. For the first time, the cytokine production of TIM-3 expressing Th cells has been analysed at the single cell level. The analysis of Th0 cells, generated under non-polarising conditions in vitro showed no preferential production of Th1-cytokines and no diminished production of Th2-cytokines by TIM-3 expressing Th-cells. The results obtained in this work lead to the conclusion that expression of TIM-3 does not permit the identification of Th1-cells. However upon infection with Toxoplasma gondii a positive association between the expression of TIM-3 and the pathogen-specific production of Interferon (IFN)-gamma, Interleukin (IL)-2 and Tumor Necrosis Factor (TNF)-alpha was observed. Therefore the expression of TIM-3 on Th-cells only correlates under specific conditions with a Th1-phenotype.

Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Einfluss des mitochondrialen Proteins TCAIM (T cell activation inhibitor, mitochondrial) auf die T-Zellaktivierung untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einem T-zellspezifischen knock-in (KI) von Tcaim in den Rosa26 Lokus generiert. Die Tcaim-Überexpression beeinflusste die Fission und Umverteilung von Mitochondrien und reduzierte die T-Zellrezeptor (TZR)-induzierte Bildung mitochondrialer, radikaler Sauerstoffspezies. In vitro stimulierte CD4+ Tcaim KI T-Zellen zeigten eine geringere Aktivierung, Proliferation und IL-2 Sekretion als Kontrollzellen. T-Zellen aus Tcaim KI Mäusen, die in Rag-1 knock-out Mäuse transferiert wurden, waren nicht fähig ein allogenes Haut-Transplantat abzustoßen und behielten einen naiven Phänotyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass TCAIM als mitochondriales Protein wichtige Schritte in der Zellaktivierung und der Bildung von Gedächtnis-T-Zellen beeinflusst. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigte sich mit dem Einfluss der CD44-Oberflächenexpression auf die Differenzierung von T-Helfer (TH)-Zellen. Eine hohe CD44-Expression unterscheidet Effektor- von naiven T-Zellen. Durch die allogene Stimulation von CD4+ T-Zellen bildeten sich drei verschiedene Populationen: CD44+, CD44++ und CD44+++. Sowohl in vitro als auch in vivo generierte alloreaktive TH17-Zellen wurden in der CD44+++ Population, TH1-Zellen hingegen in der CD44++ Population, detektiert. Es wurde beschrieben, dass sowohl eine geringe TZR- als auch eine geringe CD28-Stimulation eher die Bildung von TH17- als TH1-Zellen unterstützen. Unter genau diesen Bedingungen kann CD44 als kostimulatorisches Molekül die Signaltransduktion verstärken. Tatsächlich zeigten allogenreaktive CD44+++ TH-Zellen eine höhere ZAP-70-Phosphorylierung als CD44++ TH-Zellen. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass CD44 durch die Verstärkung der Signaltransduktion die TH17-Differenzierung fördern kann. / Within the first part of this thesis, the influence of the mitochondrial Protein TCAIM (T cell activation inhibitor, mitochondrial) on T cell activation was investigated. Tcaim expression correlated negatively with the rejection of allografts and it is down-regulated during T cell activation. To study effects of TCAIM during T cell activation, we generated a T cell-specific mouse strain with a Tcaim knock-in (KI) targeted to the Rosa26 locus. Tcaim overexpression changed the mitochondrial morphology and reduced the T cell receptor (TCR)-induced mitochondrial reactive oxygen species production. In vitro activation of Tcaim KI CD4+ T cells resulted in a decreased activation, proliferation and cytokine release. Importantly, Rag-1 knock-out mice, reconstituted with Tcaim KI T cells, tolerated allogeneic skin grafts. Thus, by regulating TCR-induced mitochondrial distribution and ROS production, TCAIM controls important steps during T cell activation and memory formation. The second part dealt with the influence of CD44 surface expression level for T helper cell (Th cell) differentiation. By association with lymphocyte-specific protein kinase (LCK) it can enhance T cell signaling. Allogeneic stimulation of CD4+ T cells resulted in the formation of three distinguishable populations: CD44+, CD44++ and CD44+++. In vitro and in vivo generated allo-reactive TH17 cells were mainly CD44+++. This is in contrast to TH1 cells which were dominantly CD44++. Titration experiments revealed that low TCR- and co-stimulation supports TH17 rather than TH1 development. Under exactly these conditions it was reported that CD44 can act as co-stimulatory molecule and replace CD28. Indeed, CD44+++CD4+ T cells contained already more phosphorylated ZAP-70 as compared to CD44++ cells. Our results support the notion that CD44 enhances TCR signaling strength by delivering LCK, which is required to support TH17 development.

