Die zentrale Rolle der B-Zellen in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen hat in den letzten Jahren zu unterschiedlichen therapeutischen Ansätzen geführt, B-Zellen direkt oder indirekt zu targetieren. Ein Beispiel hierfür stellt der monoklonale anti-CD20 Antikörper Rituximab dar. Derzeit ist wenig über das Regenerationsverhalten von B-Zellen nach Therapie mit Rituximab bekannt. Daher untersuchten wir die frühe Regnerationsphase und die Veränderungen des B-Zellrepertoirs. Am Beispiel der VH4 Familie der Immunglobulin schweren Ketten analysierten wir die Modulation des Immunglobulinrezeptor Repertoires durch die passagere B-Zelldepletion. Insgesamt wurden bei 5 Patienten 3 Zeitpunkte analysiert: vor Therapie, in der frühen Regenerationsphase (ERP- early regeneration period, mit einem B-Zellanteil > 1% im peripheren Blut) und in der späten Regenerationsphase (LRP- late regeneration period, 2-3 Monate nach der frühen Regenerationsphase). Bei 3 Patienten (A-C) wurden die Ig-VH4 Gene aus genomischer DNA amplifiziert und zu o.g. Zeitpunkten analysiert. Bei weiteren 2 Patienten (D und E) erfolgte die Analyse der Ig Gene in einzelnen B-Zellen mittels Einzelzellsortierung und Einzelzell RT-PCR. Die B-Zellregeneration nach Therapie mit Rituximab zeigte ein charakteristisches Regenerationsmuster mit einer Dominanz von unreifen CD10+ B-Zellen und CD38hi Plasmazellen während der frühen Phase der B-Zellrekonstitution. Im weiteren Verlauf kam es zu einer Abnahme dieser Zellen und einem Anstieg von naiven B-Zellen. Auf der molekularen Ebene zeigte sich vor und nach B-Zelldepletion eine unterschiedliche Nutzung der Ig-VH4 Gene. Mini Gene wie VH4-34 und VH4-39, die in Verbindung mit Autoimmunität stehen, waren vor Einleitung der Therapie überexprimiert. Durch die Behandlung mit Rituximab kam es zu einer Veränderung des Repertoires der regenerierenden B-Zellen mit einer reduzierten Benutzung der VH4-39 Gene im B-Zellpool. Tief greifende Veränderungen fanden sich im regenerierenden Repertoire, mit einem relativen Anstieg von stark mutierten (>=9 Mutationen / Ig Sequenz) B-Zellen.. Die Immunphänotypisierung zeigte, dass diese hochmutierten B-Zellen den Ig-klassengeswitchten Gedächtnis B-Zellkompartiment, insbesondere den Plasmazellen zughörig sind. Um diese Hypothese zu untermauern, erfolgte bei 2 Patienten eine Einzelzellsortierung dieser Plasmazellen während der frühen Regenerationsphase, welche einen vergleichbaren Mutationsstatus zeigte. Da Plasmazellen kein CD20 Molekül exprimieren, werden sie durch eine Therapie mit Rituximab nicht direkt eliminiert. Allerdings zirkulieren sie nicht im peripheren Blut während der Phase der B-Zelldepletion. Während der frühen Regenerationsphase (ERP) lassen sie sich in der Peripherie erneut nachweisen. Es wurde deshalb untersucht ob auch Plasmazellen durch die Therapie moduliert werden, obwohl sie nicht direkt durch Rituximab targetiert werden. In diesem Zusammenhang erfolgte eine detaillierte Analyse des Mutationsmusters der Plasmazellen vor Therapie und während der frühen Regenerationsphase. Die Analyse der Mutationshäufigkeit in RGYW/WRCY Hotspot Motive (R=purine, Y=pyrimidine, W=A/T) erlaubt Abschätzung in wieweit die somatische Hypermutation der B-Zellen durch T-Zell abhängige Differenzierung erfolgte. Die Plasmazellen vor Therapie zeigten einem verminderten Targeting der RGYW/WRCY Motive. Im Gegensatz hierzu zeigte sich in den rezirkulierenden Plasmazellen während der frühen Regenerationsphase ein zunehmendes Targeting der RGYW/WRCY Motive. Dies spricht für einen Repertoire Shift zu mehr T-Zellabhängigen B-Zell Mutation. Ein Zusatand, wie er bei Gesunden beobachtet wird. Um die Hypothese der Rituximab-induzierten Plasmazell Modulation zu stützen wurde die R/S- Ratio (replacement to silent mutations ratio) der hypervariablen Regionen (CDRs) der Plasmazell Ig Sequenzen bestimmt. In unserer Studie war die mittlere R/S Ratio der CDRs der Plasmazellen vor Therapie entsprechend relativ niedrig (1.87). Interessanterweise kam es in der frühen und späten Regenerationsphase zu einer signifikant erhöhten R/S Ration in den rezirkulierenden Plasmazellen mit Werten von 2.67 bzw. 3.60. Die verminderte R/S Ratio in den CDRs der Plasmazellen kann als Entwicklung des Ig-Repertoires durch positive Antigenselektion interpretiert werden und weist damit eine Therapie induzierte Veränderung auf, die dem entspricht wie man sie bei Gesunden findet. