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L’Hypertension Hyperkaliémique Familiale (HHF) est une forme rare d’hypertension associée à une hyperkaliémie et une acidose métabolique hyperchlorémique, très sensible aux diurétiques thiazidiques. Les premières analyses génétiques ont permis d’identifier deux gènes responsables, WNK1 et WNK4, mais qui n’expliquaient que 8 % de notre cohorte. L’objectif de ma thèse était de rechercher de nouveaux gènes ou variants à l’origine de l’HHF. Notre stratégie initiale a été de combiner une analyse de liaison à un séquençage d’exome entier sur trois grandes familles atteintes. Nous avons ainsi identifié un nouveau gène responsable de la maladie codant pour un acteur jusque là insoupçonné, KLHL3 (Kelch-like 3), responsable de 39% des cas de notre cohorte. La majorité des mutations sont présentes à l’état hétérozygote entrainant un phénotype modéré, alors que les rares patients porteurs d’une mutation homozygote, tous issus de familles consanguines, présentent un phénotype plus marqué. Le spectre des mutations a montré l’importance des structures en boucles de cette protéine qui joue un rôle d’adaptateur de substrat dans un complexe d’ubiquitination (publié dans Nature Genetics, 2012). La découverte d’un type unique de mutations sur le gène CUL-3 par une équipe concurrente a été confirmée dans notre cohorte, entrainant un phénotype plus précoce et plus sévère. Ces mutations ont mis en lumière l’importance de ces deux protéines dans la constitution du complexe E3 ubiquitine-ligase et la dégradation des WNKs dans le néphron, par le protéasome après ubiquitination. Nous avons aussi identifié des mutations faux-sens dans le domaine acide de WNK1 très conservé chez des patients ayant un phénotype HHF mais sans hypertension artérielle. Ce motif, similaire à celui porteur de mutations sur WNK4 est responsable de la liaison à l’adaptateur de substrat KLHL3. Les sujets atteints présentent un âge plus précoce d’apparition de la maladie avec des valeurs de pression artérielle normales. La comparaison phénotypique avec les cas porteurs d’une mutation WNK4 et d’une délétion de l’intron 1 de WNK1 a montré des différences de pression artérielle significatives. La transfection d’ARNc mutés dans les œufs de Xénope, effectuées en collaboration, a permis de démontrer que ces nouvelles mutations faux-sens de WNK1 entrainent une accumulation de son isoforme rénale KS-WNK1 (soumis à J Am Soc Nephrol). L’ensemble de ces résultats ouvre une nouvelle voie de compréhension moléculaire de la régulation du transport des ions sodium, potassium et chlore au niveau du rein et par conséquence de la pression artérielle. / Familial Hyperkalemia Hypertension (FHHt), also known as Gordon syndrome is a rare form of hypertension associated with hyperkalemia and hyperchloremic metabolic acidosis, very sensitive to thiazide diuretics. In 2001, the first genetic analysis identified two genes, coding for two serine/threonine kinases WNK1 and WNK4, which explained only 8% of our cohort. The aim of my thesis was to search new genes or variants responsible for FHHt. We decided to combine a linkage analysis and a whole exome sequencing in three affected families. We identified a new gene responsible for the disease coding for an unsuspected actor KLHL3 (Kelch-like 3), responsible for 39% of our cohort. The majority of the mutations are present at a heterozygous state leading to a moderate phenotype, whereas patients with homozygous mutation, all from consanguineous families, displayed a stronger phenotype. The spectrum of mutations showed the importance of the loop structures of this protein playing an adaptor role in an ubiquitination complex (published in Nature Genetics, 2012). The discovery of a particular type of mutations in CUL-3 by another team was confirmed in our cohort, leading to an earlier and more severe phenotype. These changes have highlighted the importance of these two proteins in the formation of the E3 ubiquitin-ligase-complex and in the WNKs degradation in the nephron by the proteasome after ubiquitination. We have also identified missense mutations in the acidic motif of WNK1, highly conserved in patients with FHHt without hypertension. This pattern is similar to the WNK4 mutations and is responsible for the binding of the substrate adaptor KLHL3. Affected individuals have an earlier age of onset with normal blood pressure values for most of them. Phenotypic comparison with cases carrying WNK4 mutations and deletion of the intron 1 of WNK1 showed significant differences in blood pressure values. Transfection of mutated cRNA in Xenopus laevis oocyte demonstrated that these new WNK1 missense mutations result in the accumulation of the renal isoform KS-WNK1 (submitted to J Am Soc Nephrol). Taken together, these results open a new pathway for understanding the molecular regulation of ion transport and WNK kinases in the kidney and consequently the regulation of blood pressure.

