In dieser Promotionsarbeit wird der Quad-Color FluoroSpot (QCF) vorgestellt, welcher die Bestimmung der Frequenz von DENV-Serotyp-spezifischen und DENV- Serotyp-kreuzreaktiven B-Zellen auf Einzelzellbasis ermöglicht. Das vorgestellte Verfahren erlaubt die umfassende Analyse der spezifischen B-Zellantwort, so wie sie sich während einer primären oder sekundären DENV-Infektion bzw. nach einer Dengueimpfung entwickelt. Außerdem ermöglicht der QCF die Beurteilung, ob die DENV-Serotypspezifität bzw. -kreuzreaktivität von B-Zellen als Surrogatmarker für Immunschutz bei DENV-Infizierten bzw. in Studien, welche Dengueimpfstoff- kandidaten testen, relevant ist. Außerdem kann das Verfahren durch die Anpassung des verwendeten Antigens auch zur Beurteilung der B-Zellantwort, so wie sie sich nach einer Infektion mit anderen Erregern wie HIV oder Influenzavirus entwickelt, Anwendung finden. / Dengue is a major public health problem globally. It is caused by four antigenically distinct serotypes of dengue virus (DENV1-4), and although serotype-specific and strongly neutralizing cross-reactive immune responses against the four DENV serotypes are thought to be protective, subneutralizing Abs can contribute to increased disease severity upon secondary infection with a different DENV serotype. Understanding the breadth of the immune response in natural DENV infections and in vaccinees is crucial for determining the correlates of protection or disease severity. Transformation of B cell populations to generate mAbs and ELISPOT assays have been used to determine B cell and Ab specificity to DENV; however, both methods have technical limitations. We therefore modified the conventional ELISPOT to develop a Quad-Color FluoroSpot to provide a means of examining B cell/Ab serotype specificity and cross-reactivity on a single-cell basis. Abs secreted by B cells are captured by an Fc-specific Ab on a filter plate. Subsequently, standardized concentrations of all four DENV serotypes are added to allow equal stoichiometry for Ag binding. After washing, the spots, representing individual B cells, are visualized using four fluorescently labeled DENV serotype-specific detection mAbs. This method can be used to better understand the breadth and magnitude of B cell responses following primary and secondary DENV infection or vaccination and their role as immune correlates of protection from subsequent DENV infections. Furthermore, the Quad-Color FluoroSpot assay can be applied to other diseases caused by multiple pathogen serotypes in which determining the serotype or subtype-specific B cell response is important.

Die Implantation eines linksventrikulären Herzunterstützungssystems (LVADs) hat sich in den letzten Jahren als eine vielversprechende Therapieoption für die terminale Herzinsuffizienz etabliert. Obwohl Infektionen nach LVAD-Implantation eine der häufigsten Komplikationen darstellen, sind die Veränderungen immunologischer Parameter vor und nach LVAD-Implantation unzureichend untersucht. Ein Großteil der Patienten mit LVAD-Implantation leidet unter Adipositas und weist damit zusätzliche Risikofaktoren in Bezug auf die Ausbildung von Komplikationen, insbesondere Infektionen auf. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie untersucht, welche Veränderungen sich in Bezug auf ausgewählte immunologische Zellparameter in Abhängigkeit vom Body-Mass-Index (BMI) im ersten Jahr nach LVAD-Implantation ergeben. Die Patienten wurden anhand ihres BMI zum Zeitpunkt der LVAD-Implantation einer von drei Gruppen (Gruppe A, Normalgewicht: BMI von 18,5-24,9 kg/m2; n = 17; Gruppe B, Präadipositas: 25,0-29,9 kg/m2; n = 24; Gruppe C, Adipositas: ≥ 30,0 kg/m2; n = 27) zugeordnet. Die Gruppen wurden anhand der Erhebung demografischer Daten, vor Implantation bestehender