In dieser Arbeit wurde die Expression von XCR1 in B6XCR1lacZ+/+ Reporter Mäusen charakterisiert, die β-Galaktosidase unter der Kontrolle des XCR1-Promotors exprimieren. In Gewebeschnitten konnten wir zeigen, dass eine starke XCR1-Expression nur in lymphatischen Organen wie Milz, Lymphknoten und Thymus nachweisbar ist. In der Milz fanden sich XCR1+ Zellen vor allem in der Marginal Zone, aber auch in der roten Pulpa und der T-Zell-Zone. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass XCR1 in der Milz ausschließlich von dendritischen Zellen DZ exprimiert wird, hauptsächlich von der CD8+DZ Subpopulation aber auch von einer Minderheit der CD4−CD8−DZ. In vivo migrierten diese XCR1+ Zellen nach Applikation von chemotaktischen oder inflammatorischen Substanzen: Die Injektion sowohl einer ATAC-sezernierenden Zelllinie als auch von LPS lösten nach 3-9 h eine Translokation der XCR1+Zellen in die T-Zell-Zone der Milz aus. Untersuchungen der Phagozytose-Aktivität ergaben, dass nur XCR1+CD8+DZ, aber keine anderen DZ Subpopulationen, injizierte allogene Zellen aufnahmen, und dass eine Transfektion dieser Zellen mit ATAC diese Phagozytose signifikant verstärkte. Daher konnten wir allogene Zellen, die intrazellulär Ovalbumin OVA exprimierten, für die selektive Applikation von Antigen auf XCR1+DZ verwenden. Diese selektive Antigen-Applikation induzierte eine starke antigenspezifische zytotoxische Antwort von endogenen T-Zellen, ohne dass es zur Produktion von OVA-spezifischen Antikörpern kam. In Abwesenheit von ATAC war diese endogene zytotoxische Aktivität verringert. Durch adoptivem Transfer und Aktivierung von Wildtyp- oder ATAC-defizienten OVA-spezifischen transgenen CD8+TZellen konnten wir bestätigen, dass ATAC für die Erzeugung einer optimalen zytotoxischen Antwort benötigt wird. Die selektive Applikation von Antigen auf CD8+DZ stellt daher eine vielversprechende Strategie dar, um optimierte Vakzinierungs-Ansätze für die Auslösung einer zytotoxischen Immunantwort zu entwickeln / The G protein-coupled receptor XCR1 has been described as the sole receptor for the chemokine ATAC. As contradictory data were published on the expression pattern of XCR1, its role in the immune system has not yet been defined. In this work, expression of XCR1 was characterized in B6.XCR1 lacZ+/+ reporter mice which express β galactosidase under the control of the XCR1 promoter. In tissue sections, strong expression of XCR1 was only detected in lymphoid organs like spleen, lymph nodes and thymus. In the spleen, XCR1+ cells were mainly found in the marginal zones, but also in the red pulp and the T cell zones. Flow cytometric analysis demonstrated exclusive expression of XCR1 on DC, mainly on the CD8+ DC subset, but also on a minority of CD4− CD8− DC. In vivo, these XCR1+ cells migrated in response to chemotactic or inflammatory stimuli: application of either an ATAC-expressing cell line or LPS induced within 3 9 h the translocation of XCR1+ cells to the T cell area of the spleen. When tested for phagocytic capacity, XCR1+ CD8+ DC, but not other DC subsets, specifically took up injected allogeneic cells, and transfection of these cells with ATAC significantly enhanced their endocytosis by XCR1+ CD8+ DC. Thus, we could employ allogeneic cells expressing OVA intracellularly to target antigen selectively to XCR1+ DC. This antigen targeting induced a strong antigen-specific cytotoxic response by endogenous T cells without a generation of OVA-specific antibodies. In the absence of ATAC, the endogenous cytotoxic activity was markedly diminished. Adoptive transfer and activation of wild type or ATAC-deficient OVA-specific CD8+ transgenic T cells confirmed that ATAC is required for the generation of an optimal cytotoxic response. Targeting of antigen to CD8+ DC via XCR1 may thus be a promising strategy for the development of new vaccination approaches aimed at optimizing the induction of cytotoxic T cells.