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass die passagere B-Zelldepletion mit Rituximab zu einer Modulation des Plasmalzellkompartimentes führt, welches nicht direkt durch die Therapie targetiert wird. Die Modulation der Plasmazellen bei der RA kann eventuell auch als möglicher Biomarker entwickelt werden, um ein Ansprechen auf die Therapie vorherzusagen. Dies muss im Weiteren untersucht werden, um tiefer greifende Einblicke in Prozesse zu erlangen, die durch zukünftige Therapien beeinflussbar werden. / B cells play diverse roles in the immunopathogensis of autoimmune diseases several approaches targeting B cell directly or indirectly are in clinical practice in the treatment of autoimmunity. In this regard, temporal B cell depletion by rituximab (anti CD20 antibody) is being appreciated and gaining more importance in recent years. To date, little is known about the regeneration profile of B cells following B cell depletion. We wanted to investigate the early replenishing B cells and examine the dynamic changes in the repertoire. we studied the immunoglobulin receptor (IgR) modulation of Ig-VH4 genes as representative of the heavy chain family. Five patients were included in the study and therapy induced alterations were assessed. Three time points namely before therapy, early regeneration phase (ERP- the early time point during regeneration where just above 1% B cells were found in the peripheral lymphocyte pool) and later regeneration phase (LRP- which commenced 2-3 months following ERP) were chosen. In three patients (A-C), Ig-VH4 genes were amplified from total genomic DNA during the above-mentioned all time points and in another two patients (D and E), Ig genes during ERP were studied by single cell amplification technique. Firstly, B cell regeneration followed the characteristic regeneration pattern as reported by several groups, with a predominant circulation of CD38hi expressing plasma cells and immature B cells in the ERP. During LRP, the proportion of these cells reduced relatively and the levels of naïve B cells rose gradually. On a molecular level, Ig-VH4 variable gene usage prior and post B cell depletion was determined and it was noticed that a diverse set of Ig-VH4 genes were employed in the repertoire before and after therapy. Mini gene segments such as VH4-34 and VH-4-39, which were reported to be connected with autoimmunity, were over expressed in the B cell repertoire before therapy. Profound changes were noticed in the early reemerging repertoire with a relatively increased population of intensely mutated B cells. These B cells acquired >=9 mutations in the Ig genes. Immunophenotyping with specific surface markers revealed that these highly mutated B cells evolve from the isotype-switched memory compartment especially the plasma cells. To support the hypothesis that the highly mutated B cells observed during ERP were plasma cells we carried out single cell amplification of individual plasma cells in another two patients during ERP and compared the mutational load, which remained similar. Actually plasma cells do not express CD20 on their surface and are not eliminated by rituximab therapy. However they were not observed in the peripheral blood following B cell depletion. The earliest time point when plasma cells are found again in peripheral circulation is the early recovery period (ERP). Therefore, it was intriguing to ascertain if the plasma cells were also modulated by rituximab therapy although they were not directly targeted by the therapy. We investigated if there is a therapy mediated mutational modulation of the plasma cells though these are not directly targeted by the therapy. We examined the confinement of mutations to the pre-defined RGYW/WRCY hotspot motifs (R=purine, Y=pyrimidine, W=A/T) in the plasma cells, which provides information on the involvement of T cells in B cell somatic hypermutation (SHM). Plasma cells before rituximab manifested the characteristics of active disease, which was revealed by restricted mutational targeting to the RGYW/WRCY motifs. The reemerging plasma cells during ERP had an increased targeting of the RGYW/WRCY motifs which indicated for a more pronounced T cell mediated B cell mutations which is the scenario observed in the healthy subjects. To further support the hypothesis of rituximab-mediated plasma cell modulation, we delineated the replacement to silent mutations ratio (R/S) in the hypervariable regions (CDRs) of the plasma cell Ig sequences. Within our study, the mean R/S ratio in the plasma cell CDRs of the patient group was relatively low (1.87) before rituximab treatment and interestingly this ratio increased significantly in the recirculating plasma cells to values of 2.67 and 3.60 in ERP and LRP status respectively. The increase in R/S ratios in reemerging plasma cells can be interpreted as a shaping of the Ig-repertoire by positive antigen selection as seen in healthy individuals. To conclude, our study demonstrates temporal B cell depletion by rituximab therapy seems to modulate also the plasma cell compartment, which is not directly targeted by the therapy. Modulation of plasma cells in RA could be also used as a potential biomarker in studying the effective response in RA treatment. This needs to be further explored to gain deeper insights into the underlying processes, which may be influenced by future therapies.

