No description available.

Die Interaktion zwischen Tumorzellen und Stromazellen spielt eine wichtige Rolle für die lokale Tumorprogression, die Invasivität und Metastasierung von soliden Tumoren wie dem Mammakarzinom. Es ist bekannt, dass die Kokultivierung von MCF-7 Mammakarzinomzellen mit humanen Makrophagen zu einer Wnt5a abhängigen Invasivitätssteigerung der Mammkarzinomzellen führt, welche durch den Wnt-Antagonisten Dkk-1 verhindert werden kann. Unbekannt war, ob sich primär hoch invasive Mammakarzinomzellen wie etwa die tripe-negative (TN) Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 und die schwach invasive Zelllinie MCF-7 hinsichtlich ihrer Expression von Wnt- und Wnt-abhängigen Genen unterscheiden. So zeigten sich sowohl die nicht-kanonischen Wnt-Liganden Wnt5a und Wnt5b als auch die Wnt-assoziierten Gene VEGF-A und PLAU-R in der MDA-MB-231 Zelllinie als deutlich höher exprimiert im Vergleich zu MCF-7. Insbesondere die Expressionsunterschiede von Wnt5a und Wnt5b waren zuvor unbekannt und erweitern die molekulare Charakteristik dieser Zelllinien. In Kokulturexperimten von MCF-7 Mammakarzinomzellen und humanen Makrophagen zeigte sich in dieser Arbeit eine signifkant höhere Expression von Wnt5a, VEGF-A und TNF-α in MCF-7 nach 24h. Dies ist ein weiterer Aspekt für die molekularen Mechanismen, welche zu einer Invasivitätssteigerung solider Tumore durch Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM) führen können. Interessanterweise blieb diese Regulation unter Zugabe von rh Dkk-1 aus, was eine wichtige Rolle von Dkk-1 möglicherweise auch aus therapeutischer Sicht nahelegt.

Abstract This thesis focuses on mammalian kidney development and in particular on the question of how two Wnt signalling pathway genes, an antagonistic Dkk1 and an agonistic ligand Wnt5a, regulate the process. Wnts are secreted ligands that are involved in many developmental processes, including gonadal differentiation and kidney development, but also in various diseases and malformations. Wnts form a large signalling family containing 19 different glycoprotein ligands in mammals. Wnt signalling occurs via two different intracellular pathways. A canonical pathway proceeds via beta-catenin, and a non-canonical pathway utilizes other signalling molecules. Dkk1 is an antagonist of the canonical pathway and Wnt5a is considered a ligand that activates the non-canonical signalling pathway. As part of the thesis, I have studied the role of Dkk1 in kidney morphogenesis using a conditional mouse model, in which the gene is deleted in a cell specific manner from the collecting ducts. Dkk1 deficiency increased renal papilla growth and the risk of hydronephrosis. Research pointed out that the lack of Dkk1 in the collecting ducts increased cell proliferation and disturbed the balance of canonical Wnt signalling, which led to an overgrowth of renal papilla. This led to functional phenotypes including increased water reabsorption and changes in ion secretion/absorption. These changes are most likely due to altered Wnt7b signalling. The second part of the thesis examines the role of the non-canonical Wnt5a gene in kidney development with a conventional knock out mouse model. At the time work began on the thesis, no corresponding kidney phenotype had been published. The primary finding in kidneys lacking Wnt5a was an altered basement membrane organization of the collecting ducts and glomeruli. The phenotype is most likely the reason behind morphological phenotypes which vary from bilateral kidney agenesis to duplex collecting system. Notably, during the course of this study we found a mutation in the human WNT5A gene of a CAKUT patient. This is the first time Wnts have been shown to organize kidney development via basement membrane formation. / Tiivistelmä Tämän väitöskirjan tarkoituksena on ollut tutkia munuaisen kehitystä ja kuinka kaksi Wnt-signalointireitin geeniä, signalointia estävä Dkk1 ja signalointia edistävä Wnt5a säätelevät sitä. Wnt ligandit ovat eritettäviä signaalimolekyylejä, jotka ovat osallisina monissa kehitysbiologissa prosesseissa kuten sukupuolen määräytymisessä ja munuaisen kehityksessä. Myös monissa taudeissa on havaittu muuntuneita Wnt geenien tuottotasoja. Wnt-geenit muodostava suuren signalointimolekyyliperheen, johon lukeutuu 19 jäsentä nisäkkäillä ja Wnt-signointi on jaettu perinteisesti kahteen signalointiryhmään. Dkk1 on kanonisen Wnt-signaloinnin estäjä ja Wnt5a:ta pidetään pääsaantiöisesti ei-kanonisena Wnt-ligandina. Väitöskirjassani olen tutkinut Dkk1 geenin toimintaa kohdennetussa Dkk1-poistogeenisessä hiiressä, jossa geenin toiminta on poistettu spesifisesti munuaisen kokoojaputkista. Dkk1:n puutos johtaa munuaisen papillan kasvuun ja lisää riskiä hydronefroksen muodostumiseen. Tutkimukset osoittivat että Dkk1:n puutos aiheuttaa lisääntynyttä solujakautumista kokoojaputkissa, jolloin Wnt-signaloinnin muutos aiheuttaa papillan ylikasvua. Ylikasvusta seuraa lisääntynyttä veden takaisin imeytymistä ja muutoksia ionien erittämisessä ja takaisin imeytymisessä. Todennäköisimmin muutokset johtuvat muuntuneesta Wnt7b signaloinnista, jota Dkk1 normaalisti säätelee. Väitöskirjan toisessa osassa tutkittiin ei-kanonisen reitin Wnt5a ligandin roolia munuaisen kehityksessä käyttäen poistogeenistä hiirimallia, jossa Wnt5a:n roolia munuaisenkehityksessä ei ollut julkaistu työn aloituksen aikaan. Wnt5a:n puutoksen havaittiin vaikuttavan tyvikalvon järjestymiseen kokoojaputkissa ja munuaiskeräsessä. Tyvikalvon häiriö on todennäköisin syy morfologisiin muutoksiin, jotka vaihtelevat molempien munuaisen puuttumisesta kaksois-kokoojatiehyen muodostumiseen. Työssä osoitetaan ensimmäistä kertaa kuinka Wnt-signalointireitin proteiinit säätelevät munuaisen kehitystä tyvikalvon muodostuksen kautta.