Ein wichtiges Merkmal der normalen Schwangerschaft ist die Toleranz des mütterlichen Immunsystems gegenüber den fremden fetalen Antigenen. Regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) steigen während der frühen Schwangerschaft an und leisten einen entscheidenden Beitrag zur fetalen Toleranz. Allerdings sind die genauen Mechanismen ihres Anstieges und ihrer Wirkungsweise noch weitgehend ungeklärt. Erste Untersuchungen zeigten, dass die Anzahl an Treg-Zellen in der empfänglichen Phase des Estruszyklus in der Maus am höchsten war. Es kann vermutet werden, dass die erhöhte Anzahl an Treg-Zellen zum Zeitpunkt der Insemination eine frühe Erkennung von väterlichen Antigenen begünstigt und somit zur Vorbereitung des mütterlichen Immunsystems auf die Implantation des Embryos beiträgt. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Alloantigene im Ejakulat den frühen Anstieg der Treg-Zellen in der Schwangerschaft bedingen und dass das in der Samenblasenflüssigkeit enthaltene Zytokin TGF-beta die Expansion der Treg-Zellen unterstützt. Diese Ergebnisse befürworten eine Alloantigen-vermittelte Expansion der Treg-Zellen während der frühen Schwangerschaft, die darüber hinaus durch TGF-beta begünstigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ebenfalls belegt werden, dass das Schwangerschaftshormon hCG einen entscheidenden Einfluss auf die Treg-Zellen im Verlauf der Schwangerschaft ausübt. Untersuchungen unter Verwendung von menschlichem Probenmaterial konnten deutlich zeigen, dass hCG die Migration von Treg-Zellen zu Trophoblasten vermittelt und zur Konvertierung von konventionellen T-Zellen in Treg-Zellen beiträgt. Darüber hinaus konnten Versuche im Mausabortmodell zeigen, dass die Applikation von hCG die Expansion und Funktion der Treg-Zellen entscheidend beeinflusst, wodurch das Auftreten von Aborten in Abortweibchen verhindert werden konnte. HCG vermittelt demnach die Generierung, Migration und Funktion der Treg-Zellen und trägt entscheidend zum erfolgreichen Verlauf der Schwangerschaft bei. / Normal pregnancy is characterized by the generation of maternal immune tolerance towards the foreign fetal antigens. Regulatory T cells (Treg cells) have been shown to increase in number during early pregnancy stages and to be essential for the establishment of fetal tolerance. However, the mechanisms and factors supporting their increase and function are not well defined. First investigations showed that Treg cells accumulated in the sexually receptive phase of the murine estrous cycle. Thus, it can be assumed that the accumulation of Treg cells around the time of insemination favours early recognition of paternal antigens and thereby prepares the maternal immune system for the implantation of the blastocyst into the maternal endometrium. Experiments investigating the increase of Treg cells during early pregnancy suggest that alloantigens present in the ejaculate mediated early Treg cell augmentation. Moreover TGF-beta, which represents a major component in the seminal fluid, provoked the proliferation of Treg cells. These results suggest that the early expansion of Treg cells is alloantigen-mediated and that seminal fluid-derived TGF-beta is involved in this expansion. Additionally it has been shown that the pregnancy hormone human Chorionic Gonadotropin (hCG) has an important impact on Treg cells during pregnancy. By using human samples it has been proven that hCG mediates the migration of Treg cells to trophoblast cells and supports the conversion of naïve T cells into Treg cells directly at the fetal-maternal interface. In mice, the application of hCG resulted in an increase in the number and function of Treg cells and thereby prevented abortion in a mouse abortion-prone model. Thus, hCG mediates the generation, migration and function of Treg cells and contributes to a successful pregnancy outcome.