Komorbiditäten, im postoperativen Verlauf auftretender Komplikationen sowie klinischer Laborparameter verglichen. An vier Messzeitpunkten (vor Implantation, 3 Monate, 6 Monate und 12 Monate nach LVAD-Implantation) wurden Vollblut- und Serumproben entnommen. Diese wurden mittels Durchflusszytometrie auf zelluläre Immunzellpopulationen, wie T- und B-Zellen, regulatorische T-Zellen (Tregs), dendritische Zellen (DCs) sowie Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) untersucht. Mittels Multiplex-Analyse wurde das Zytokinprofil analysiert. In der vorliegenden Studie waren die Gruppen in Bezug auf ihre demografischen Daten, vor Implantation bestehender Komorbiditäten und nicht-infektiöser Komplikationen im Verlauf nach LVAD-Implantation vergleichbar. Die Analyse der T-Zellen und ausgewählter T-Zell-Subpopulationen zeigte zum einen eine stärkere Erhöhung der T-Zellen bei präadipösen Patienten, geringere Anteile der CD8+ T-Zellen bei adipösen Patienten ein Jahr nach LVAD-Implantation sowie geringere Anteile von Tregs bei präadipösen Patienten ab sechs Monaten nach LVAD-Implantation. Ein Jahr nach LVAD-Implantation wiesen adipöse Patienten einen höheren Anteil an DCs auf als normalgewichtige und präadipöse Patienten. Eine vertiefende Analyse der Subpopulationen von mDCs und pDCs anhand der BDCA-Oberflächenmoleküle ergab, dass normalgewichtige und präadipöse Patienten im Verlauf des ersten Jahres nach LVAD-Implantation eine Erhöhung der Anteile BDCA1+ und BDCA3+ mDCs aufwiesen. Die Anteile der BDCA4+ pDCs waren bei den präadipösen und adipösen Patienten im Vergleich zu den normalgewichtigen Patienten drei Monate nach LVAD-Implantation reduziert. Es konnten keine Unterschiede der Anteile von NK-Zellen zwischen normalgewichtigen, präadipösen und adipösen Patienten detektiert werden, jedoch zeigte sich bei adipösen LVAD-Patienten im Vergleich zu den Normalgewichtigen zum ersten Messzeitpunkt nach LVAD-Implantation ein erhöhter Anteil der CD56bright NK-Zellen und ein reduzierter Anteil der CD56dim NK-Zellen. Zusammenfassend lässt sich mit dieser Studie ein deutlicher Einfluss des BMI auf immunologische Veränderungen nach LVAD-Implantation nachweisen. Neben den adipösen LVAD-Patienten zeigten auch präadipöse LVAD-Patienten weitreichende Änderungen immunologischer Zellparameter, die NK-Zellen, Tregs, DCs sowie CD4+ und CD8+ T-Zellen betrafen. Die Betrachtung aller nachgewiesenen immunologischen Veränderungen präadipöser und adipöser Patienten deutet auf eine eingeschränkte antivirale und antibakterielle Immunreaktivität und damit auf ein erhöhtes Risikoprofil für Infektionen nach LVAD-Implantation hin.:1. Inhaltsverzeichnis II 2. Abbildungsverzeichnis IV 3. Tabellenverzeichnis VII 4. Abkürzungsverzeichnis IX 5. Einführung 1 5.1 Herzinsuffizienz und linksventrikuläre Herzunterstützungssysteme 1 5.2 Infektionen als Komplikation nach LVAD-Implantation 4 5.3 Immunologische Parameter bei Herzinsuffizienz und nach LVAD-Implantation 6 5.3.1 T-Zellen 6 5.3.2 B-Zellen 8 5.3.3 Dendritische Zellen 9 5.3.4 Natürliche Killerzellen 10 5.3.5 Zytokine 10 5.4 Einfluss einer Adipositas auf das Outcome nach LVAD-Implantation und auf immunologische Parameter 12 6. Aufgabenstellung 14 7. Materialien und Methoden 15 7.1 Studiendesign und Probenentnahme 15 7.2 Probenaufarbeitung 17 7.3 Durchflusszytometrie 17 7.3.1 Messung der Immunzellpopulationen 19 7.3.2 Auswertung der durchflusszytometrischen Daten 22 7.4 Multiplexanalyse 26 7.5 Demografische Datenerhebung 28 7.6 Statistik 28 8 Ergebnisse 29 8.1 Demografische Daten und Komorbiditäten 29 8.2 Medikation im Zeitraum von sechs Wochen vor LVAD-Implantation 31 8.3 Gesundheitlicher Verlauf im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 33 8.3.1 Gesundheitlicher Verlauf ohne Betrachtung eines