No description available.

No description available.

No description available.

Das Pankreaskarzinom geht nach wie vor mit einer sehr schlechten Prognose und hohen Letalität einher. Es hat mit 9 % die niedrigste 5-Jahresüberlebensrate unter den Krebserkrankungen und liegt damit an 4. Stelle der durch Krebserkrankungen verursachten Todesfälle. Aktuell ist der einzig kurative Therapieansatz die operative Resektion mit anschließender Chemotherapie. Die molekulare Pathogenese gestaltet sich sehr vielseitig und komplex. WNT5A gehört zur Familie der WNT-Proteine, die wiederum zur Gruppe der Wachstumsfaktoren gehören und aktiviert abhängig vom zellulären Kontext und Rezeptorstatus unterschiedliche Signalkaskaden. Einer seiner möglichen Rezeptoren ist ROR2, der zusammen mit ROR1 eine Subgruppe der großen Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen bildet. Die Interaktion von WNT5A und ROR2 führt zur Aktivierung des sogenannten nicht-kanonischen β-Catenin unabhängigen Signalweges. Dieser wiederum hemmt den kanonischen β-Catenin abhängigen Signalweg, der für Tumorprogress bekannt und im Pankreaskarzinom aktiviert ist. Die Rolle von WNT5A und ROR2 in der Karzinogenese verschiedener Tumorentitäten ist kontrovers. In manchen Tumoren wird ihnen eine Rolle als Tumorsuppressor zugeschrieben, in anderen besitzen sie ein onkogenetisches Potential. Die Rolle von WNT5A und ROR2 im duktalen Adenokarzinom des Pankreas ist insgesamt wenig erforscht, vor allem in Hinsicht auf ihre klinische Relevanz. Ziel dieser Arbeit war es, die Expressionsmuster von WNT5A und ROR2 im duktalen Adenokarzinom des Pankreas zu beschreiben, das Patientenkollektiv zu charakterisieren und Zusammenhänge mit klinisch pathologischen Parametern und dem Gesamtüberleben zu finden. Es standen 117 Tumorproben zur Verfügung, die im Zeitraum vom 2001 bis 2013 am Universitätsklinikum Leipzig chirurgisch gewonnen und im Institut für Pathologie des Klinikums aufbewahrt wurden. Das Patientenkollektiv umfasste 72 Männer und 45 Frauen mit einem medianen Alter von 66 Jahren. Die angefertigten Schnitte wurden immunhistochemisch mit Antikörpern gegen WNT5A und ROR2 charakterisiert. Im Anschluss daran beurteilten drei unabhängige Gutachter den prozentualen Anteil der Färbung im Schnitt und dessen Intensität in jeweils Tumor, Stroma und gesundem Gewebe. Daraus wurde ein Score berechnet, der Werte von 0¬–300 einnehmen konnte. Ausgehend von einem Cut-off-Wert wurden die Ergebnisse der mikroskopischen Auswertung in negative und positive Expression eingeteilt und eine statistische Analyse angeschlossen. Die WNT5A-Färbung zeigte eine starke positive Expression im Tumor und gesunden Gewebe, jedoch nur eine geringe Expression im Stroma. Dabei unterschied sich die WNT5A-Expression von Tumor zu Stroma sowie gesundem Gewebe zu Stroma signifikant. Eine ausgeprägte positive Expression von ROR2 war ebenso im Tumor und gesundem Gewebe zu verzeichnen, wohingegen der Rezeptor im Stroma nur gering exprimiert war. Die ROR2 Expression unterschied sich zwischen Tumor und Stroma und gesundem Gewebe und Stroma ebenfalls signifikant. Die Korrelationsanalyse der Expressionsmuster von WNT5A und ROR2 mit klinisch pathologischen Parametern zeigte keine Signifikanzen. Die Überlebenszeitanalyse in Abhängigkeit von klinisch-pathologischen Parametern ergab eine prognostische Relevanz für T- und N-Kategorie, UICC-Stadium, Grading, Lymphgefäß- und Veneninvasion sowie das Rezidivauftreten in Form von Metastasen. In der Multivarianzanalyse konnten der Befall von Lymphknoten (pN1) und ein Grading vom Grad 3 als ungünstige unabhängige prognostische Faktoren identifiziert werden. Die Überlebenszeitanalyse in Abhängigkeit der ROR2 und auch WNT5A-Expression in Tumor, Stroma und gesundem Gewebe zeigte keine Signifikanz. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen insgesamt nur eine geringe klinische Relevanz von WNT5A, wohingegen in vitro-Untersuchungen ihm einen starken Einfluss in Hinsicht auf Migration, Proliferation und Invasionsverhalten zusprachen. ROR2 scheint vor allem im fortgeschrittenen Tumorstadium einen Einfluss auf das Überleben zu nehmen und durch eine positive Expression in Tumor und Stroma protektiv zu wirken. Denkbar wäre die durch seine Präsenz verstärkte Aktivierung des nicht-kanonischen Signalweges über WNT5A, die dann zur Hemmung des kanonischen Signalweges führen könnte. Um dieser Hypothese nachzugehen, sind weiterführende Untersuchungen unverzichtbar. Auch um die klinische Relevanz besser einschätzen zu können, sind größere Kollektive und umfassendere Analysen notwendig.