Die Ätiologie und Pathogenese autoimmuner Lebererkrankungen sind nur unvollständig verstanden. Bei der primär sklerosierenden Cholangitis bzw. bei der autoimmunen Hepatitis sind Cholangiozyten der größeren Gallengänge und Hepatozyten die Zielzellen der Autoimmunreaktion in der Leber. Mausmodelle sind zur Analyse initialer pathophysiologischer Prozesse notwendig und tragen zum besseren Verständnis der immunologischen Vorgänge in der Leber bei. Mit Hilfe transgener Mauslinien, die das Modellantigen Ovalbumin gewebespezifisch in den Cholangiozyten (ASBT-OVA) oder in den Hepatozyten (TF-OVA) exprimieren, sowie adoptiven Transfers antigenspezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen wurden Untersuchungen zur Antigenpräsentation, T-Zell-Aktivierung und Toleranzinduktion in der Leber durchgeführt. Die Expression von Ovalbumin in Cholangiozyten resultierte in einer Aktivierung der CD8+ T-Zellen in der Leber und den Lymphknoten. Im Gegensatz dazu ignorierten naive CD4+ T-Zellen das Antigen und wurden nicht aktiviert. Die Expression von Ovalbumin in Hepatozyten resultierte in einer vollständigen Aktivierung der CD8+ T-Zellen zu Effektorzellen über Kreuzpräsentation durch professionelle antigenpräsentierende Zellen (APZ) in der Leber. Diese Aktivierung war transient und selbst-limitiert. Die Induktion von CD4+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen trug entscheidend zur Limitierung der induzierten Autoimmunität und Kontrolle der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen bei. Naive CD4+ T-Zellen benötigten die Aktivierung durch APZ in einem anderen Organ, bevor sie in die Leber relokalisierten und wiesen keinen Effektorphänotyp auf. Beide Modelle repräsentieren nicht die chronische Eigenschaft humaner autoimmuner Lebererkrankungen, ermöglichen jedoch Untersuchungen zum besseren Verständnis der Rolle verschiedener T-Zell-Populationen in der Pathogenese autoimmuner Lebererkrankungen sowie der Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen durch hepatisches Antigen. / Aetiology and pathogenesis of autoimmune liver diseases are still incompletely understood. Cholangiocytes of the larger bile ducts and hepatocytes are the target structures of autoimmune reactions in the liver in primary sclerosing cholangitis and autoimmune hepatitis, respectively. Mouse models are necessary to analyse initial pathophysiological processes and contribute to a better understanding of immunological processes in the liver. With the help of transgenic mouse strains, in which the model antigen ovalbumin is expressed specifically in the cholangiocytes (ASBT-OVA) or in hepatocytes (TF-OVA), as well as the adoptive transfer of antigen specific CD4+ and CD8+ T cells, antigen presentation, T cell activation and tolerance induction in the liver, were analyzed. Expression of ovalbumin in cholangiocytes resulted in activation of CD8+ T cells in the liver and lymph nodes. In contrary, naïve antigen specific CD4+ T cells ignored the antigen expressed by cholangiocytes and were not activated. Expression of ovalbumin in hepatocytes resulted in complete activation of CD8+ T cells to become effector cells by crosspresentation depending on professional antigen presenting cells (APCs) in the liver. This activation was transient and self-limiting. Induction of CD4+Foxp3+ regulatory T cells played a crucial role in limiting autoimmunity and controlling the expansion of antigen specific CD8+ T cells in the liver. By contrast, naïve CD4+ T cells required activation by professional APCs in a different organ before relocating to the liver and did not display an effector phenotype. Both models do not represent the chronic characteristics of human autoimmune liver diseases, but help to gain a better understanding regarding the role of specific T cell populations in the pathogenesis of autoimmune liver diseases, as well as regarding antigen presentation and activation of T cells by hepatic antigen.