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses verschiedener Therapieregime bei Patienten und Patientinnen mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom auf B-Zell-, T-Zell-, NK-Zellsubpopulationen. Die routinehafte Kontrolle des Immunstatus ist zum aktuellen Zeitpunkt noch nicht in den Therapiealgorithmus integriert, obwohl immunmodulatorische Therapien fester Bestandteil der Therapieoptionen bei Patientinnen und Patienten mit NSCLC sind. In einer prospektiven Beobachtungsstudie wurde bei den Patientinnen und Patienten vor Therapieinitiierung und vor jeder Gabe der jeweiligen anti-tumorösen Therapie eine Bestimmung des Immunstatus mittels FACS-Analyse durchgeführt. Hierzu wurde das „eight color immunphenotyping of T-, B-, and NK-cell subpopulations“ Panel von A. Boldt et. al hinzugezogen, welches ursprünglich für die Charakterisierung von chronischen Immundefekten entwickelt wurde. Unter der Therapie mit Immuntherapie, Immunchemotherapie und Antikörpertherapie gegen VEGF konnte eine signifikante Erhöhung der absoluten Anzahl an transitorischer B-Zellen beobachtet werden. Eine relative Erhöhung der transitorischen B-Zellen zeigte sich unter der Therapie mit Immuntherapie. Zum einen zeigte sich ein absoluter und prozentualer Anstieg der B-Zellen nach adjuvanter Chemotherapie. Wobei gleichzeitig die absolute Anzahl der B-Gedächtniszellen und nicht-klassengewechselten B-Zellen unter adjuvanter Chemotherapie verringert waren. Unter Chemotherapie konnte ein Abfall der absoluten und prozentualen Anzahl der transitorischen B-Zellen registriert werden. Bezüglich der T-Zellsubpopulationen konnte ein signifikanter Anstieg der aktivierten zytotoxischen T-Zellen (CD8/CD38), der aktivierten zytotoxischen T-Zellen (HLA-DR+) und der aktivierten zytotoxischen T-Zellen (HLA-DR+CD38+) unter Immuntherapie und Immunchemotherapie beobachtet werden. Weiterhin zeigte sich ein Trend in den prozentualen Anteil der T-Zellen (CD3+) und zytotoxischen T-Zellen (CD8+), welche sich bei Immuntherapie und Immunchemotherapie erhöht zeigten, allerdings das statistische Signifikanzniveau nicht erreichten (Immuntherapie q=0,057; Immunchemotherapie q=0,080). Einen statistisch signifikanten Einfluss auf T- Zellsubpopulationen konnte bei Chemotherapie, adjuvanter Chemotherapie und Antikörpertherapie gegen VEGF nicht nachgewiesen werden. Bei Betrachtung der NK- Subpopulationen konnte im Rahmen dieser Studie keine statistisch signifikanteVeränderung nachgewiesen werden. Lediglich eine nicht signifikante Erhöhung der prozentualen NK-Zellen II (CD56+CD16-) nach Immuntherapie (q=0,057) und eine nicht signifikante prozentuale Erniedrigung der zytolytisch aktivierten NK-Zellen (CD56+CD16-) unter Immunchemotherapie (q=0,059) konnte beobachtet werden. Zusätzlich zu den Veränderungen der T-Zell-, B-Zell- und NK-Zell-Subpopulationen wurde der Einfluss der verschiedenen Therapieregime auf Monozyten und Granulozyten untersucht. Dabei konnte eine signifikante prozentuale Erhöhung der Monozyten unter Immuntherapie festgestellt werden. Weiterhin zeigte sich unter adjuvanter Chemotherapie ein Anstieg der migrierten Granulozyten, wobei gleichzeitig eine Verringerung der prozentualen Anzahl der aktivierten Granulozyten, sowie eine Reduktion der Chemotaxis der Granulozyten beobachtet werden konnte. Darüber hinaus fanden sich keine statistisch signifikanten Veränderungen auf Granulozyten und Monozyten im Rahmen der Studie. Eine Assoziation des Alters mit den T-Lymphozyten konnte vor Therapieinitiierung festgestellt werden. Eine darüberhinausgehende Veränderung des Immunstatus in Abhängigkeit von Alter und Therapie konnte nicht beobachtet werden. Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass Alter an sich keinen unabhängigen Therapieeinfluss auf Lymphozytensubpopulationen hat.:Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie des Lungenkarzinoms 1.2. Risikofaktoren des NSCLC 1.3. Diagnostik des NSCLC 1.4. Therapieoptionen bei NSCLC 1.4.1. Therapieoptionen bei NSCLC ohne Treibermutation 1.4.2. Therapieoptionen bei NSCLC mit Treibermutation 1.5. Immunsystem und Tumorimmunologie 1.5.1. Angeborene/innate Immunität 1.5.2. Adaptive Immunität 1.5.3. Immunologische Kontrolle von Tumoren 1.5.4. Klinische Erhebung des zellulären Immunstatus und Beeinflussung durch Tumorerkrankungen, insbesondere dem NSCLC 2. Rationale und Zielsetzung zur Durchführung der Studie 3. Publikation 3.1. Publikation: „ The influence of anti-cancer therapies on lymphocyte subpopulations of lung cancer patients “ Anlagen 3.2. Diskussion der Ergebnisse 4. Zusammenfassung der Arbeit . Darstellung des eigenen Beitrags . Lebenslauf Danksagung Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Klassenwechsel (CSR, class switch recombination) bezeichnet eine B-Zellen spezifische, somatische Rekombination. Sie ersetzt den konstanten Abschnitt der immunoglobulin schweren Kette (Igh), wenn die Zelle auf ein Antikörper trifft oder durch in vitro Aktivierung. Dadurch wechseln B-Zellen die exprimierten IgM Antikörpermoleküle zu anderen Isotypen (IgG, IgE oder IgA), welche die selbe Antikörperaffinität besitzen, aber eine andere Effektorfunktion. Dieser Vorgang ist elementar im Aufbau einer effektiven Immunantwort, da Defekte bei der CSR zu erhöhten IgM-Leveln führen und primären Anitkörperdefizit. Diese wurden bereits mit Autoimmunität, Autoinflamations-Syndrome und erhöhte Anfälligkeit für Infektionen und Krebs in Verbindung gebracht. CSR ist ein komplexer, physiologischer, vielgliedriger Prozess, welcher die Bildung und Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch verschiedene molekulare Mechanismen leitet und welcher noch nicht vollständig verstanden ist. Das Ziel dieser Studie war daher die Identifikation neuer CSR-Faktoren und die Charakterisierung ihrer Rolle(n) innerhalb dieser Reaktion. Dafür wurde eine CH12-Lymphoma B-Zelllinie mit einem robusten Funktionsverlust der CSR erstellt. Diese wurden in vitro aktiviert um Antikörperisotypdifferenzierung zu IgA mit hoher Effizienz vorzunehmen. Ein Ergebnis dieser Arbeit ist die Identifikation von ZMYND8 als Notwendig für den CSR. Dieser Faktor bindet und reguliert die