La pratique du mariage entre apparentés au sein de la population libanaise, favorisée par des raisons sociales, religieuses, géographiques et aussi politiques, a vu apparaître des sous-groupes de populations de taille plus ou moins réduite, parfois à la limite d’isolats génétiques. Ceci a engendré une augmentation de la prévalence des maladies autosomiques récessives fréquentes mais aussi et surtout rares. Parmi ces dernières, les chondrodysplasies ont retenu notre attention. Elles sont caractérisées par un retard statural dû à un défaut du processus d’ossification endochondale, qui est responsable de la croissance des os longs. Au cours de ces dernières décennies, plus de 230 gènes responsables d’environ 400 maladies osseuses constitutionnelles ont été identifiés. Cependant, les bases moléculaires d'une centaine de dysplasies osseuses restent, à ce jour, inconnues. L’identification de gènes codant pour des protéines de nature extrêmement variée a contribué à la compréhension du mécanisme complexe d’ossification endochondrale. Mon travail de thèse, réalisé en cotutelle entre l’équipe de recherche « Bases moléculaires et physiopathologiques des chondrodysplasies » de l’hôpital Necker enfants-malades, à Paris en France et l’Unité de Génétique Médicale (UGM) de l’Université Saint-Joseph au Liban, a consisté à identifier des gènes impliqués dans des dysplasies osseuses autosomiques récessives dans quatre familles libanaises consanguines. Dans ce cadre, différentes stratégies ont été adoptées. La première a été une stratégie d’intersection des variations détectées par le séquençage de l’exome de deux patients, atteints d’une forme sévère de dysplasie spondylodysplastique létale et issus de deux familles libanaises consanguines et non apparentées (Familles A et B). Nous avons identifié une mutation homozygote du gène MAGMAS (NM_016069, p.Asn76Asp) (Mitochondria-associated granulocyte macrophage CSF-signaling molecule) à l’origine de la maladie dans les deux familles A et B. MAGMAS est une protéine associée à la mitochondrie et impliquée dans la régulation de l’import actif des protéines vers la matrice mitochondriale. Par immunohistochimie, nous avons montré que MAGMAS est spécifiquement exprimée au niveau de l’os et de la zone hypertrophique du cartilage. MAGMAS, ayant une fonction cruciale pour la survie, est très conservé entre les espèces. Après avoir généré des souches de levures exprimant une copie normale ou mutée du gène humain MAGMAS, nous avons validé l’effet délétère de la mutation p.Asn76Asp, i) sur la croissance des levures, en montrant que les souches portant le gène humain muté présentent un caractère thermosensible, ii) sur la fonction d’import des protéines vers la matrice mitochondriale, qui est altérée dans les souches mutées et iii) sur la stabilité de la protéine. Nous avons également observé un effet de la mutation sur la morphologie des mitochondries et des peroxysomes des cellules de levures, suggérant une induction de l’autophagie dans les souches de levures portant la mutation p.Asn76Asp. L’identification de mutations de MAGMAS dans une dysplasie osseuse sévère, permet d’attribuer à cette protéine un rôle spécifique dans le processus complexe d’ossification endochondrale. La deuxième stratégie a été une combinaison, au sein d’une même famille, d’une stratégie de cartographie par homozygotie et du séquençage de l’exome d’un seul patient. Cette approche a été utilisée dans une famille consanguine avec 3 enfants atteints porteurs d’une dysplasie rhizomélique (Famille C). Nous avons identifié une mutation homozygote du gène NWD1 (NACHT and WD repeat domain containing 1) (NM_001007525, p.Cys1376Tyr) responsable de la maladie dans cette famille C. Ce gène code pour une protéine ayant des domaines WD répétés qui lui confèrent un rôle dans divers mécanismes comme la transduction de signal, la régulation de la transcription, le transport vésiculaire et le contrôle du cycle cellulaire. (...) / Social, religious, geographic and political reasons have favored the consanguineous marriage in the Lebanese population. This led to an increase in the prevalence of autosomal recessive disorders, especially the rare entities including chondrodysplasias. This group of diseases is due to an impairment of the endochondral ossification process. Causative mutations have now been identified in over 230 different genes in more than 400 unique skeletal phenotypes. However, the genetic basis of over 100 different entities remains to be determined. My PhD research project, held between the research group « Bases moléculaires et physiopathologiques des chondrodysplasies » of Necker enfants-malades hospital (INSERM U781, PARIS, France) and the Medical Genetics Unit of Saint-Joseph University (Lebanon), aims to identify genes involved in autosomal recessive skeletal dysplasias in four consanguineous Lebanese families. Different strategies were carried out: the first consists in overlapping data from whole exome sequencing of two patients affected by a new lethal type of spondylodysplastic dysplasia and issued from two consanguineous unrelated Lebanese families (Families A and B). Here, we report a homozygous missense mutation in the Mitochondria-associated granulocyte macrophage CSF-signaling gene (MAGMAS: NM_016069, p.Asn76Asp) in this severe skeletal dysplasia. MAGMAS, also referred to as PAM16, is a mitochondria-associated protein, involved in pre-proteins import into mitochondria and essential for cell growth and development. We demonstrate that MAGMAS is expressed in trabecular bone and cartilage at early developmental stages underlining its specific role in skeletogenesis. We also give strong evidence of the deleterious effect of the identified mutation on the stability of the protein, its in-vivo activity and the viability of yeast strains. We also show that the mutation is able to induce autophagy in yeast cells. Reporting deleterious MAGMAS mutation in a skeletal dysplasia supports a key and specific role for this mitochondrial protein in ossification. Additional studies would be of interest to further understand the specific role of magmas in ossification. The second strategy was to combine, in a consanguineous family, homozygosity mapping with whole exome sequencing of one of the patients. This strategy was undertaken in family C with 3 patients affected by a rhizomelic dysplasia. It allowed us to identify a homozygous missense mutation in the NWD1 gene (NACHT and WD repeat domain containing 1: NM_001007525, p.Cys1376Tyr) as responsible for the skeletal dysplasia in this family. NWD1 belongs to a large group of WD-repeat domain-containing proteins that are involved in different physiological mechanisms such as signal transduction, transcription regulation, vesicular transport and cell cycle control. (...)