Infektionsgeschehens 33 8.3.2 Infektionsgeschehen im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 33 8.4 Flussraten des LVADs im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 36 8.5 Vergleich ausgewählter Laborparameter 36 8.5.1 Hämatokrit, Erythrozyten- und Hämoglobinkonzentration 36 8.5.2 Thrombozytenkonzentration 39 8.5.3 Leukozytenkonzentration 40 8.5.4 CRP-Konzentration 40 8.5.5 Quick-Wert und die INR 41 8.6 Durchflusszytometrische Analyse 43 8.6.1 CD3+ T-Zellen 43 8.6.2 CD3+ CD8+ T-Zellen 44 8.6.3 CD3+ CD4+ T-Zellen 46 8.6.4 Regulatorische T-Zellen 49 8.6.5 B-Zellen 50 8.6.6 Zirkulierende DCs 50 8.6.7 Plasmazytoide DCs 51 8.6.8 Myeloide DCs 53 8.6.9 NK-Zellen 55 8.6.10 CD56bright und CD56dim/- NK-Zellen 56 8.7 Analyse der Immunbalance 58 9 Diskussion 60 10 Zusammenfassung der Arbeit 69 11 Literaturverzeichnis 71 12 Anhang 83 13 Selbstständigkeitserklärung 97 15 Danksagung 98

Bakterielle Glykanantigene sind hoch-divers in ihrer Komposition und Verbindung. Antikörper gegen Glykanantigene können vor bakteriellen Infektionen schützen und sind wichtig um die Homöostase zwischen dem Wirt und seinem Mikrobiom aufrecht zu halten. Typischerweise lösen Glykanantigene jedoch Antikörperantworten aus, die sich durch ein vermindertes B Zell-Gedächtnis und niedrig-affine Antikörper mit geringer Spezifität auszeichnen. In dieser Arbeit konnten, mithilfe von biotinylierten Lipopolysaccharide O-Antigenen des opportunistisch-pathogenen Bakteriums Klebsiella pneumoniae (Kp), O-Antigen-spezifische B Zellen innerhalb peripherer Gedächtnis- und intestinaler Effektor-B Zellen identifiziert werden. Durch Einzel-Zell Immunoglobulin-Sequenzierung und Klonierung bzw. rekombinanter Expression von Antikörpern dieser Zellen wird gezeigt, dass, unter natürlichen Umständen, affinitätsgereifte Antikörper gegen definierte Kp Glykanantigene erzeugt werden. Diese Antikörper binden nicht nur Kp O-Serotyp-spezifisch sondern auch spezifisch an strukturell ähnliche Kp O-Antigene und taxonomisch unterschiedliche Mikroorganismen. Die Ergebnisse zeigen, dass Menschen, bei natürlicher Besiedlung, kreuz-spezifische Antikörper gegen Glykanantigene erzeugen und deuten auf einen Mechanismus hin, wie das humorale Immunsystem auf die Glykandiversität des Mikrobioms reagieren und sich anpassen kann. Weiterhin könnten die hier identifizierten Antikörper nützlich für die Behandlung von nosokomiellen Kp Infektionen sein. / Bacterial glycan antigens are highly diverse in composition and linkage. Antibodies against glycan antigens can protect against bacterial infection and are important in maintaining homeostasis between the host and its microbiome. However, glycan antigens typically elicit B cell responses that have impaired long-term memory formation and are comprised of low-affine antibodies with low specificity. In this work, the use of biotinylated Lipopolysaccharide O-antigens of the opportunistic pathogen Klebsiella pneumonia allowed to identify anti-O-antigen B cells in the peripheral memory and intestinal effector B cell pool in healthy humans. Single B cell Immunoglobulin gene sequencing, antibody cloning, and recombinant expression reveal that, under natural circumstances, humans acquire affinity-matured antibodies against defined Kp glycan antigens. Despite their O-serotype-specificity, the antibodies bind to other structurally similar Kp O-serotypes and taxonomically distinct non-Kp microbes. The findings show that humans, under natural exposure, acquire affinity-matured cross-specific anti-glycan antibodies and provide a mechanistic way how the humoral immune system could adapt to the large microbial glycan diversity present in nature. Further, the antibodies identified in this work might be beneficial in treatment of nosocomial Kp infections.