Transkription der regulatorischen 3´ Region, welcher ein super-enhancer am 3´ Ende der Igh Region ist, und die Antikörperisotypdifferenzierung reguliert. Davon unabhängig wurde PDAP1 als neuer Faktor für effiziente CSR identifiziert. Abschließend tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zum weiteren Verständniss der Regulierung der Antikörperisotypdifferenzierung sowie der Aktivität von B-Zellen während der Immunantwort. / Class Switch Recombination (CSR) is a B-cell specific somatic recombination reaction that replaces the constant region of the immunoglobulin heavy chain (Igh) locus upon antigen encountering or in vitro cell activation. As a consequence, B cells switch from expressing IgM antibody molecules to another isotype (IgG, IgE or IgA), which harbor the same antigen affinity but different effector function. This process is essential for the establishment of an effective immune response since defects in CSR lead to increased serum IgM levels and primary antibody deficiencies, which are associated with autoimmunity, auto-inflammatory syndromes, increased sensitivity to infections and cancer. CSR is a complex physiological multistep process that involves the formation and repair of double strand breaks through different molecular mechanisms that have not been fully elucidated yet. Therefore, the aim of this study was to identify novel CSR factors, and characterize their role(s) in the reaction. To do so, a robust functional loss of CSR screen was set-up and performed in the CH12 lymphoma B cell line. These cells can be activated in vitro to undergo antibody isotype differentiation to IgA with high efficiency. As a result of this screen, the chromatin reader ZMYND8 was found to be required for CSR. Specifically, this factor binds and modulates the transcriptional activity of the 3’ regulatory region, which is a super-enhancer located at the 3’ end of the Igh locus that controls antibody isotype differentiation. Furthermore, PDAP1 was independently identified as a novel factor necessary for efficient CSR. Conclusively, the results of this thesis contributed to further understand the processes regulating antibody isotype differentiation and B cell activity during an immune response.

Helicobacter pylori ist ein humanpathogenes Bakterium, das den Magen kolonisiert und dadurch eine Immunantwort des Wirts induziert. Statt eine vollständige Eradikation von H. pylori durch die Immunreaktion zu erreichen, kommt es normalerweise zu einer lebenslangen Persistenz des Bakteriums und einer chronischen Infektion. Interessanterweise kommt es infolge einer Infektion zu einer Hochregulation der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), aber die zellulären Quellen und zugrundeliegenden Mechanismen von iNOS sind noch nicht vollständig verstanden. Der iNOS-abhängigen Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) können sowohl antimikrobielle als auch pathologische Eigenschaften zugeschrieben werden. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit iNOS-exprimierende Plasmazellen (PZ) aus der Magenmukosa H. pylori-infizierter Patienten isoliert und phänotypisch, vor allem mittels Durchflusszytometrie und molekularbiologisch hinsichtlich ihres Immunglobulin-Repertoires untersucht. Es wurde erstmals gezeigt, dass mukosale IgA-sezernierende PZ eine der wesentlichen iNOS+ Zelltypen während einer H. pylori-Infektion im Menschen darstellen und zusätzlich wurde ihre intrazelluläre NO-Produktion nachgewiesen. Da iNOS+ PZ in weiteren gastrointestinalen Infektionskrankheiten fehlten, scheint dies kein genereller Phänotyp von PZ der mukosalen Immunabwehr zu sein. Die Analyse der intrazellulären Zytokin-Expression der mukosalen B-Zellpopulationen in H. pylori-Patienten ergab eine Ko-Expression von IFN-γ und TNF-α in iNOS+ memory B-Zellen und eine TNF-α-Expression in iNOS+ PZ, aber nicht in den iNOS− Zellen. Die molekularbiologische Charakterisierung des Immunglobulin-Repertoires von iNOS+ und iNOS− PZ hinsichtlich der VHDJH-Regionen ergab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Isotyp-Verteilungen, der Nutzung der VH- und JH-Segmente, CDRH3-Längen sowie somatischen Mutationen und alle Antikörper zeigten typische Charakteristika einer T-zellabhängigen Affinitätsreifung. / Helicobacter pylori is a human-pathogenic bacterium that colonizes the stomach and thereby initiates host immune response. Instead of a complete eradication of H. pylori by the induced immune response, a lifelong bacterial persistence leads to chronic infections. Interestingly, up-regulation of inducible nitric oxide synthase (iNOS) has been observed in gastric mucosal tissue during the course of H. pylori infection in humans, however the cellular sources and underlying mechanisms of iNOS induction are not fully understood. iNOS-dependent production of nitric oxide (NO) is one of the factors commonly linked to both, anti-microbial immunity and pathology. Therefore, in this thesis iNOS-expressing plasma cells (PCs) in the stomach mucosa of H. pylori-infected patients were isolated and phenotypically analyzed by flow cytometry, as well as screened using molecular techniques regarding their immunoglobuline (Ig) repertoires. For the first time, we identified mucosal IgA-producing PCs as a major iNOS+ cell population during H. pylori infection in humans, and additionally confirmed their intracellular nitric oxide production. Since iNOS+ PCs were not detectable in other gastrointestinal infectious diseases, this reaction does not seem to be a general feature of mucosal PCs under conditions of infection. Additionally, intracellular cytokine expression analyses of mucosal B-lineage cells isolated from H. pylori patients revealed a co-expression of IFN-γ and TNF-α in iNOS+ memory B cells and the expression of TNF-α in iNOS+ PCs, but not in iNOS− cells. Molecular analysis of the Ig repertoire of iNOS+ and iNOS− PCs of the VHDJH regions revealed no significant differences regarding the Ig isotype composition, VH and JH gene family usage, CDRH3 length, and frequency of somatic mutations and all antibodies were characterized by typical properties of T cell-dependent affinity maturation.