No description available.

Vertebrate development is regulated by cellular communication by mechanisms of cell fate and cell behavior. These crucial mechanisms are regulated by cellular signaling and in the case of cell fate, cellular signaling results in transcription of developmentally important genes. Communication between cells can also result in regulation of cell behavior by acting on cytoskeletal elements rather than nuclear factors. One of the cellular signals that regulate both cell fate and cell behavior is the family of Wnt signaling molecules. Wnt5a is one of 19 Wnt molecules and has been previously demonstrated to play critical roles in many important processes in embryonic development as well tumor suppression. Despite many studies that lend credence to a pathway that regulates cell behavior for Wnt5a rather than cell fate, the identity of the pathway(s) Wnt5a impinges upon remains unclear. Despite the possibility of Wnt5a signaling through multiple pathways, here, focus is given to the non-canonical Wnt signaling pathway, a pathway that regulates cell behavior, also known as the Wnt/Planar Cell Polarity (PCP) pathway. The involvement of Wnt5a in the Wnt/PCP pathway was demonstrated with a genetic approach: crossing Wnt5a heterozygous mice with mice heterozygous for a component of the Wnt/PCP pathway to uncover genetic interactions in vivo. Hence, Wnt5a X Looptail (Lp) (Wnt/PCP) heterozygous crosses have been performed. Double heterozygotes for this intercross did not exhibit a decrease in viable progeny as compared to the decreased numbers of Lp heterozygotes. These observations demonstrated a lack of genetic interaction between Wnt5a and the PCP pathway. Wnt5a mutants possess phenotypes associated with deficits in the Wnt/PCP pathway, namely convergent extension (CE) defects and neural tube closure defects. However, upon further investigation of the increased penetrance of craniorachischisis in Wnt5a-/-;Lp+/-, Wnt5a mutants do not display the characteristic broadening of the neural floor plate commonly associated with Lp-/-. This supports that Wnt5a and PCP signaling are parallel pathways that have converged to regulate different aspects of CE and neural tube closure. Despite the complexity of Wnt5a and its potential involvement in multiple pathways, dissection of this will explain the broad range of phenotypes observed.

The exact mechanisms that regulate limb outgrowth the mouse embryo are unknown. Although there are several models, we favor a hypothesis where cells become polarized by signals secreted from the AER which orient their cell migration and/or divisions causing limb outgrowth. Clonal analysis has provided a mechanism to study cell behavior. We have generated a targeting construct containing the Fgf8 inhibitor, Sprouty2, in order to generate mutant clones for behavioral analyses in the limb. In order to more effectively study clonal behavior we report the modification of a novel clonal analysis approach, exo-utero surgery. We have modified, enhanced and proven that this technique can be used successfully in mouse embryos in which we directly apply 4-OHtamoxifen to the limb to induce YFP or β-gal reporter genes in limb mesenchyme. Using this method, we can closely control the timing and location of the induced clones and observe cell behavior during embryonic limb development. Phenotypes of Wnt5a-/- and Ror2-/- exhibit shortened limbs suggesting they function in a similar pathway. Wnt5a and Ror have been found to "colocalize" in the growing limb bud and have also been shown to bind in vitro. Here we show preliminary results about Wnt5a and Ror2 in vivo association by immunoprecipitation of limb bud extracts.