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Die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wird durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren verursacht, darunter gewisse Umwelteinflüsse, genetische Veranlagungen oder Virusinfektionen. So vielfältig die Ursprünge von Autoimmunerkrankungen sind, so divers sind die daraus resultierenden Erkrankungen, wodurch die Entwicklung zuverlässiger Therapien erschwert wird. Obwohl verschiedene Behandlungsmöglichkeiten existieren, welche die Symptome bei Autoimmunerkrankungen wie neuroinflammatorischer Multipler Sklerose (MS) mildern können, z.B. mit monoklonalen Antikörpern (mAk), wirken die meisten Medikamente breit und unspezifisch. Dies beeinträchtigt die Funktionalität des Immunsystems, was wiederum zu einem höheren Risiko für bakterielle und virale Infektionen, maligne Erkrankungen oder sekundäre Autoimmunität führen kann. Andere Therapieansätze untersuchen daher Möglichkeiten einer Antigen-abhängigen Immuntoleranz-Induktion. Allerdings befinden sich diese noch in den frühen Entwicklungsphasen und deren klinische Wirksamkeit muss noch bewiesen werden. Alternativ hat es sich in der onkologischen Immuntherapie als erfolgreich erwiesen, entweder natürliche oder gentechnisch veränderte Immunzellen zu aktivieren. Bisher wurden humane T-Zellen, welche mit Hilfe chimärer Antigenrezeptoren (CAR) mit ausgewählter Spezifität ausgestattet sind, sehr erfolgreich in der Klinik gegen Tumorerkrankungen genutzt. Basierend auf diesen klinischen Erfolgen stellt sich die Frage, ob CAR T-Zellen auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden können. Herkömmlichen CAR T-Zellen mangelt es jedoch sowohl an Flexibilität als auch an Kontrollierbarkeit, da sie mit einem CAR gegen ein einzelnes Antigen ausgestattet sind und in Gegenwart des Zielantigens dauerhaft aktiviert und nicht kontrollierbar sind. Um Limitationen konventioneller CARs zu überwinden, wurden universelle Adapter-CARs (UniCARs, RevCARs) in der Gruppe von Prof. Bachmann entwickelt. Die modulare UniCAR-Plattform besteht aus universell einsetzbaren UniCAR T-Zellen und anpassbaren antigenspezifischen Zielmodulen (TMs). Die Bindungseinheit des UniCAR basiert auf einem mAk mit Spezifität gegen ein Peptidepitop, das Teil des TMs ist und welches spezifisch an Zielantigene auf Tumorzellen bindet. Das TM fungiert als Adaptermolekül, das eine Vernetzung der UniCAR T-Zelle mit der Zielzelle herstellt. Nach der Vernetzung mit der Zielzelle über das TM wird die UniCAR T-Zelle aktiviert, so dass die Zielzelle eliminiert wird. Eine vor Kurzem vorgenommene Modifikation der extrazellulären UniCAR-Domäne führte zu der Reverse CAR (RevCAR)-Plattform, welche die Spezifität und Sicherheit noch weiter erhöhen sowie tonische Signale konventioneller CARs reduzieren soll. Dabei wurde die extrazelluläre mAk-basierte UniCAR-Domäne mit dem Peptidepitop des TM ausgetauscht. Eines der am besten untersuchten Autoantigene bei neuroinflammatorischen Erkrankungen ist das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Dieses Protein befindet sich ausschließlich im zentralen Nervensystem an der abaxonalen Membran der nervenschützenden Myelinscheide. Obwohl neuroinflammatorische Erkrankungen wie MS hauptsächlich durch T-Zellen verursacht werden, wurden bei MS-Patienten auch Autoantikörper gegen MOG nachgewiesen, was auf die Beteiligung autoreaktiver B-Zellen an der Verschlimmerung der Krankheit hinweist. Diese Ergebnisse werden durch die wirksame Behandlung von MS-Patienten mit anti-CD20-mAks belegt. In dieser Arbeit wurde MOG als erstes Modell-Zielantigen für das Retargeting von CAR-modifizierten T-Zellen gegen anti-MOG-Ak-exprimierende humane Zellen verwendet. Ziel dieser Arbeit war neue TMs basierend auf der extrazellulären Domäne des MOG Antigens zu entwickeln, die dazu dienen, UniCAR oder RevCAR T-Zellen zur Eliminierung von anti-MOG Ak-exprimierenden Zielzellen zu aktivieren. Zur Bestimmung des optimalen MOG-Antigen TM-Formats