Während der letzten 10 Jahre, wurden viele neue immunsuppremierende Medikamente für die Verbesserung des Kurzzeit-Transplantationsergebnisses entwickelt (Halbwertzeit bzw. Abstoßung einer Niere nach ca. 10-12 Jahren). Das heutige therapeutische Ziel besteht auf der einen Seite aus der Minimierung der Kosten bzw. der Minimierung der Nebenwirkungen verursacht durch die Immunsuppressiva und auf der anderen Seite der Verbesserung des Langzeit-Überleben eines Transplantates. Um eine dosis-abhängige Zerstörung des Transplantates durch die Immunsuppressiva zu vermeiden, bedarf es der spezifischen Entwicklung von zusätzlichen Toleranzprotokollen. Ein Top-Kandidat für die Toleranzinduktion in Transplantationen stellen die CD4+CD25high regulatorischen T Zellen dar. Da humane regulatorische T Zellen jedoch nur 1-2 % der peripheren CD4+ T Zellen repräsentieren, ist es nicht möglich ausreichende Zellmengen auf zu reinigen. Dazu ist die Etablierung adäquater Protokolle für die Isolation und ex vivo Expansion von CD4+CD25high Treg’s notwendig. In unserem System ist es uns möglich die CD4+CD25high zellen mit einer sehr hohen Reinheit zu isolieren ( ca. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Danach werden die isolierten Treg’s mit verschiedenen Protokollen, wie der Expansion mit CD2-,CD3- und CD28 Expansionbeads oder allogenen Feederzellen, expandiert. Das suppressive Potential der expandierten CD4+CD25+ Treg’s wurde in drei funktionellen Assays, einem CFSE-basierenden Proliferationsassay, einem Cytokin-Bead-Array und einem Elispot bestimmt. Basierend auf den genannten Methoden wurde das Proliferationspotential allogen stimulierter Responder T Zellen, die IFNg Produktion und das Th1/TH2 Cytokinprofil in einer gemischten Lymphozytenreaktion mit unterschiedlichen Mengen der expandierten Treg’s untersucht Ein weiterer Aspekt dieses Projektes ist die Expansion isolierter regulatorischer T Zellen mit zusätzlichem Rapamycin. Das immunsuppremierende Medikament Rapamycin blockiert die Il2-abhängige T Zellproliferation durch die Inhibition von mTOR und induziert die Expansion regulatorischer T Zellen. / During the last decade, a broad set of immunosuppressive drugs has been developed which improve short-term transplant results (1yr survival, acute graft rejection), but not long-term results (graft half life, e.g. kidney rejection after approx. 10-12 years). In this regard, the therapeutic aim is to minimise costs and long-term side effects caused by immunosuppressive drugs on the one hand, and on the other to considerably improve the long term survival of transplanted patients. To avoid dose-dependent damage of the transplant by immunosuppressive drugs, a specific development of additional tolerance protocols is mandatory. One top candidate for the tolerance induction in transplantation is the population of CD4+CD25high regulatory T cells (Treg’s). Because Tregs constitute 1-2% of peripheral CD4+ T cells in human, it may not be possible to purify sufficient cells ex vivo. Therefore it is necessary to establish appropriate protocols for isolation and expansion of CD4+CD25high Treg’s. In our system we are able to isolate CD4+CD25high cells with a very high purity (approx. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Afterwards we expand the isolated Treg’s by different expansion protocolls such as expansion with CD3-, CD2- and CD28-expansionsbeads as well as allogeneic feedercells. The suppressive potential of the expanded CD4+CD25+ Treg’s was determined by three different functional assays, a CFSE-based proliferationassay, a Cytokine-Bead-Array, and an IFNGamma-Elispot. Based on mentioned methods, the proliferative potential of allogenic stimulated responder T cells, IFNGamma production and Th1/Th2 cytokine profile, as well as the IFNGamma producing T-cells in a mixed lymphocyte reaction with different amounts of the expanded regulatory T cells were tested. Another aspect of our project is the expansion of the isolated regulatory T cells with additional rapamycin. The immunosuppressive drug rapamycin is a powerful pharmacological agent which blocks IL2-dependent T cell proliferation by accumulation with mTOR and induces expansion of regulatory T cells.