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In dieser Promotionsarbeit wird der Quad-Color FluoroSpot (QCF) vorgestellt, welcher die Bestimmung der Frequenz von DENV-Serotyp-spezifischen und DENV- Serotyp-kreuzreaktiven B-Zellen auf Einzelzellbasis ermöglicht. Das vorgestellte Verfahren erlaubt die umfassende Analyse der spezifischen B-Zellantwort, so wie sie sich während einer primären oder sekundären DENV-Infektion bzw. nach einer Dengueimpfung entwickelt. Außerdem ermöglicht der QCF die Beurteilung, ob die DENV-Serotypspezifität bzw. -kreuzreaktivität von B-Zellen als Surrogatmarker für Immunschutz bei DENV-Infizierten bzw. in Studien, welche Dengueimpfstoff- kandidaten testen, relevant ist. Außerdem kann das Verfahren durch die Anpassung des verwendeten Antigens auch zur Beurteilung der B-Zellantwort, so wie sie sich nach einer Infektion mit anderen Erregern wie HIV oder Influenzavirus entwickelt, Anwendung finden. / Dengue is a major public health problem globally. It is caused by four antigenically distinct serotypes of dengue virus (DENV1-4), and although serotype-specific and strongly neutralizing cross-reactive immune responses against the four DENV serotypes are thought to be protective, subneutralizing Abs can contribute to increased disease severity upon secondary infection with a different DENV serotype. Understanding the breadth of the immune response in natural DENV infections and in vaccinees is crucial for determining the correlates of protection or disease severity. Transformation of B cell populations to generate mAbs and ELISPOT assays have been used to determine B cell and Ab specificity to DENV; however, both methods have technical limitations. We therefore modified the conventional ELISPOT to develop a Quad-Color FluoroSpot to provide a means of examining B cell/Ab serotype specificity and cross-reactivity on a single-cell basis. Abs secreted by B cells are captured by an Fc-specific Ab on a filter plate. Subsequently, standardized concentrations of all four DENV serotypes are added to allow equal stoichiometry for Ag binding. After washing, the spots, representing individual B cells, are visualized using four fluorescently labeled DENV serotype-specific detection mAbs. This method can be used to better understand the breadth and magnitude of B cell responses following primary and secondary DENV infection or vaccination and their role as immune correlates of protection from subsequent DENV infections. Furthermore, the Quad-Color FluoroSpot assay can be applied to other diseases caused by multiple pathogen serotypes in which determining the serotype or subtype-specific B cell response is important.

Die Implantation eines linksventrikulären Herzunterstützungssystems (LVADs) hat sich in den letzten Jahren als eine vielversprechende Therapieoption für die terminale Herzinsuffizienz etabliert. Obwohl Infektionen nach LVAD-Implantation eine der häufigsten Komplikationen darstellen, sind die Veränderungen immunologischer Parameter vor und nach LVAD-Implantation unzureichend untersucht. Ein Großteil der Patienten mit LVAD-Implantation leidet unter Adipositas und weist damit zusätzliche Risikofaktoren in Bezug auf die Ausbildung von Komplikationen, insbesondere Infektionen auf. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie untersucht, welche Veränderungen sich in Bezug auf ausgewählte immunologische Zellparameter in Abhängigkeit vom Body-Mass-Index (BMI) im ersten Jahr nach LVAD-Implantation ergeben. Die Patienten wurden anhand ihres BMI zum Zeitpunkt der LVAD-Implantation einer von drei Gruppen (Gruppe A, Normalgewicht: BMI von 18,5-24,9 kg/m2; n = 17; Gruppe B, Präadipositas: 25,0-29,9 kg/m2; n = 24; Gruppe C, Adipositas: ≥ 30,0 kg/m2; n = 27) zugeordnet. Die Gruppen wurden anhand der Erhebung demografischer Daten, vor Implantation bestehender Komorbiditäten, im postoperativen Verlauf auftretender Komplikationen sowie klinischer Laborparameter verglichen. An vier Messzeitpunkten (vor Implantation, 3 Monate, 6 Monate und 12 Monate nach LVAD-Implantation) wurden Vollblut- und Serumproben entnommen. Diese wurden mittels Durchflusszytometrie auf zelluläre Immunzellpopulationen, wie T- und B-Zellen, regulatorische T-Zellen (Tregs), dendritische Zellen (DCs) sowie Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) untersucht. Mittels Multiplex-Analyse wurde das Zytokinprofil analysiert. In der vorliegenden Studie waren die Gruppen in Bezug auf ihre demografischen Daten, vor Implantation bestehender Komorbiditäten und nicht-infektiöser Komplikationen im Verlauf nach LVAD-Implantation vergleichbar. Die Analyse der T-Zellen und ausgewählter T-Zell-Subpopulationen zeigte zum einen eine stärkere Erhöhung der T-Zellen bei präadipösen Patienten, geringere Anteile der CD8+ T-Zellen bei adipösen Patienten ein Jahr nach LVAD-Implantation sowie geringere Anteile von Tregs bei präadipösen Patienten ab sechs Monaten nach LVAD-Implantation. Ein Jahr nach LVAD-Implantation wiesen adipöse Patienten einen höheren Anteil an DCs auf als normalgewichtige und präadipöse Patienten. Eine vertiefende Analyse der Subpopulationen von mDCs und pDCs anhand der BDCA-Oberflächenmoleküle ergab, dass normalgewichtige und präadipöse Patienten im Verlauf des ersten Jahres nach LVAD-Implantation eine Erhöhung der Anteile BDCA1+ und BDCA3+ mDCs aufwiesen. Die Anteile der BDCA4+ pDCs waren bei den präadipösen