wurden für die UniCAR-Plattform ein monovalentes (25 kDa) und ein bivalentes MOG-Antigen TM (50 kDa) entwickelt. Die Wirksamkeit des UniCAR-Systems wurde in vitro demonstriert. Es konnte dabei gezeigt werden, dass beide TMs bereits nach einer kurzen Inkubationszeit von 8 Stunden eine TM-spezifische Lyse Anti-MOG scFv-exprimierender menschlicher Zelllinien durch UniCAR-T-Zellen vermitteln. Darüber hinaus war es möglich, das zytotoxische Potential der UniCAR-T-Zellen durch die Dosierung der TMs zu kontrollieren. Um zu überprüfen, ob der Effekt basierend auf der UniCAR-Platform gegen anti-MOG scFv-exprimierende Zielzellen noch gesteigert werden kann, wurde ein monovalentes MOG-Antigen RevTM für die RevCAR-Plattform entwickelt. In Kombination mit RevCAR-T-Zellen übertraf die Anwendung des RevTM beide UniCAR TMs hinsichtlich Bindungsaffinität und dosisabhängiger Zytotoxizität gegen zwei anti-MOG scFv-exprimierende Zelllinien in vitro. Außerdem war die Freisetzung proinflammatorischer und T-Zellwachstum-fördernder Zytokine im Vergleich zu UniCAR T-Zellen höher und ausgeprägter. Weiterhin wurde die Funktionalität des RevCAR-Systems gegen anti-MOG-scFv-exprimierende Zielzellen in vivo bewiesen. Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass die modularen Adapter-CAR T-Zell-Plattformen neben der Krebsimmuntherapie auch bemerkenswertes Potential für die Behandlung von MOG-assoziierten Autoimmunerkrankungen hat. Damit konnte ein erster Grundstein dafür gelegt werden, CAR T-Zellen auf die Anwendung in Autoimmunerkrankungen zu übertragen, um zukünftig gezielt fehlerhafte Immunzellen zu beseitigen, die nachweislich zur Verschlimmerung von Autoimmunerkrankungen beitragen.:Table of contents I List of abbreviations VI 1 Introduction 1 1.1 The human immune system 2 1.2 B cells and antibodies 3 1.2.1 Antibody structure 3 1.2.2 Tolerance induction 4 1.2.3 B cell activation 5 1.2.4 B cell functions in autoimmune diseases 6 1.3 Multiple sclerosis – an example for neuroinflammatory demyelination diseases 8 1.3.1.1 Disease phenotypes 9 1.3.1.2 Immunopathogenesis 9 1.3.2 Autoantigen myelin oligodendrocyte glycoprotein 11 1.4 Immunotherapy 14 1.4.1 Monoclonal antibody therapy 14 1.4.2 Chimeric antigen receptor therapy 16 1.4.2.1 UniCAR and RevCAR T cell system 18 1.4.2.2 CAR T cells in autoimmune diseases 22 1.5 Objectives 23 2 Materials and Methods 25 2.1 Materials 25 2.1.1 Consumables 25 2.1.2 Devices and software 27 2.1.3 Chemicals and reagents 32 2.1.4 Buffers and solutions 36 2.1.5 Enzymes and enzyme buffers 38 2.1.6 Kit systems 39 2.1.7 Plasmid vectors 39 2.1.8 Oligonucleotides 41 2.1.9 Antibodies 41 2.1.10 Basic media, additives, and recombinant proteins 43 2.1.11 Composition of culture media 44 2.1.12 Bacterial strain 46 2.1.13 Cell lines 46 2.1.14 Mouse strain 47 2.2 Methods 47 2.2.1 Molecular biological and microbiology methods 47 2.2.1.1 DNA digestion with restriction enzymes 47 2.2.1.2 Dephosphorylation of vectors 48 2.2.1.3 Agarose gel electrophoresis 48 2.2.1.4 Isolation and purification of DNA fragments from agarose gels 48 2.2.1.5 Ligation of DNA fragments 49 2.2.1.6 Heat-shock transformation of competent E. colis 49 2.2.1.7 Plasmid mini preparation 49 2.2.1.8 Plasmid midi preparation 50 2.2.1.9 Determination of DNA concentration 50 2.2.1.10 DNA sequencing 50 2.2.2 Cell biology methods 50 2.2.2.1 Cultivation of eukaryotic cells 50 2.2.2.2 Freezing and thawing cultured cells 51 2.2.2.3 Determination of cell number 52 2.2.2.4 Lentiviral transduction of eukaryotic cells 52 2.2.2.5 Immunofluorescence labeling 54 2.2.2.6 Flow cytometry and analysis of flow cytometry data 55 2.2.2.7 Isolation of human peripheral blood mononuclear cells 57 2.2.2.8 Isolation of T cells from PBMCs with magnetic-activated cell sorting 58 2.2.2.9 Stimulation of isolated human T cells 58 2.2.2.10 Engraftment of T cells with chimeric antigen receptors 59 2.2.3 Methods of protein biochemistry 59 2.2.3.1 Isolation of target module constructs 59 2.2.3.2 Dialysis of