ZTLs vermitteln die Eliminierung von infizierten und entarteten Zellen durch Apoptose. Neuste Erkenntnisse unserer Gruppe haben gezeigt, dass eine Subpopulation der CD8+ T-Zellen, anstelle der zytotoxischen Marker das Oberflächenmolekül CD40L exprimiert. Die Expression von CD40L ist bislang als Schlüsselmolekül für die CD4+ T-Zell vermittelte Hilfe bekannt, welche durch Bindung an den CD40 Rezeptor auf anderen Immunzellen induziert wird. Das von den CD4+ T–Zellen ausgehende CD40L Signal ist besonders für die T-Zell abhängige B-Zell Aktivierung und die Bildung von Keimzentren essentiell, in denen B-Zellen heranreifen und hochaffine Antikörper produzieren um den Organismus vor eindringenden Erregern zu schützen. Aufgrund der CD40L-assoziierten Helferfunktion sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welche Auswirkungen die Interaktion von CD8+CD40L+ T-Zellen mit B Zellen hat. In in vitro Studien konnte gezeigt werden, dass 50% der antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen nach Aktivierung durch B-Zellen CD40L hochregulieren. Sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene induzierten CD8+CD40L+ T-Zellen einen B-Zell Phänotyp, der stark dem von CD4+ T-Zellen stimulierten B-Zellen ähnelte. In Infektionsversuchen mit dem B-Zell-trophen Virus MHV-68 konnte gezeigt werden, dass transgene Mäuse mit CD40L defizienten CD8+ T-Zellen im Vergleich zu Kontrolltieren eine signifikante Reduktion der Keimzentrums-B-Zellen in den Lymphknoten der oberen Halsregion aufweisen. Eine genauere Betrachtung des B-Zell Repertoires von IgG Gedächtniszellen ergab jedoch, dass die Sequenzen der IGHJ3 Genfamilie bevorzugt für die Modifikation der CDR3 Region in Mäusen mit CD40L defizienten CD8+ T-Zellen verwendet wird, die eine entscheidende Rolle bei der Antigenerkennung spielt. Zusammengefasst kann mit dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass CD8+CD40L+ T-Zellen Helferfunktionen durch Unterstützung der B-Zell Aktivierung und Bildung von Keimzentren übernehmen können. / CTLs are important for the elimination of infected and degenerated cells by inducing apoptosis of the target cells. Recently our group identified a sub-population of CD8+ T cells expressing CD40L instead of common CTL markers. To that date, transient CD40L expression on T cells has been only described as a function of activated CD4+ T cells, which displays this key molecule for CD4+ T cell mediated help by binding to the CD40 receptor on other immune cells. Particularly, CD40L signaling provided by CD4+ T cells is indispensable for T cell dependent B cell activation and GC responses, which generate B cells secreting high affinity antibodies that protect the host from invading pathogens. Due to its associated helper functions, this thesis aimed to dissect whether CD40L positive CD8+ T cells are restricted to cytotoxic killing or if this sub-population possesses similar properties as CD4+ T cells when interacting with B cells. In vitro co-culture experiments showed that 50% of murine antigen specific CD8+ T cells up-regulated CD40L upon activation by antigen presenting B cells. When compared to CD40L deficient CD8+ T cells, the interaction of CD8+ CD40L+ T cells induced remarkable changes in B cells on the RNA and protein level and triggered a B cell phenotype resembling that of B cells primed by CD4+ T cells. By the infection of mice with the B cell trophic virus MHV-68, it was found that E8IcrexCD40Lflox transgenic mice lacking CD40L only on matured CD8+ T cells, exhibited a significant decrease of GC B cells in superficial cervical lymph nodes at the acute state of infection compared to WT mice. A closer look into the memory B cell repertoire revealed a preferred usage of the murine IGHJ3 gene family that modifies the CDR3 and thus the recognition groove of the B cell antibody in E8IcrexCD40Lflox mice. In summary, this work provides sufficient evidence that CD8+ CD40L+ T cells adopt helper-like functions by supporting B cell activation and subsequent GC formation.