La malformation anévrysmale de la veine de Galien (MAVG) est une malformation vasculaire cérébrale congénitale qui représente près d’un tiers des anomalies vasculaires pédiatriques. Au sein d’une cohorte de 51 patients atteints d’une MAVG, nous avons identifié 5 individus porteurs de mutations hétérozygotes pathogéniques d’EPHB4. Ces mutations incluent une mutation tronquante survenue de novo ainsi que des mutations d’épissage et faux-sens hétérozygotes délétères héritées d’un parent. L’invalidation d’EPHB4 chez les embryons de Danio rerio est à l’origine d’anomalies vasculaires cérébrales spécifiques impliquant la veine dorsale longitudinale, la veine orthologue médiane du prosencéphale (précurseur embryonnaire de la veine de Galien). La co-injection de l’ARNm tronqué a permis la restauration d’un phénotype sauvage démontrant que le phénotype vasculaire observé est la conséquence d’une perte de fonction d’EPHB4. L’ensemble de ces données indique qu’EPHB4 est un gène déterminant chez un sous-groupe de patients atteints d’une MAVG, comme chez Danio rerio. Les mutations perte de fonction d’EPHB4 sont à l’origine d’anomalies spécifiques du développement vasculaire cérébral. L’identification de mutations pathogéniques d’EPHB4 chez des patients présentant des malformations capillaires implique une surveillance attentive de la grossesse. Cette surveillance échographique renforcée pourrait permettre la détection précoce d’une MAVG et une prise en charge anténatale et néonatale optimale. / Vein of Galen aneurysmal malformation (VGAM) is one of the most common fetal brain vascular malformations. We conducted whole exome sequencing in 19 unrelated VGAM patients and subsequently screened candidate gene in a cohort of 32 additional patients. We found 5 affected individuals with heterozygous mutations in EPHB4 including de novo frameshift or inherited deleterious splice or missense mutations predicted to be pathogenic by in silico tools. Knockdown of EPHB4 in zebrafish embryos leads to specific anomalies of dorsal cranial vessels including dorsal longitudinal vein, the ortholog of the median prosencephalic vein, the embryonic precursor of the vein of Galen. This model allowed todemonstrate EPHB4 loss of function mutations in VGAM by the ability to rescue the brain vascular defect in knockdown zebrafish co-injected with wild type but not truncated EPHB4 mimicking the frameshift mutation. Our data showed that in both species, loss of function mutations of EPHB4 result in specific and similar brain vascular development anomaliesThe identification of EPHB4 pathogenic mutation in patients presenting capillary malformation or VGAM should lead to careful follow up of pregnancy of carriers for early detection of VGAM in order to propose optimal neonatal care. Endovascular embolization indeed greatly improved the prognosis of VGAM patients.

Glioblastome machen etwa 47% aller intrinsischen Tumore des zentralen Nervensystems aus. Sie sind durch ein aggressives und invasives Wachstumsverhalten gekennzeichnet. Als erster wegweisender Schritt zur Therapie der Glioblastome gilt die frühe und möglichst vollständige Resektion, gefolgt von einer simultanen Radiochemotherapie. Dennoch sind Tumorrezidive binnen weniger Monate die Regel und es bestehen trotz intensiver Forschung bis heute kaum alternative Behandlungsoptionen. Das Verständnis für die Pathogenese der Glioblastome erfuhr in den letzten Jahren tiefgreifende Änderungen. Nach Berücksichtigung der molekularen Marker in der WHO- Klassifikation, wurden Glioblastome in zwei molekulare Gruppen unterteilt: die IDH-Wildtyp (95% der Fälle) und die IDH-mutierten Glioblastome. IDH-Wildtyp Glioblastome treten bei Patienten mit einem medianen Alter von 64 Jahren auf und gehen mit einer ungünstigen Prognose (medianes Überleben 14,2 Monate) einher. IDH-mutierte Glioblastome kommen vor allem bei jüngeren Patienten mit einem medianen Alter von 45 Jahren vor und weisen eine vergleichsweise bessere Prognose mit einem medianen Überleben von 4-5 Jahren auf. Bei IDH-Wildtyp Glioblastomen wurden am häufigsten TERTp-, und PTEN-Mutationen sowie EGFR-Amplifikationen beschrieben. Dabei stellt die TERTp-Mutation die häufigste somatische Alteration im Genom der IDH-Wildtyp Glioblastome dar. Die oben genannten molekularen Marker bieten eine solide Grundlage für die molekulare Diagnose der IDH- Wildtyp Glioblastome. Dennoch bleibt die Frage unbeantwortet, warum IDH-Wildtyp Glioblastome vor allem bei älteren Patienten auftreten und jüngere Patienten eine bessere Prognose besitzen. Unter der Annahme, dass IDH-Wildtyp Glioblastome ein altersspezifisches molekulargenetisches Profil aufweisen, welches wohlmöglich die Prognose beeinflusst, wurden daher die Tumor- und korrespondierenden Blutproben von 55 Patienten mittels Whole Exome Sequencing untersucht. Nach Filterung der Rohdaten wurden verschiedene Mutationen und Copy Number Variations identifiziert. Zur Validierung der Methode wurde zum einen ein Literaturabgleich der detektierten Alterationen durchgeführt und zum anderen einzelne Kandidatengene mittels Sanger Sequenzierung manuell bestätigt. Insgesamt wurden 1841 Mutationen auf 1544 verschiedenen Genen detektiert. Obwohl viele der 1544 Mutationen ohne Relevanz für die Pathogenese waren, konnte eine enorme Vielzahl an verschiedenen Treibermutationen nachgewiesen werden. Die manuell sequenzierte TERTp-Mutation war mit 76,4% am häufigsten aufgetreten. Weitere Treibermutationen, beispielsweise EGFR, TP53, PTEN, PI3K-Gruppe, NF1 und PDGFRA zeigten mit der Literatur vergleichbare Prävalenzen und betonten die Validität der Methode. Die aufgetretenen Copy Number Variations belegten sowohl auf chromosomaler (Chromosom 7-Amplifikation und Chromosom 10-Deletion), als auch auf genspezifischer Ebene (EGFR-, CDK6-, MET-, PDGFRA-Amplifikation und