und adipösen Patienten im Vergleich zu den normalgewichtigen Patienten drei Monate nach LVAD-Implantation reduziert. Es konnten keine Unterschiede der Anteile von NK-Zellen zwischen normalgewichtigen, präadipösen und adipösen Patienten detektiert werden, jedoch zeigte sich bei adipösen LVAD-Patienten im Vergleich zu den Normalgewichtigen zum ersten Messzeitpunkt nach LVAD-Implantation ein erhöhter Anteil der CD56bright NK-Zellen und ein reduzierter Anteil der CD56dim NK-Zellen. Zusammenfassend lässt sich mit dieser Studie ein deutlicher Einfluss des BMI auf immunologische Veränderungen nach LVAD-Implantation nachweisen. Neben den adipösen LVAD-Patienten zeigten auch präadipöse LVAD-Patienten weitreichende Änderungen immunologischer Zellparameter, die NK-Zellen, Tregs, DCs sowie CD4+ und CD8+ T-Zellen betrafen. Die Betrachtung aller nachgewiesenen immunologischen Veränderungen präadipöser und adipöser Patienten deutet auf eine eingeschränkte antivirale und antibakterielle Immunreaktivität und damit auf ein erhöhtes Risikoprofil für Infektionen nach LVAD-Implantation hin.:1. Inhaltsverzeichnis II 2. Abbildungsverzeichnis IV 3. Tabellenverzeichnis VII 4. Abkürzungsverzeichnis IX 5. Einführung 1 5.1 Herzinsuffizienz und linksventrikuläre Herzunterstützungssysteme 1 5.2 Infektionen als Komplikation nach LVAD-Implantation 4 5.3 Immunologische Parameter bei Herzinsuffizienz und nach LVAD-Implantation 6 5.3.1 T-Zellen 6 5.3.2 B-Zellen 8 5.3.3 Dendritische Zellen 9 5.3.4 Natürliche Killerzellen 10 5.3.5 Zytokine 10 5.4 Einfluss einer Adipositas auf das Outcome nach LVAD-Implantation und auf immunologische Parameter 12 6. Aufgabenstellung 14 7. Materialien und Methoden 15 7.1 Studiendesign und Probenentnahme 15 7.2 Probenaufarbeitung 17 7.3 Durchflusszytometrie 17 7.3.1 Messung der Immunzellpopulationen 19 7.3.2 Auswertung der durchflusszytometrischen Daten 22 7.4 Multiplexanalyse 26 7.5 Demografische Datenerhebung 28 7.6 Statistik 28 8 Ergebnisse 29 8.1 Demografische Daten und Komorbiditäten 29 8.2 Medikation im Zeitraum von sechs Wochen vor LVAD-Implantation 31 8.3 Gesundheitlicher Verlauf im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 33 8.3.1 Gesundheitlicher Verlauf ohne Betrachtung eines Infektionsgeschehens 33 8.3.2 Infektionsgeschehen im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 33 8.4 Flussraten des LVADs im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 36 8.5 Vergleich ausgewählter Laborparameter 36 8.5.1 Hämatokrit, Erythrozyten- und Hämoglobinkonzentration 36 8.5.2 Thrombozytenkonzentration 39 8.5.3 Leukozytenkonzentration 40 8.5.4 CRP-Konzentration 40 8.5.5 Quick-Wert und die INR 41 8.6 Durchflusszytometrische Analyse 43 8.6.1 CD3+ T-Zellen 43 8.6.2 CD3+ CD8+ T-Zellen 44 8.6.3 CD3+ CD4+ T-Zellen 46 8.6.4 Regulatorische T-Zellen 49 8.6.5 B-Zellen 50 8.6.6 Zirkulierende DCs 50 8.6.7 Plasmazytoide DCs 51 8.6.8 Myeloide DCs 53 8.6.9 NK-Zellen 55 8.6.10 CD56bright und CD56dim/- NK-Zellen 56 8.7 Analyse der Immunbalance 58 9 Diskussion 60 10 Zusammenfassung der Arbeit 69 11 Literaturverzeichnis 71 12 Anhang 83 13 Selbstständigkeitserklärung 97 15 Danksagung 98

ZTLs vermitteln die Eliminierung von infizierten und entarteten Zellen durch Apoptose. Neuste Erkenntnisse unserer Gruppe haben gezeigt, dass eine Subpopulation der CD8+ T-Zellen, anstelle der zytotoxischen Marker das Oberflächenmolekül CD40L exprimiert. Die Expression von CD40L ist bislang als Schlüsselmolekül für die CD4+ T-Zell vermittelte Hilfe bekannt, welche durch Bindung an den CD40 Rezeptor auf anderen Immunzellen induziert wird. Das von den CD4+ T–Zellen ausgehende CD40L Signal ist besonders für die T-Zell abhängige B-Zell Aktivierung und die Bildung von Keimzentren essentiell, in denen B-Zellen heranreifen und hochaffine Antikörper produzieren um den Organismus vor eindringenden Erregern zu schützen. Aufgrund der CD40L-assoziierten Helferfunktion sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welche Auswirkungen die Interaktion von CD8+CD40L+ T-Zellen mit B Zellen hat. In in vitro Studien konnte gezeigt werden, dass 50% der antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen nach Aktivierung durch B-Zellen CD40L hochregulieren. Sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene induzierten CD8+CD40L+ T-Zellen einen B-Zell Phänotyp, der stark dem von CD4+ T-Zellen stimulierten B-Zellen ähnelte. In Infektionsversuchen mit dem B-Zell-trophen Virus MHV-68 konnte gezeigt werden, dass transgene Mäuse mit CD40L defizienten CD8+ T-Zellen im Vergleich zu Kontrolltieren eine signifikante Reduktion der Keimzentrums-B-Zellen in den Lymphknoten der oberen Halsregion aufweisen. Eine genauere Betrachtung des B-Zell Repertoires von IgG Gedächtniszellen ergab jedoch, dass die Sequenzen der IGHJ3 Genfamilie bevorzugt für die Modifikation der CDR3 Region in Mäusen mit CD40L defizienten CD8+ T-Zellen verwendet wird, die eine entscheidende Rolle bei der Antigenerkennung spielt. Zusammengefasst kann mit dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass CD8+CD40L+ T-Zellen Helferfunktionen durch Unterstützung der B-Zell Aktivierung und Bildung von Keimzentren übernehmen können. / CTLs are important for the elimination of infected and degenerated cells by inducing apoptosis of the target cells. Recently our group identified a sub-population of CD8+ T cells expressing CD40L instead of common CTL markers. To that