Die Infektion mit Schistosoma mansoni resultiert in einer Th2-Immunantwort mit Eosinophilie und erhöhtem IgE-Titer, wobei der wasserlösliche Extrakt der S. mansoni Eier (SEA) ausreicht um diese Reaktion auszulösen. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass sich IL-4-produzierende CD4+ T-Lymphozyten in Zellkulturen mit SEA-konditionierten Dendritischen Zellen (DCs) trotz gleichzeitig vorkommenden IFN-gamma entwickeln und SEA die Expression von Faktoren in DCs, die üblicherweise mit einer Th1-Antwort einhergehen, auf Transkriptions- und Proteinebene selektiv hemmt. Um den Faktor aus S. mansoni Eiern zu isolieren, der zur Expression von IL-4 in CD4+ Zellen und zur Inhibition von IL-12 in DCs führt, wurde eine Gelfiltrationschromatographie der exkretorisch/sekretorischen Ei-antigene (ES) durchgeführt und die Fraktionen in vitro getestet. Darin wurde gezeigt, dass Fraktionen mit einer Proteinbande von 30 kD die Expression von IL-4 in CD4+ Zellen induzieren. Dieses ES-Protein wurde durch N-terminale Sequenzierung als hepatotoxische Ribonuclease Omega-1 identifiziert, welches ebenfalls die Expression von IL-12 in DCs inhibiert und die Produktion von IL-4 in CD4+ Zellen bei einer 10-fach geringeren Proteinkonzentration als mit dem Kontrollansatz SEA induziert. Zudem sollte untersucht werden, inwieweit Toll-like Rezeptoren in der Generierung einer Th2 Antwort gegen schistosomale Antigene involviert sind. Dazu wurden TLR2-, TLR3-, TLR4- und MyD88-defiziente Mäuse mit S. mansoni infiziert und immunologische und pathologische Daten in der akuten und chronischen Phase der Infektion analysiert. Demnach sind TLR2, TLR3, TLR4 und MyD88-abhängige Signaltransduktionswege nicht für eine-Th2 Antwort notwendig, jedoch ist letzteres Molekül in der Ausprägung der typischen Leberfibrose involviert. / Infection with Schistosoma mansoni results in the induction of a Th2 immune response, eosinophilia and increased levels of IgE. The water-soluble extract of S. mansoni eggs (SEA) is sufficient to promote TH2 polarization in a dendritic cell-dependent manner. In this thesis, it was demonstrated that IL-4+ CD4+ cells emerge in cultures with SEA-conditioned dendritic cells (DCs) in the presence of IFN-gamma and that SEA inhibits selectively the expression of IL-12 and co-stimulatory markers in DCs on the transcriptional and protein level. To identify the putative protein in S. mansoni eggs mediating a Th2 induction, a gel filtration chromatography of the excretory/secretory egg antigens (ES) was conducted and the fractions tested in vitro. Fractions containing a single band of 30 kD were sufficient to promote IL-4 induction in naïve CD4+ cells. Using N-terminal sequencing this ES-protein was identified as the hepatotoxic S. mansoni ribonuclease omega-1 which displayed both biological functions observed with SEA: inhibition of IL-12 in LPS-stimulated DCs and induction of IL-4+ CD4 cells at a 10 fold lower protein concentration than SEA. In order to understand, if the innate immune receptors TLR2, TLR3, TLR4 or the TLR adaptor molecule MyD88 are involved in the generation of the Th2 response against schistosomal antigens, the respective knock out mice were infected and immunological and pathological parameters were analyzed during acute and chronic phase of infection. This study showed that during S. mansoni infection TLR2, TLR3, TLR4 and TLR activation through the MyD88-dependent pathway are neither required for the induction (priming and polarization) nor for the down-regulation of Th2 responses, however, the fibrotic response against S. mansoni eggs was significantly reduced in MyD88-deficient mice suggesting a detrimental role of this pathway in liver pathology.