CDKN2A/B-, und PTEN-Deletion) die molekulargenetischen Charakteristika des IDH-Wildtyp Glioblastoms. Über eine Clusterung dieser Alterationen und Gegenüberstellung mit klinischen Eigenschaften konnten die typischen, publizierten Glioblastomsignaturen (proneural, klassisch, mesenchymal) beschrieben und mit dem Erkrankungsalter in Verbindung gebracht werden. Besonders eindrücklich zeigten unsere Daten, übereinstimmend mit der Literatur, dass eine proneurale Signatur mit einem jungen Erkrankungsalter und günstiger Prognose assoziiert war. Unerwartet zeigte ein Patient mit pädiatrischer Signatur und hohem Erkrankungsalter dennoch ein überdurchschnittlich vorteilhaftes Überleben, verglichen mit seiner Altersgruppe. Unabhängig von molekulargenetischen Alterationen, war ein junges Erkrankungsalter alleinstehend mit einer günstigeren Prognose verknüpft. Für einzelne molekulargenetische Alterationen konnte kein Zusammenhang mit dem Erkrankungsalter oder dem (Progressionsfreien-) Überleben hergestellt werden. Ein alterspezifisches, prognosebeeinflussendes Mutationsmuster konnte demnach nicht identifiziert werden. Limitierend muss dabei die geringe Kohortengröße (n=55) angemerkt werden. Eine Vergrößerung der Studienpopulation war aufgrund der geringen Inzidenz von jungen Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastomen in diesem Studiendesign nicht möglich und könnte perspektivisch in einem multizentrischen Ansatz oder einer langen Akquirierungsphase verwirklicht werden. Die Fülle an identifizierten Treibermutationen verdeutlichte nichtsdestotrotz die große intratumorale Heterogenität des Glioblastoms. Zusätzlich ermöglichte die enorme diagnostische Tiefe der verwendeten Methode die Identifikation der bisher nicht im Zusammenhang mit dem IDH-Wildtyp Glioblastom beschriebenen TET1-Deletion. Obwohl die detaillierte Rolle der TET1-Deletion für das Glioblastom nicht verstanden ist, liefern unsere Daten einen vielversprechenden Hinweis, dass ein Funktionsverlust des TET1-Enzyms, in Kombination mit EGFR-Amplifikation oder Deletion von PTEN oder CDKN2A/B, eine Auswirkung auf die Pathogenese des IDH-Wildtyp Glioblastoms besitzt und die Prognose negativ beeinflusst. Zukünftige molekulargenetische Sequenzierungen sind indiziert, um die Rolle der TET1- Deletion zu bestätigen und darüber hinaus die Pathogenese des Glioblastoms auf molekulargenetischer Ebene noch besser zu verstehen und weitere individualisierte Therapieansätze abzuleiten.:Abkürzungsverzeichnis 5 1 Einleitung 8 1.1 Klinische Grundlagen des Glioblastoms 8 1.1.1 Epidemiologie/Ätiologie 8 1.1.2 Symptomatik und Diagnostik 9 1.1.3 Therapie 10 1.1.4 Prognose 12 1.2 Pathologie und Molekulargenetische Veränderungen des Glioblastoms 12 1.2.1 Treibergene 13 1.2.2 Subgruppen 17 1.3 Fragestellung 18 2 Materialien 19 3 Methoden 23 3.1 Patientenrekrutierung 23 3.1.1 Erweiterte Einschlusskriterien 25 3.1.2 Ausschlusskriterien 25 3.2 Kohortendesign 25 3.3 Klinische Daten 26 3.4 Materialgewinnung 27 3.4.1 Proben-Lagerung 27 3.4.2 DNA-Extraktion 27 3.5 Sanger Sequenzierung Prä-WES 29 3.5.1 Primer-Design 29 3.5.2 Polymerase Kettenreaktion 29 3.5.3 Elektrophorese 31 3.5.4 Aufreinigung PCR-Produkt 33 3.5.5 Sequenzierreaktion 35 3.6 WES 38 3.6.1 Datensatz 41 3.6.2 CNV-Analyse 42 3.7 Sanger Sequenzierung Validierung 42 3.8 Statistische Auswertung 45 4 Ergebnisse 47 4.1 Deskriptive klinisch-pathologische Beschreibung der Kohorte 47 4.1.1 Klinisch-pathologische Zusammenhänge 54 4.2 TERTp-Sequenzierung 58 4.3 Datensatz WES 58 4.3.1 Somatische Mutationen 59 4.3.2 CNV-Analyse 67 4.4 Altersbezogene molekulargenetische Unterschiede 74 4.5 Zusammenhang zwischen Genotyp und OS sowie PFS 77 4.5.1 Somatische Mutationen 77 4.5.2 CNV-Analyse 78 5 Diskussion 82 5.1 Klinische Charakteristika von Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastom 82 5.2 Der prognostische Stellenwert von Tumoreigenschaften 84 5.3 Molekulargenetisches Profil des IDH-Wildtyp Glioblastoms 85 5.3.1 Somatische Mutationen und Copy Number Variations 85 5.3.2 Chromosomale Aberrationen 94 5.4 10q21.3-Deletion 95 6 Zusammenfassung 97 6.1 Deutsch 97 6.2 Englisch 99 Anlagen 101 Darstellung zur Geschlechtsneutralität im geschriebenen Wort 101 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahren 102 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 104 Anhang 105 Literaturverzeichnis 113 Abbildungsverzeichnis 125 Tabellenverzeichnis 127 Danksagung 128 / Glioblastomas account for approximately 47% of all intrinsic central nervous tumors. They are characterized by an aggressive and invasive growth pattern. Early and, if possible, complete resection followed by simultaneous radiochemotherapy is crucial for treatment success. However, tumor recurrence within a few months are very frequent. Despite intensive research, there are still hardly any alternative treatment options. The understanding of the pathogenesis of glioblastomas underwent profound changes in recent years. After considering molecular markers in the WHO classification, glioblastomas have been divided into two molecular groups: IDH-wild-type (95% of cases) and IDH-mutated glioblastomas. IDH-wild-type glioblastomas occur in patients with a median age of 64 years and are associated with an unfavorable prognosis (median survival 14.2 months). On the other hand, IDH-mutated glioblastomas are mainly associated with young patients with a median age of 45 years and have a rather good prognosis with a median survival of 4-5 years. In IDH- wild-type glioblastomas, TERTp-, and PTEN-mutations as well as EGFR-amplifications have been described most frequently. Among them, TERTp-mutation represents the most frequent somatic alteration in the genome of IDH-wild-type glioblastomas. The above molecular markers provide a solid basis for molecular diagnosis of IDH-wild-type glioblastomas. To