Os fagócitos contêm uma nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase associada à membrana, que gera superóxido e outros reativos intermediários do oxigênio. Defeitos nesta oxidase em seres humanos resultam na doença granulomatosa crônica (DGC). Mutações próximas aos sítios de splicing que interferem com o processamento do RNA mensageiro, acarretando deleção de um ou mais exons, são cada vez mais freqüentes na literatura científica, nesses casos, os mecanismos moleculares que levam a DGC nem sempre são totalmente esclarecidos, assim como o efeito do IFN-g, seja sobre o processamento da mensagem ou estabilidade dos transcritos. Com base nessas informações o objetivo geral deste trabalho é investigar o efeito do IFN-g sobre a regulação do sistema NADPH oxidase fagocítico humano. Através dos resultados obtidos, não se pode constatar melhora na produção de ânions superóxido após o tratamento com IFN-g em pacientes com defeito de splicing, no entanto detectou-se aumento da expressão do gene CYBB através de PCR convencional e através de real-time PCR além de um aumento na marcação de proteínas do spliceossoma através do FAN. / Phagocytes have a nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase (NADPH) associated to plasmatic membrane that generates superoxide and other oxygen reactive intermediates. Defects on this oxidase in humans result in a disorder called Chronic Granulomatous Disease (CGD). Mutations next to splicing sites that interfere with the mRNA processing leading to deletion of one or more exons, are even more frequent on scientific literature, in these cases, the molecular mechanisms causing CGD are not always completetly clear, as well as the effect of IFN-g on the mRNA processing or on the stability of transcripts. Based on this information our aim is to investigate the effect of IFN-g on the regulation of the human NADPH oxidase phagocyte system.. With the obtained results it wasnt possible to see an increase in anion superoxide production after the IFN-g treatment in patients with splicing defects, however it was detected an increase on the expression of CYBB gene by conventional and real-time PCR besides an increase in the marking of spliceossomal proteins by FAN.

Em trabalho anterior, identificamos a mutação c.382C8594;T no gene UBE2A, localizado em Xq24 e codificador de enzima conjugadora de ubiquitina, como causa de nova síndrome de deficiência mental (DM) de herança ligada ao cromossomo X. Foi a primeira descrição de mutação nesse gene e a primeira associação de mutação em gene que codifica conjugase de ubiquitina com patologia humana. Neste trabalho, focalizamos o gene UBE2A quanto a expressão dos transcritos alternativos, função das isoformas por eles codificadas e o efeito da mutação c.382C 8594; T como causa de deficiência mental (DM). No Capítulo I, revisamos os aspectos genéticos da DM, dando ênfase à herança ligada ao cromossomo X, principal causa de DM herdada e resumimos o estudo que levou à identificação da mutação em UBE2A como causa de quadro sindrômico de DM. Revisamos o papel da via de ubiquitinação de proteínas e das enzimas que participam do processo, em especial as conjugases de ubiquitina. Levantamos evidências na literatura que não deixam dúvida sobre a importância da via de ubiquitinação no sistema nervoso, tanto em processos de neurodesenvolvimento como neurodegeneração. No Capítulo II, avaliamos a contribuição de mutações em UBE2A como causa de DM. Apresentamos os resultados do sequenciamento direto da região codificadora do gene UBE2A em afetados de 23 famílias em que a DM segrega ligada à segmento que inclui Xq24, onde está localizado o gene UBE2A. Uma dessas famílias foi averiguada no Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociência, USP (LGH-IB/USP), coordenado pelo Dr. Paulo A. Otto e pela Dra. Angela Vianna Morgante. As demais 22 famílias pertencem ao banco de amostras do Consórcio Europeu de Deficiência Mental (European Mental Retardation Consortium EURO-MRX). A triagem foi também realizada em um indivíduo afetado por DM sindrômica que compartilha características clínicas com nossos pacientes. Como acontece com a