Bei der Kreuzpräsentation durch dendritische Zellen (DC) werden extrazelluläre Antigene in den MHC I-Präsentationsweg eingeschleust und CD8+ T-Zellen präsentiert. Bisher werden die kreuzpräsentierenden DC der Maus durch die Expression der Moleküle CD8 in der Milz und CD103 in der Peripherie abgegrenzt; der kreuzpräsentierende Subtyp primärer humaner DC war vor Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Innerhalb dieser Arbeit konnte erstmals eine durchflusszytometrische Färbung von XCR1 auf der Oberfläche von Zellen etabliert werden, wodurch demonstriert wurde, dass XCR1 auf 83 % der CD8+ und 4 % der CD8-CD4- DC der Milz exprimiert wird. Der Phänotyp der XCR1+ DC der Milz unterschied sich deutlich von dem der XCR1- DC. In Milzen von Batf3- und Irf 8-defizienten Mäusen konnten keine XCR1+ DC detektiert werden. Zudem wurde nach Applikation des Wachstumsfaktors Flt3 Ligand in C57BL/6 Mäusen der Anteil der XCR1+ DC signifikant erhöht. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Entwicklung der XCR1+ DC von diesen Faktoren abhängig ist. Funktionell waren die XCR1+ DC wesentlich effektiver in der Kreuzpräsentation von löslichen und zellassoziierten Antigenen. Damit kann XCR1 als Oberflächenmarker verwendet werden, um murine kreuzpräsentierende DC zu kennzeichnen. Um herauszufinden, ob XCR1+ DC auch im Menschen existieren, wurde die Expression von XCR1 auf Zellen des humanen peripheren Blutes anhand von qPCR und Durchflusszytometrie untersucht. Ausschließlich CD141+ DC exprimierten XCR1-mRNA und -Protein. Durch die Etablierung einer effektiven Sortierungsstrategie zur Isolierung aller DC-Subtypen konnte erstmals gezeigt werden, dass die CD141+ DC den einzigen effektiven kreuzpräsentierenden DC-Subtyp des Blutes darstellen. XCR1 ist somit auch im humanen System spezifisch auf kreuzpräsentierenden DC exprimiert. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass es sich bei den XCR1+ DC der Maus und des Menschen um funktionelle Homologe handelt. / Cross-presentation by dendritic cells (DC) is a process, in which extracellular antigen is shunted into the MHC I presentation pathway and presented to CD8+ T cells. So far, murine cross-presenting DC were defined by the expression of the molecules CD8 in the spleen and CD103 in the periphery. However, cross-presenting DC have not been characterized in humans. In this work, a flow cytometric staining of XCR1 was established for the first time which allowed the detection of XCR1 on 83 % of CD8+ DC and 4 % of CD8-CD4- DC of the spleen. The phenotype of splenic XCR1+ DC differed markedly from XCR1- DC. Both, Batf3- and Irf 8-deficient mouse strains showed an absence of splenic XCR1+ DC. Furthermore, the frequency of XCR1+ DC was significantly increased in spleens of C57BL/6 mice treated with Flt3 ligand. These results demonstrate that the development of XCR1+ DC is dependent of these factors. To test the ability to cross-present antigen, all splenic conventional DC were sorted according to their expression of CD8 and XCR1. XCR1+ DC were most efficient in cross-presenting soluble and cell-associated antigen to CD8+ T cells. Therefore, XCR1 is the first surface marker that can be used to delineate murine cross-presenting DC and the development of this distinct DC population is strongly dependent on Batf3, IRF-8 and Flt3 ligand. To explore if XCR1+ DC also exist in men, cell populations of human peripheral blood were analysed for their XCR1-expression using qPCR and flow cytometric staining. Only CD141+ DC express XCR1 mRNA and protein. An efficient sorting strategy for the isolation of all DC subsets was established to compare their ability to cross-present soluble and cell-associated antigen. CD141+ DC were the only effective cross-presenting DC subtype. Therefore, XCR1 is also in the human a receptor expressed specifically on cross-presenting DC. In summary, the data show that the XCR1+ DC of mouse and men are functional homologues.