date, however, the reason why IDH-wild-type glioblastomas appear primarily in older patients with younger patients having a better prognosis remains unclear. Assuming that IDH-wild-type glioblastomas have an age-specific molecular signature with possible impact on the outcome, we analyzed tumor and corresponding blood samples from 55 patients by whole exome sequencing. After filtering the raw data, various mutations and copy number variations were identified. To validate the method, a literature review as well as Sanger Sequencing of selected candidate genes was performed. A total of 1841 mutations on 1544 different genes were detected. Although many mutations appeared to be background mutations with no relevance to pathogenesis, an enormous number of different driver mutations remained. The manually sequenced TERTp-mutation was the most abundant at 76.4%. Other driver mutations, for example EGFR, TP53, PTEN, PI3K group, NF1 and PDGFRA showed prevalence comparable to published data and emphasized the validity of the method. The copy number variations that occurred concurred previously described molecular genetic characteristics of IDH wild-type glioblastoma at both chromosomal (chromosome 7 amplification and chromosome 10 deletion) and gene-specific levels (EGFR-, CDK6-, MET-, PDGFRA-amplification and CDKN2A/B-, and PTEN-deletion). Via clustering of these alterations and juxtaposition with clinical features, the typical glioblastoma signatures (proneural, classic, mesenchymal) could be described and related to age of diagnosis. In line with the literature, our data showed that a proneural signature was associated with younger patients and favorable prognosis. Unexpectedly, a patient with a pediatric signature and high age of diagnosis, showed a survival above average compared with his age group. Regardless of molecular alterations, young age was an independent characteristic of favorable prognosis. For individual genetic alterations, no association with age of diagnosis or (progression-free) survival could be established. Thus, an age-specific mutational pattern could not be identified. The relatively small cohort size (n=55) must be noted as a limiting factor. An increase of the study population was not possible in this study design due to the low incidence of young patients with IDH wild-type glioblastoma and could be realized in a multicenter approach or a long acquisition phase in the future. Nevertheless, the abundance of identified driver mutations highlighted the large intratumoral heterogeneity of glioblastoma. In addition, the tremendous diagnostic depth of the method used enabled the identification of the TET1-deletion not previously described in the context of IDH wild-type glioblastoma. Although the detailed role of TET1-deletion in glioblastoma is not yet understood, our data provides promising evidence that loss of function of the TET1-enzyme in combination with EGFR-amplification or deletion of PTEN or CDKN2A/B has an impact on the pathogenesis of IDH wild-type glioblastoma and negatively affects prognosis. Future genetic sequencing is indicated to confirm the role of TET1-deletion and moreover to get further understanding of the genomic pathogenesis of glioblastoma with the aim to derive individualized therapeutic approaches.:Abkürzungsverzeichnis 5 1 Einleitung 8 1.1 Klinische Grundlagen des Glioblastoms 8 1.1.1 Epidemiologie/Ätiologie 8 1.1.2 Symptomatik und Diagnostik 9 1.1.3 Therapie 10 1.1.4 Prognose 12 1.2 Pathologie und Molekulargenetische Veränderungen des Glioblastoms 12 1.2.1 Treibergene 13 1.2.2 Subgruppen 17 1.3 Fragestellung 18 2 Materialien 19 3 Methoden 23 3.1 Patientenrekrutierung 23 3.1.1 Erweiterte Einschlusskriterien 25 3.1.2 Ausschlusskriterien 25 3.2 Kohortendesign 25 3.3 Klinische Daten 26 3.4 Materialgewinnung 27 3.4.1 Proben-Lagerung 27 3.4.2 DNA-Extraktion 27 3.5 Sanger Sequenzierung Prä-WES 29 3.5.1 Primer-Design 29 3.5.2 Polymerase Kettenreaktion 29 3.5.3 Elektrophorese 31 3.5.4 Aufreinigung PCR-Produkt 33 3.5.5 Sequenzierreaktion 35 3.6 WES 38 3.6.1 Datensatz 41 3.6.2 CNV-Analyse 42 3.7 Sanger Sequenzierung Validierung 42 3.8 Statistische Auswertung 45 4 Ergebnisse 47 4.1 Deskriptive klinisch-pathologische Beschreibung der Kohorte 47 4.1.1 Klinisch-pathologische Zusammenhänge 54 4.2 TERTp-Sequenzierung 58 4.3 Datensatz WES 58 4.3.1 Somatische Mutationen 59 4.3.2 CNV-Analyse 67 4.4 Altersbezogene molekulargenetische Unterschiede 74 4.5 Zusammenhang zwischen Genotyp und OS sowie PFS 77 4.5.1 Somatische Mutationen 77 4.5.2 CNV-Analyse 78 5 Diskussion 82 5.1 Klinische Charakteristika von Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastom 82 5.2 Der prognostische Stellenwert von Tumoreigenschaften 84 5.3 Molekulargenetisches Profil des IDH-Wildtyp Glioblastoms 85 5.3.1 Somatische Mutationen und Copy Number Variations 85 5.3.2 Chromosomale Aberrationen 94 5.4 10q21.3-Deletion 95 6 Zusammenfassung 97 6.1 Deutsch 97 6.2 Englisch 99 Anlagen 101 Darstellung zur Geschlechtsneutralität im geschriebenen Wort 101 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahren 102 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 104 Anhang 105 Literaturverzeichnis 113 Abbildungsverzeichnis 125 Tabellenverzeichnis 127 Danksagung 128