maioria dos genes do cromossomo X, o gene UBE2A não parece ser responsável por parcela significativa dos casos de DM, já que novas mutações em UBE2A não foram detectadas nessa triagem. Avaliamos o efeito da mutação c.382C 8594; T nos níveis da transcrição e da tradução em homem afetado e em mulher portadora. A presença da mutação que leva a um códon de parada prematura não resultou na degradação do RNA, que detectamos nas células do afetado. Já na mulher portadora, apenas o transcrito normal foi detectado, de acordo com nossos dados anteriores que mostraram desvio completo no padrão de inativação do cromossomo X nas portadoras da mutação, tendo um mesmo cromossomo X ativo nas células do sangue. A vantagem proliferativa das células em que o cromossomo X com alelo mutado estava inativo deve ter levado a esse padrão de inativação desviado do casual, evidenciando o efeito deletério da mutação. Entretanto, o mecanismo pelo qual a mutação afeta a via de UBE2A permanece interrogado. A proteína UBE2A alterada foi encontrada em baixa quantidade nas células do paciente, o que pode ser o resultado de síntese prejudicada ou de degradação pós-traducão. Independente do mecanismo responsável, o fato de apenas uma pequena quantidade da proteína mutada ter sido encontrada, nos permite afirmar que, nas células desses indivíduos, há perda de função de UBE2A. Devemos, contudo, considerar que a proteína mutada é sintetizada e que, no caso de a menor quantidade dever-se à degradação pós-tradução, esse processo pode prejudicar a homeostase celular e contribuir para o quadro clínico. O capítulo II focaliza os transcritos alternativos de UBE2A. Diversos bancos de dados apontam para a existência de três transcritos alternativos do gene UBE2A humano, mas não há trabalho científico que caracterize os tecidos em que os transcritos são expressos ou a função das proteínas por eles codificadas. A mutação c.382C 8594; T localiza-se no éxon 6 do gene, comum a todos os transcritos, de forma que, no caso de eles codificarem proteínas funcionais, a mutação comprometeria três proteínas, e não apenas uma. Demonstramos que os três transcritos de UBE2A são xpressos em leucócitos, pré-adipócitos, placenta, córtex cerebral e hipocampo humanos. Detectamos também os três transcritos nas células de sangue e pré-adipócitos de um de nossos pacientes portador da mutação c.382C 8594; T. Embora os bancos de dados apontem para a existência de apenas um transcrito de UBE2A em camundongos, identificamos um transcrito alternativo correspondente ao transcrito alternativo 3 humano. Este foi detectado inclusive em camundongos nocaute quanto ao gene UBE2A o processo de geração do animal nocaute foi realizado por recombinação homóloga em que o cassete de neomicina foi inserido no éxon 1 do gene, de maneira que não eliminou a existência do transcrito correspondente ao transcrito 3 humano, que utiliza uma 5 UTR alternativa localizada no íntron 3. Entretanto, as proteínas codificadas pelos transcritos alternativos não foram detectadas nos extratos protéicos analisados humanos e de camundongo. Esse resultado poderia ser explicado pela falta de especificidade do anticorpo utilizado ou por essas isoformas representarem pequena parcela do pool de proteínas da célula. Os anticorpos comerciais anti-RAD6 e anti-HR6A/HR6B foram produzidos após imunização de coelhos com a porção N-terminal da isoforma 1. Seria, portanto, possível que não fossem capazes de detectar as isoformas 2 e 3, em que o segmento utilizado para a produção dos anticorpos está total ou parcialmente ausente. No caso de as proteínas estarem pouco representadas na célula, experimentos de co-imunoprecipitação auxiliariam na identificação dessas isoformas nos extratos protéicos. Entretanto, para a detecção de todas as isoformas de UBE2A seria necessário anticorpo que reconhecesse a porção C-terminal de UBE2A. Em 2009, duas novas mutações em UBE2A foram descritas em estudo colaborativo realizado no Welcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, Reino Unido, após sequenciamento em larga escala de aproximadamente 700 genes do cromossomo X de cerca de 200 indivíduos com DM de herança ligada