purified target module constructs 60 2.2.3.3 Discontinuous Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 60 2.2.3.4 Determination of concentration and immunochemical detection of target module constructs 62 2.2.3.5 Determination of binding affinities of target modules using enzyme-linked immunosorbent assay 63 2.2.4 In vitro functional studies 64 2.2.4.1 T cell activation and exhaustion assay 65 2.2.4.2 Luciferase assay (cytotoxicity assay) 65 2.2.4.3 Determination of cytokine concentration 65 2.2.5 In vivo functionality studies 66 2.2.5.1 Evaluation of tumor killing in vivo 66 2.2.5.2 Optical imaging of luciferase-expressing tumors in vivo 67 2.2.6 Statistical evaluation 67 3 Results 68 3.1 Design and generation of novel MOG target modules 68 3.1.1 MOG target module constructs 68 3.1.2 Expression of target modules 69 3.2 Establishment of scFv MOG-presenting cell models 72 3.3 Binding properties of MOG target modules 74 3.3.1 Determination of binding affinity between anti-MOG antibody and MOG target modules with enzyme-linked immunosorbent assay 74 3.3.2 Determination of binding affinity between anti-MOG receptor-expressing cell lines and MOG target modules with flow cytometry 75 3.4 Generation of human CAR-expressing T cells and binding of MOG target modules 80 3.4.1.1 Genetic modification of human T cells for UniCAR expression 81 3.4.1.2 Genetic modification of human T cells for RevCAR expression 83 3.5 Redirection of UniCAR T cells in vitro 85 3.5.1 Activation of redirected UniCAR T cells 85 3.5.2 Cytokine profile of redirected UniCAR T cells 87 3.5.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.2 Efficacy of UniCAR target modules 91 3.6 Redirection of RevCAR T cells in vitro 92 3.6.1 Activation of redirected RevCAR T cells 92 3.6.2 Cytokine profile of redirected RevCAR T cells 95 3.6.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by RevCAR T cells 99 3.6.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells using RevCAR T cells 99 3.6.3.2 Efficacy of RevCAR target module 101 3.7 Investigation of RevCAR T cell-mediated cytotoxicity in vivo 103 4 Discussion 105 4.1 Structure and purification of MOG target modules 106 4.2 Expression and purification of target modules 107 4.3 Binding properties of MOG target modules 107 4.4 In vitro cytotoxic potential of UniCAR and RevCAR T cells redirected by MOG target modules 110 4.4.1 Target module-specific redirection of UniCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 110 4.4.2 Target module-specific redirection of RevCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 112 4.5 Future prospective 116 5 Summary 119 6 Zusammenfassung 121 7 References 124 List of figures 145 List of tables 147 Acknowledgement 148

Die Arbeit beschreibt zuerst alle relevanten Grundlagen zum angeborenen und erworbenen Immunsystem. Insbesondere die anatomischen und histologischen Bestandteile und deren Funktion, sowie Blutbildung, Lymphozyten-Selektion und Interaktion der Bestandteile. Antikörperklassen und Blutzellen werden dabei ebenso tabellarisch zusammengefasst. Die ablaufenden Prozesse der angeborenen und erworbenen Immunantwort (letztere unterteilt in humoral und zellvermittelt, sowie primär und sekundär) werden näher erläutert. Ebenso wird die Antigenerkennung und die Funktionalität von B-Zellen und T-Zellen detailliert erklärt. Anschließend werden intensiv Störungen des Immunsystems wie Allergien und Immunsuppressionen beschrieben. Anhand etlicher Stoffe und Stoffklassen, wie Cyclosporin A, Thalidomid und polyhalogenierter Kohlenwasserstoffe, werden die vielfältigen Wirkmechanismen toxikologischer Substanzen auf das Immunsystem beschrieben und anschaulich dargestellt. Zuletzt wird ein Vorschlag unterbreitet, wie der Inhalt in das Toxnetz-Körpermodell eingearbeitet werden kann. Als Beispiel wurde der immunmodulierende Antikörper Pembrolizumab ausgewählt, ein Protein, welches bei der Krebstherapie eingesetzt wird und die T-Zell-Erkennung von Krebszellen wieder aktiviert.