date, transient CD40L expression on T cells has been only described as a function of activated CD4+ T cells, which displays this key molecule for CD4+ T cell mediated help by binding to the CD40 receptor on other immune cells. Particularly, CD40L signaling provided by CD4+ T cells is indispensable for T cell dependent B cell activation and GC responses, which generate B cells secreting high affinity antibodies that protect the host from invading pathogens. Due to its associated helper functions, this thesis aimed to dissect whether CD40L positive CD8+ T cells are restricted to cytotoxic killing or if this sub-population possesses similar properties as CD4+ T cells when interacting with B cells. In vitro co-culture experiments showed that 50% of murine antigen specific CD8+ T cells up-regulated CD40L upon activation by antigen presenting B cells. When compared to CD40L deficient CD8+ T cells, the interaction of CD8+ CD40L+ T cells induced remarkable changes in B cells on the RNA and protein level and triggered a B cell phenotype resembling that of B cells primed by CD4+ T cells. By the infection of mice with the B cell trophic virus MHV-68, it was found that E8IcrexCD40Lflox transgenic mice lacking CD40L only on matured CD8+ T cells, exhibited a significant decrease of GC B cells in superficial cervical lymph nodes at the acute state of infection compared to WT mice. A closer look into the memory B cell repertoire revealed a preferred usage of the murine IGHJ3 gene family that modifies the CDR3 and thus the recognition groove of the B cell antibody in E8IcrexCD40Lflox mice. In summary, this work provides sufficient evidence that CD8+ CD40L+ T cells adopt helper-like functions by supporting B cell activation and subsequent GC formation.

Antikörper gegen Circumsporozoite protein (CSP), ein Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum (Pf), können sterile Immunität hervorrufen und dadurch die Entwicklung von Malaria im Tierversuch verhindern. Im Menschen werden protektive B-Zell Gedächtnisantworten gegen CSP durch natürliche Malariaerkrankung bzw. Vakzinierung jedoch nur unzureichend erzeugt. - Für die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen stellt die Affinitätsreifung, welche durch somatische Immungobulin Hypermutation sowie der nachfolgenden Selektion von B-Zellen mit verbesserter Antigenaffinität charakterisiert ist, eine Schlüsselfunktion in der Generierung von protektiven Immunantworten dar. Wie Affinitätsreifung gegen CSP im Menschen stattfindet ist jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit wird die Affinitätsreifung von CSP Gedächtnis B-Zellen auf Einzelzellebene im Menschen über drei kontrollierte Infektionen mit Pf Sporozoiten unter Chemoprophylaxe untersucht. Durch Hochdurchsatz-Einzelzell-Sequenzierung der Immunoglobulin (Ig) gene loci und der Produktion von rekombinanten monoklonalen Antikörpern gewährt diese Arbeit Einsicht in die Selektion und Affinitätsreifung von humanen Gedächtnis-B-Zell Antworten gegen komplexe Proteinantigene und identifiziert Keimbahn kodierte Immunglobulin Charakteristika, die mit hoher CSP-Affinität und Pf-Inhibition einhergehen. Überraschenderweise zeigen die Daten, dass initiale klonale Selektion von hochaffinen B Zellen eine weitaus wichtigere Rolle als Affinitätsreifung in dieser Infektion spielt. Diese Arbeit zeigt fundamentale Eigenschaften von humanen Gedächtnisantworten in einer komplexen Parasiteninfektion und liefert die Grundlage für ein mögliches Design von neuartigen Immunogenen um hoch-affine B-Zellen gegen CSP effizienter zu induzieren. / Antibodies against the major Plasmodium falciparum (Pf) sporozoite surface protein, circumsporozoite protein (CSP), can mediate sterile immunity thereby preventing malaria disease symptoms as shown by passive transfer in animal models. However, protective anti- CSP memory antibody responses are not efficiently induced by natural Pf exposure or vaccination. Affinity maturation, i.e. the diversification of antigen-activated naïve precursor B cells by a somatic immunoglobulin (Ig) gene mutation process and the subsequent selection of B cells expressing antigen receptors with improved antigen affinity in germinal center reactions is considered key to the formation of protective memory B cell responses. However, how the anti-PfCSP memory B cell response matures in humans is not known. To address this question, the clonal evolution of the human anti-Pf CSP memory B cell response over three successive controlled Pf infections under chemoprophylaxis was assessed at single cell level by high throughput paired full-length Ig gene sequencing and recombinant monoclonal antibody production. The work provides basic insights in the longitudinal development of human memory B cell responses and identified germline-encoded Ig gene features that were associated with high anti-CSP affinity and Pf inhibitory antibody activity. The clonal selection of germline B cells expressing such antibodies, rather than affinity maturation, was associated with high quality anti-PfCSP memory B cell responses. The data provide insights into the evolution of antibody response to a complex protein antigen during infection and a strong rational for the design of novel CSP immunogens to target naïve B cell precursors expressing potent anti-CSP antibodies for the induction of protective memory B cell responses by vaccination.