Breast cancer (BCa) is a leading cause of cancer-related female deaths worldwide and is a complex disease consisting of many different subtypes with varying clinical course and outcomes. Triple negative breast cancer (TNBC), an aggressive and highly metastatic subtype, is most prevalent in women of African ancestry (WAA) but the causes of this disparity are not fully understood. The goal of this study was to investigate the epidemiological and genetic profiles in ancestrally-related WAA in Barbados and Nigeria to advance knowledge and lay the foundation for development of improved or novel BCa therapeutics. To gain insight about TNBC across the African continent, a systematic review and meta-analysis was conducted. TNBC frequencies on average across Africa were estimated at 26.8% but were highest in West African countries (46.0%). We also sought to identify the epidemiological profile of BCa in Barbados—a Caribbean island with significant West African ancestry. We reviewed pathological reports for BCa from the sole public hospital in Barbados and compared those data with USA population-based data. We found a high prevalence of high prevalence of TNBC amongst women diagnosed with breast cancer in Barbados (25%), compared to 21% in non-Hispanic Black and 10% in non-Hispanic White women in the USA for the 2010-2016 period. We also investigated the somatic mutational profile of WAA with TNBC in Barbados and Nigeria using whole exome sequencing (WES) of formalin-fixed paraffinembedded TNBC tissues. This investigation revealed novel and pathogenic variants in well-known cancer-associated genes such as TP53, BRCA1 and MDC1. The somatic mutation signature in Nigerian tissues correlated with aflatoxin signature, implying a role for environmental factors influencing the genomics profile in this cohort. Copy number variants were revealed at high frequencies for PIK3CA, FGFR2 and HIF1AN genes. Collectively, these findings uncovered novel epidemiological and genetic trends in WAA with high prevalence of the aggressive TNBC subtype / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / Breast cancer (BCa) is a leading cause of cancer-related death in women worldwide. Although Caucasian women are diagnosed with BCa more than women of African ancestry (WAA), more WAA unfortunately die from BCa. The reasons for this disparity are currently unknown, however, a higher proportion of WAA are diagnosed with an aggressive type of BCa called triple negative breast cancer (TNBC). This might partially explain the high cancer death rate in WAA. To understand this disparity in BCa incidence and outcomes, we investigated TNBC disease trends across the African continent and in Barbados (a Caribbean island with predominantly African ancestry) and found a high proportion of TNBC diagnoses in Barbados and West African countries. We also discovered a novel genetic profile within these groups that may be useful to develop new cancer therapies that would decrease TNBC aggressiveness and death in these populations.

Die Dissertationsarbeit untersucht genetische Varianten in Zellkulturmodellen des metastatischen und kastrationsresistenten Prostatakarzinoms. Außerdem werden Mechanismen der Chemoresistenz, insbesondere der Resistenz gegen Cisplatin und Docetaxel in diesen Zelllinien untersucht. / This Dissertation evaluates genetic variants found in cell culture models of metastatic castration resistant prostate cancer. Furthermore, mechanisms of resistance against the chemotherapeutic drugs cisplatin and docetaxel are investigated in these cell lines.

Les Inuits du Nunavik regroupent des peuples autochtones de l'Arctique qui au fil de l’histoire ont formé une petite population isolée dans la région du Nunavik (nord de la province de Québec, Canada). Le profil génétique unique des Inuits du Nunavik est le résultat d’une adaptation à leur milieu de vie et il est considéré comme lié à certaines de leurs susceptibilités pathologiques. Une évolution neutre, ainsi qu’une suite d’événements adaptatifs, ont façonné le génome de ces Inuits et indirectement engendré leur prédisposition accrue à certains troubles cardio-vasculaires et cérébro-vasculaires (ex : hypertension et anévrismes intracrâniens (AI)). Les AI sont des faiblesses cérébro-vasculaires localisées pouvant mener à des dilatations et renflements localisés de la paroi vasculaire. De telles distorsions sont susceptibles de perturber les vaisseaux et entrainer des hémorragies sous-arachnoïdiennes. Les AI sont un désordre complexe dont la prévalence est élevée (4-8%) et différentes populations (non reliées aux Inuits) ont aussi un risque accru de développer des AI. Le développement des AI est associé à la fois à des facteurs environnementaux et génétiques; plusieurs études génomiques ont identifié des régions associées aux AI. Une grande part de l'héritabilité génétique des AI demeure encore inexpliquée, en particulier dans des populations autres que les finnois et les japonais. Toutefois il est à noter que peu d’études génétiques des AI ont tenu compte de la contribution de variations génétiques spécifiques à la population étudiée. Pour améliorer nos connaissances sur la part encore inexpliquée de l'héritabilité des AI (qui implique une grande hétérogénéité génétique et des variations peu pénétrantes), nous avons combiné le séquençage à haut débit au génotypage des polymorphismes sur puces afin d’établir la signature génétique des deux populations fondatrices du Québec prédisposées aux AI (Inuits du Nunavik et Canadiens français). Comme ces populations ont des caractéristiques distinctes, nous avons utilisé des approches différentes pour tenter d’identifier des facteurs de risque génétiques. Les Inuits du Nunavik représentent une population autochtone et de nombreux aspects de leur signature génétique diffèrent de celles des principales populations, nous avons choisi d’approfondir leur histoire et profil génomique avant de vérifier si des associations génomiques pouvaient être établies avec les IA. Nous avons tout d'abord examiné les régions codantes du génome et observé de nombreuses composantes génétiques spécifiques aux Inuits du Nunavik qui reflètent que la population s’est adaptée à son environnement (ex: ascendance Inuit homogène, augmentation du déséquilibre de liaison et signature génétique). Des signes de sélection naturelle, jusqu’alors non-identifiés, ont révélé une accumulation