Cytokine steuern die Kommunikation von verschiedenen Zelltypen untereinander und regulieren deren Überleben, Differenzierung und Wachstum. Kommt es zu einer Deregulation der Expression von Cytokinen oder deren Rezeptoren, kann es zu autoimmunen oder malignen Erkrankungen kommen. Ein besonderes Beispiel der aberranten Cytokinexpression ist das klassische Hodgkin Lymphom. Die malignen Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) Zellen des Hodgkin Lymphoms stammen ursprünglich aus Keimzentrums B-Zellen ab, haben aber ihren B-Zell Phänotyp verloren. Des Weiteren exprimieren sie eine Vielzahl von verschiedenen Cytokinen und Cytokinrezeptoren, die ursprünglich nicht in einem Genexpressionsprogramm von B-Zellen vorkommen. In dieser Arbeit wurden zwei dieser Cytokin-Rezeptorsysteme (IL-21/IL-21R und CSF-1/CSF1R) hinsichtlich ihrer Funktionen für die HRS Zellen des Hodgkin Lymphoms charakterisiert. Die Expression des T-Zell assoziierten Cytokins IL-21 konnte in dieser Arbeit erstmals in HRS Zellen nachgewiesen werden. Für die Expression des myeloiden CSF1R zeigen Ergebnisse dieser Arbeit eine neuartige Regulation durch ein Long Terminal Repeat (LTR) Element, welche zu einem bis dahin unbekannten mRNA Transkript des Protoonkogens CSF1R in den HRS Zellen führt. Sowohl für IL-21 als auch für CSF1R konnte in der Doktorarbeit die Expression und Funktionalität des jeweilig korrespondierenden Rezeptors (IL-21R) bzw. Cytokins (CSF-1) nachgewiesen werden. Die Bedeutung dieser B-Zell fremden Gene für die HRS Zellen lag hauptsächlich in der Stimulation von Wachstum und Überleben und der Induktion von wichtigen Signalwegen (z.B. STAT3). Die Ergebnisse der Dissertation können als Ausgangspunkt für neue Strategien in der Diagnostik und der spezifischeren Therapie von Hodgkin Lymphom Patienten dienen. Der außergewöhnliche Mechanismus der Genregulation des CSF1R Gens über ein endogenes LTR Element kann in anderen Tumorentitäten ebenfalls ein Grund für die Aktivierung von Onkogenen sein. / Cytokines in the human body are responsible for cell-cell communication and regulate survival, differentiation and proliferation of different cell types. Deregulation of expression levels of cytokines might contribute to autoimmune diseases or tumor growth. One of the most prominent examples of aberrant cytokine expression is the classical Hodgkin Lymphoma. The malign Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) cells of classical Hodgkin Lymphoma are derived from germinal centre B cells, however they lost their B cell-specific phenotype. Moreover they express a huge variety of cytokines and cytokine receptors, normally not expressed in B cells. Two of these cytokine-receptor systems (IL-21/IL-21R and CSF-1/CSF1R) and their expression and function in HRS cells are subject of this dissertation. The expression of the T cell-associated cytokine IL-21 has been shown for the first time in HRS cells. The results for the myeloid-specific proto-oncogene CSF1R identified a unique, so far unknown mRNA transcript, expressed due to activation of a long terminal repeat (LTR) element. For both, IL-21 and CSF1R, the expression and functionality of the corresponding receptor (IL-21R) or cytokine (CSF-1), respectively, was demonstrated in this dissertation. Protection from apoptosis, proliferation and stimulation of several pathways are the main functional consequences of auto- and paracrine stimulation of HRS cells with either IL-21 or CSF-1. These results might lead to new diagnostic and more specific treatment strategies for Hodgkin Lymphoma patients. Regarding the unusual expression of CSF1R via LTR activation this mechanism might also be the reason for oncogene activation in several other tumor entities.