Programmierter Zelltod (PCD) oder Apoptose ist ein universeller biologischer Prozess, der in multizellulären Organismen essentiell ist für die Differenzierung und Homöostase von Geweben. Bei der Entwicklung eines funktionsfähigen zellulären Immunsystems können autoreaktive Zellen entstehen. Die negative Selektion von unreifen, autoreaktiven B-Zellen erfolgt durch IgM-vermittelte Apoptose und ist von de novo Transkription abhängig. Die genauen Mechanismen der IgM-vermittelten Apoptose und die involvierten Genprodukte sind nur unzureichend charakterisiert. Zur Identifikation Apoptose-assoziierter Gene in B-Zellen wurden die Differential Display-Analyse durchgeführt und die Expressionsmuster apoptotischer und nicht-apoptotischer BL60-Zellen untersucht. Es wurden 38 differentielle Fragmente identifiziert und kloniert. Sequenzanalysen ergaben Homologien eines Fragments mit LAPTM5, einem lysosomal-assoziierten Transmembran-Protein mit vorwiegender Expression in hämatopoetischem Gewebe. Northern Blot-Analysen zeigten 2 Stunden nach Inkubation von BL-60-Zellen mit anti-IgM einen Anstieg der Genexpression von LAPTM5. Das LAPTM5-Gen liegt auf Chromosom 1 (1p34), ist evolutionär konserviert und besitzt keine Homologien zu bekannten Genen. Die Untersuchung der gewebespezifischen Expression von LAPTM5 ergab neben der hohen Expressionsrate in hämatopoetischem Gewebe eine sehr starke Expression in Skelett- und Herzmuskelgewebe. Elektronenmikroskopisch zeigte sich eine Lokalisation des Proteins in späten Endosomen und Lysosomen. Daneben konnte LAPTM5 auch auf der Oberfläche von BL60-Zellen detektiert werden. Während des apoptotischen Prozesses bleibt die Menge an LAPTM5 auf der Zelloberfläche konstant. Zur weiteren Charakterisierung von LAPTM5 und anderen Kandidaten-Genen wurde ein episomales Expressions- und Selektionssystem entwickelt. Cotransfektionsanalysen unter Verwendung eines GFP (green fluorescent protein)- Konstrukts zeigten, dass die aufgereinigten Zellen zu 80% das interessierende Gen exprimieren und die Expression länger als vier Wochen anhält. / Programmed cell death (PCD) or apoptosis is a key feature of normal development and tissue homeostasis. In the development of a functional immunesystem the occurence of autoreactive cells is tightly controlled and prevented by apoptosis. The negative selection of autoreactive immature B cells after encountering self antigen occures via surface IgM (sIgM) mediated apoptosis and depends on de novo gene transcription. The precise mechanism of this process and the possible involvement of different genes in the regulation of sIgM-mediated cell death is not understood so far. In order to identify genes associated with B cell apoptosis Differential Display RT-PCR (DD) was performed to analyze sIgM-mediated apoptosis in the human Burkitt lymphoma line BL60. The expression patterns of apoptotic and non-apoptotic cells were investigated and 38 differentially expressed gene fragments were found. Subsequent northern blot analysis showed that LAPTM5, a lysosomal associated membrane protein preferential ly expressed in adult hematopoietic tissue, is up-regulated 2 hours after induction of apoptosis. LAPTM5 is a protein with five transmembrane domains, it is conserved during evolution and the gene, mapping to chromosome 1p34, has no homology to known genes. In contrast to earlier data a very high expression of the protein was detected not only in hematopoietic tissue but also in skeletal muscle and heart muscle. Electronmicroscopy was performed to investigate the subcellular localization in detail and showed that LAPTM5 is mainly present in late endosomes and lysosomes. FACS analysis revealed a surface expression of LAPTM5 and a constant amount of LAPTM5 at the surface during IgM mediated apoptosis. To further investigate the functional role of candidate genes during apoptosis an episomal expression and selection system was established. Cotransfection analysis with GFP (green fluorescent protein) showed that 80% of the separeted cells express the gene of interest for at least four weeks.