ao X. Ambas as mutações c.215C 8594; T e c.328C 8594; G eram do tipo missense. Não foram fornecidas informações quanto ao quadro clínico dos portadores dessas mutações e também não foi esclarecido porque apenas a alteração c.215C 8594; T que resulta na troca do resíduo de fenilalanina da posição 72 por um resíduo de serina (F72S) foi considerada pelos autores como possivelmente patogênica. Nossos estudos in vitro, apresentados no Capítulo III, sugerem que ambas as alterações afetam a função de UBE2A. Em 2010, foram publicados dois trabalhos associando novas alterações em UBE2A a quadro de DM. Honda e col. (2010) descreveram uma microdeleção em Xq24 que inclui UBE2A e outros oito genes, em um menino com DM e características também presentes em nossos pacientes. Budny e col. (2010) descreveram mutações missense em UBE2A em duas famílias em que segregava quadro de DM sindrômica semelhante ao de nossos pacientes. Por comunicação pessoal de Arjan de Brouwer (Departamento de Genética Humana da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda), soubemos da existência de três outras microdeleções de segmentos do cromossomo X que incluem UBE2A, em pacientes do sexo masculino, não aparentados. Comparamos as características clínicas de nossos pacientes com as dos portadores das microdeleções em Xq24 e com aquelas dos portadores de mutações missense em UBE2A. A DM grave e o comprometimento significativo ou ausência de fala são comuns a todos. Outras características como baixa estatura, sinófris, boca grande e lábios finos com comissuras voltadas para baixo, pescoço curto e largo, implantação baixa de cabelos na nuca, mamilos espaçados, pênis pequeno, hirsutismo generalizado e a ocorrência de convulsões parecem predominar. Entretanto, enquanto a microcefalia aparece em dois dos três portadores de microdeleções avaliados, a macrocefalia parece predominar no grupo em que ocorrem as mutações de ponto. No Capítulo III, abordamos estudos funcionais in vivo e in vitro para avaliar se as isoformas alternativas de UBE2A compartilham suas funções de conjugase de ubiquitina e compreender o efeito da mutação c.382C8594;T na função de UBE2A. Buscamos estabelecer modelo celular para avaliar o efeito da mutação na formação de neuritos. Trabalho previamente publicado havia demonstrado que a diferenciação neuronal de células PC12 concomitantemente com a inibição parcial do mRNA de UBE2B (parálogo de UBE2A) resultava na redução de 20-30% do comprimento de neuritos. Entretanto, nossos ensaios de diferenciação de pré-adipócitos não responderam nossas questões sobre o efeito da mutação na formação de neuritos, pois não conseguimos obter, nas células do controle ou nas do paciente, a densidade de neuritos descrita anteriormente na diferenciação de pré-adipócitos. Diferentemente das células PC12, de origem ectodérmica, os pré-adipócitos tem origem mesodérmica, o que dificulta sua diferenciação em linhagem derivada de outro folheto germinativo. A elevada conservação entre as proteínas ortólogas UBE2A e UBE2B humanas e RAD6 de levedura e a observação de que ambas as parálogas humanas são capazes de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de Saccharomyces cerevisiae nos levou a considerar a linhagem de levedura 916;rad6 como modelo para nossos estudos funcionais. Também, avaliamos a capacidade das isoformas 2 e 3 e da isoforma Q128X de UBE2A para ubiquitinar histonas H2A in vitro, conforme previamente descrito para a isoforma UBE2A/1. Os resultados dos ensaios in vivo indicam que apenas a expressão do transcito 1 de UBE2A é capaz de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de S. cerevisiae. A expressão dos transcritos 2 ou 3 não resulta na restituição do fenótipo de sensibilidade à UV - a expressão gera certa toxicidade, agravada quando as células são cultivadas a 37o C. Entretanto, as isoformas por eles codificadas não parecem ser estáveis na levedura: assim como nos tecidos humanos testados, não conseguimos detectá-las nos extratos protéicos das leveduras que expressavam esses transcritos. A expressão do transcrito 1 contendo a mutação c.382CT revelou que a isoforma UBE2A/Q128X, por sua vez, é