de variations génétiques dans des gènes impliqués dans le processus d'adhésion cellulaire et de la réponse immunitaire (ex. CPNE7 et ICAM5). D'autres analyses ont révélé un variant dans le gène CCM2 qui présente une sélection positive et est significativement associé aux AI chez les Inuits du Nunavik. En ce qui concerne l'étiologie génétique des AI dans la population des Canadiens français, nous avons adopté une approche différente et utilisé des variations spécifiques aux Canadiens français, qui ont été identifiées par le séquençage complet de l'exome. Ces variations ont permis de générer une liste de gènes à risque potentiel, qui ont ensuite été priorisés en utilisant un test d'association par gène de type « burden ». RNF213 est apparu comme le meilleur gène candidat; il est vraisemblablement la conséquence d’une dérive génétique. Les mesures génétiques et fonctionnelles subséquentes ont validé la contribution possible de RNF213 au développement des AI chez les Canadiens français. Les résultats présentés dans cette thèse soulignent l'importance de prendre en compte le contexte génétique spécifique apporté par l'évolution lorsqu'une maladie complexe est étudiée. Il a également été montré que les variations d’un gène spécifique (ex. CCM2 et RNF213) peuvent contribuer au développement de différentes pathologies lorsqu'ils sont observés dans des populations distinctes. D'une manière générale, nos découvertes génétiques ont permis d’identifier de nouvelles « pièces » génétiques et pour avancer le « casse-tête » incomplet de l'héritabilité génétique des AI ; la génétique des populations a été un élément clé pour cette avancée. / Nunavik Inuit is a group of Arctic indigenous people, who have historically presented as a small and isolated population across the Nunavik region of northern Quebec (Canada). The unique genetic profile of Nunavik Inuit is the result of years of adaptation to their living condition, and it is likely responsible for their increased susceptibility to certain pathological conditions. Prior studies have shown that as a consequence of neutral evolution or past adaptive events, today’s Inuit are predisposed to cardio-cerebrovascular disorders, e.g. hypertension and intracranial aneurysm (IA). IA is defined as localized cerebrovascular weakness which leads to vascular dilation or ballooning, and such distortions are susceptible to disrupt the affected vessels and lead to subarachnoid hemorrhage. It is a complex disorder with a high prevalence (4-8%) and certain populations have been observed to present an increased risk of developing IA. Both environmental and genetic factors are deemed to contribute to the development of IA and in regards to the latter, independent genome-wide association studies (GWAS) have identified multiple loci associated with IA. Nonetheless, there is still a large portion of the genetic heritability of IA, especially in different populations other than Finnish and Japanese that remains unexplained. However, fewer IA genetic studies have taken in consideration the contribution of population specific genetic variants. To address some of the IA missing heritability that is deemed to be accountable to its genetic heterogeneity and low penetrance, we have combined high throughput sequencing (HTS) with SNP-chip genotyping to examine the genetic signatures of two founder populations from Quebec that are predisposed to IA, including Nunavik Inuit and French-Canadians (FC). Because these populations have distinct genetic characteristics, we used different approaches for the identification of genetic risk factors. Nunavik Inuit is an indigenous population and many aspects of its genetic signatures differ from those of separate world-wide major populations; therefore we chose to conduct extensive population genetic studies in regards to their genetic history and genomic profile before we undertook to test if any association could be established between genomic loci and disease susceptibility. We observed many genetic components that are specific to the Nunavik Inuit population, including its homogeneous Inuit ancestry, increased linkage disequilibrium (LD) and genetic signatures which reflect the population had a long history of adaptations to their environment. Previously unidentified signals of natural selection, which focused on coding regions of the genome revealed an accumulation of genetic variants in genes involved in the processes of cell adhesion and immune responses (e.g. CPNE7 and ICAM5). Further analyses revealed a variant in CCM2 to be under positive selection and significantly associated with IA in Nunavik Inuit. In regard to the genetic etiology of IA in the French-Canadian population, we took a different approach and used French-Canadian specific variants that were identified by whole exome sequencing to generate a list of potential risk genes; which were further prioritized using a gene based burden association test. RNF213 emerged as a prime candidate gene that had undergone possible genetic drift and the follow-up genetic and functional examinations further supported its potential contribution to the development of IA among French-Canadians. The results presented in this thesis highlighted the importance of taking into consideration the specific genetic background brought by natural selection or genetic drift, both are driving forces of evolution, when a complex disease is being studied. It also further confirmed that variants in a specific gene (e.g. RNF213 or CCM2) may contribute to the development of different pathogenesis when examined in distinct populations. Overall as our genetic findings identified new genetic “pieces” that further completed the missing heritability “puzzle” of IA genetics; evidence for these “pieces” were interestingly highlighted through population genetics.

L’anémie falciforme est une maladie monogénique causée par une mutation dans le locus de la β-globine. Malgré le fait que l’anémie falciforme soit une maladie monogénique, cette maladie présente une grande hétérogénéité clinique. On présume que des facteurs environnementaux et génétiques contribuent à cette hétérogénéité. Il a été observé qu’un haut taux d’hémoglobine fœtale (HbF) diminuait la sévérité et la mortalité des patients atteints de l’anémie falciforme. Le but de mon projet était d’identifier des variations génétiques modifiant la sévérité clinique de l’anémie falciforme. Dans un premier temps, nous avons effectué la cartographie-fine de trois régions précédemment associées avec le taux d’hémoglobine fœtale. Nous avons ensuite effectué des études d’association pan-génomiques avec deux complications cliniques de l’anémie falciforme ainsi qu’avec le taux d’hémoglobine fœtale. Hormis les régions déjà identifiées comme étant associées au taux d’hémoglobine fœtale, aucun locus n’a atteint le niveau significatif de la puce de génotypage. Pour identifier des groupes de gènes modérément associés au taux d’hémoglobine fœtale qui seraient impliqués dans de mêmes voies biologiques, nous avons effectué une étude des processus biologiques. Finalement, nous avons effectué l’analyse de 19 exomes de patients Jamaïcains ayant des complications cliniques mineures de l’anémie falciforme. Compte tenu de la taille des cohortes de réplication disponibles, nous n’avons pas les moyens de valider statistiquement les variations identifiées par notre étude. Cependant, nos résultats fournissent de bons gènes candidats pour des études fonctionnelles et pour les réplications futures. Nos résultats suggèrent aussi que le β-hydroxybutyrate en concentration endogène pourraient influencer le taux d’hémoglobine fœtale. De plus, nous montrons que la cartographie-fine des régions associées par des études pan-génomiques peut identifier des signaux d’association additionnels et augmenter la variation héritable expliquée par cette région. / Sickle cell disease is a monogenic disease caused by a mutation in the β-globin locus. Although it is a monogenic disease, it shows a high clinical heterogeneity. Environmental and genetic factors are thought to play a role in this heterogeneity. It has been observed that a high fetal hemoglobin (HbF) levels correlates with a diminution of the severity and mortality of patients with sickle cell disease. The goal of my project was to identify genetic modifiers of the clinical severity of sickle cell disease. First, I performed the fine-mapping of three regions previously associated with HbF levels. Second, I performed genome-wide association studies with two clinical complications of sickle cell disease as well as with HbF levels. Since no new loci reached array-wide significance for HbF levels, I performed a pathway analysis to identify additional HbF loci of smaller effect size that might implicate shared biological processes. Finally, I performed the analysis of 19 whole exomes from Jamaican sickle cell disease patients with very mild complications. In conclusion, given the sample size of the replication cohorts available, we do not currently have the means to statistically validate the association signals. However, these results provide good candidate genes for functional studies and for future replication. Our results also suggest that β-hydroxybutyrate in endogenous levels could influence HbF levels. Furthermore, we show that fine-mapping the loci associated in genome-wide association studies can identify additional signals and increase the explained heritable variation.

INTRODUÇÃO: Crianças com baixa estatura constituem um grupo heterogêneo. Em uma parcela dos casos, o mecanismo envolvido nesse processo decorre de alterações genéticas. OBJETIVO: Realizar uma investigação clínica e genético-molecular de um grupo de pacientes com baixa estatura de causa desconhecida. MÉTODOS: Selecionamos crianças com baixa estatura persistente (escore-Z de altura <= -2 para idade e sexo) de causa desconhecida para avaliação genômica. O estudo foi dividido em 2 etapas: 1ª etapa - avaliação de 229 pacientes com baixa estatura sindrômica [baixa estatura associada a outros achados dismórficos (atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou déficit intelectual, presença de dismorfismos faciais e/ou outras malformações)] por cariótipo molecular (aCGH/SNPa); 2ª etapa: avaliação de 99 crianças com baixa estatura persistente, nascidas pequenas para idade gestacional (PIG - escore-Z de peso e/ou comprimento ao nascer <= -2 para idade gestacional) e classificação de acordo com a presença ou ausência de dismorfismos associados. Essas crianças foram divididas em dois grupos: baixa estatura sindrômica (n=44) e baixa estatura isolada (n=55). Pacientes com baixa estatura sindrômica foram avaliados por sequenciamento exômico (WES). Pacientes com baixa estatura isolada foram avaliados através de painel gênico (n = 39) ou WES (n = 16). RESULTADOS: 1ª etapa: 32 (14%) pacientes com baixa estatura sindrômica apresentaram variações no número de cópias (CNVs) patogênicas ou possivelmente patogênicas. Sete delas são recorrentes em outros estudos e são responsáveis por cerca de 40% de todas as CNVs patogênicas/possivelmente patogênicas encontradas em pacientes com baixa estatura de causa desconhecida. 2ª fase: Dentre os 99 pacientes avaliados com baixa estatura nascidos PIG, foram encontradas 23 variantes patogênicas/possivelmente patogênicas em genes já associados à distúrbios de crescimento. Quinze (34%) nos pacientes com baixa estatura sindrômica, em genes relacionados a processos celulares fundamentais, vias de reparo de DNA e vias intracelulares; e oito (15%) em pacientes com baixa estatura isolada, em genes associados à cartilagem de crescimento e a via RAS/MAPK. CONCLUSÃO: A heterogeneidade dos pacientes com baixa estatura dificulta o diagnóstico clínico. As novas abordagens genômicas permitem estabelecer o diagnóstico etiológico de crianças com baixa estatura de causa desconhecida / BACKGROUND: Patients born small for gestational age (SGA) are a heterogenous group, and in several cases, it is due to genetic processes. AIM: To perform a clinical and genetic-molecular investigation of short stature patients of unknown cause. METHODS: We selected short stature children (height <= -2 SDS for age and sex) of unknown cause for genomic evaluation. The study had two stages: 1st stage - 229 syndromic short stature patients (patients with short stature and dysmorphic features, developmental delay, and/or intellectual disability) were evaluated by molecular karyotype (aCGH/SNPa); 2nd stage: We selected 99 short stature children born SGA (birth weight and/or length <=-2 SDS for gestational age). They were classified according to the presence or absence of dysmorphic features into two groups: syndromic short stature (n=44) and isolated short stature (n=55). Patients with syndromic short stature were evaluated by whole exome sequencing (WES), and patients with isolated short stature were evaluated through a target panel sequencing (n=39) or WES (n=16). RESULTS: 1st stage: 32 (14%) syndromic short stature patients had pathogenic or probably pathogenic copy number variations (CNVs). We observed seven recurrent CNVs that are responsible for about 40% of all pathogenic/probably pathogenic genomic imbalances found in short stature patients of unknown cause. 2nd stage: Of the 99 patients evaluated, 23 pathogenic/likely pathogenic variants were found in genes already associated with growth disorders. Fifteen (34%) syndromic short stature patients had pathogenic variants in genes related to fundamental cellular processes, DNA repair and intracellular pathways; and eight (15%) isolated short stature patients had pathogenic variants in genes associated with growth plate development and the RAS/MAPK pathway. CONCLUSION: The heterogeneity of short stature makes the clinical diagnosis difficult. The new genomic approaches are effective to diagnose a larger number of undiagnosed patients