estável na linhagem 916;rad6, porém, além de não restituir o fenótipo de sensibilidade à UV, foi, dentre as isoformas de UBE2A, a mais tóxica. Os fenótipos de toxicidade não foram observados após expressão em linhagem selvagem de S. cerevisiae. Esses resultados indicam que as isoformas 2 e 3 de UBE2A não apresentam atividade de conjugase de ubiquitina e que são, aparentemente, degradadas imediatamente após sua expressão em levedura. O fato de o fenótipo de toxicidade ser agravado, em condições de choque térmico, apóia a hipótese de degradação dessas isoformas, em levedura. A degradação pode ser resultado da ausência de parceiro que permita sua estabilidade, mas a ausência das isoformas também em extratos protéicos de tecidos humanos sugere que o mesmo processo de degradação ocorra em mamíferos. Segundo a classificação das E2, as diversas conjugases de ubiquitina têm em comum o domínio UBC altamente conservado e as variações observadas consistem em inserções ou extensões C-terminais, mas nunca deleções, como ocorre nas isoformas 2 e 3 de UBE2A. Os transcritos alternativos teriam, assim, função regulatória. Os ensaios in vitro confirmaram a capacidade de UBE2A/1 ubiquitinar histonas H2A. Os ensaios com UBE2A/2 e UBE2A/3 não foram conclusivos, uma vez que a incapacidade de ubiquitinação de histonas que observamos pode ter consequência da renaturação in vitro, que pode ter ocorrido prejudicando sua função. Entretanto a obtenção das isoformas puras nos permitiu verificar que, caso a isoforma 2 estivesse presente nos extratos de levedura, ela seria reconhecida pelo anticorpo anti-RAD6. Verificamos que a proteína mutada UBE2A/Q128X é capaz de interagir com a E1, da qual recebe a molécula de ubiquitina, mas não é capaz de transferi-la para a histona. O segmento C-terminal ausente nessa isoforma é, portanto, importante nesse processo. Os ensaios in vitro despertaram nossa atenção para o fenômeno de autoubiquitinação de UBE2A, possível mecanismo de autorregulação previamente considerado na literatura. O fato de alguns trabalhos sugerirem que as E2 atuem também como dímeros in vivo e in vitro e a elevada conservação entre as parálogas humanas UBE2A e UBE2B nos levaram a considerar a possibilidade de mecanismo de regulação recíproca. Dessa maneira, a degradação de UBE2A/Q128X nas células do paciente poderia ser dependente de UBE2B. A reduzida capacidade de autoubiquitinação da isoforma mutada dificultaria sua degradação e tornaria necessária a atividade da paráloga. Isso explicaria porque ela é estável quando expressa na linhagem de levedura 916;rad6, mas não nas células do paciente. A presença de RAD6 estaria diretamente relacionada à ausência de toxicidade após a expressão de UBE2A/Q128X em linhagem selvagem a degradação da isoforma mutada está ocorrendo nessas células. A não viabilidade de camundongo duplo-nocaute quanto as parálogas UBE2A e UBE2B não permite testar a estabilidade da isoforma mutada em células de mamíferos. Observamos, de fato, que a inibição do proteassoma nas células do paciente leva ao acúmulo dessa proteína. A presença da mutação c.382C8594;T nas células do paciente parece resultar no fenótipo de DM devido à perda de função de UBE2A: a isoforma mutada não restitui o fenótipo de sensibilidade à UV de S. cerevisiae e não foi capaz de ubiquitinar histonas H2A in vitro. Além disso, indivíduos com microdeleções de UBE2A apresentam fenótipo semelhante ao de nossos pacientes. Por outro lado, a presença da proteína mutada que necessitaria de UBE2B para ser degradada pode caracterizar um ganho tóxico de função - comprometeria a função de ambas as parálogas. É possível que os dois mecanismos contribuam para o quadro clínico. Os dados dos ensaios in vivo e in vitro abrem caminhos de investigação do processo de regulação de UBE2A e UBE2B no nível da proteína, sugerindo a autoubiquitinação e a ubiquitinaão recíproca como possíveis mecanismos reguladores, que podem explicar a conservação das duas parálogas de RAD6 em mamíferos. / We have previously described a nonsense mutation (c.382C8594;T) in the UBE2A gene, at Xq24, which encodes a ubiquitin conjugating enzyme (E2), as the cause of a new X-linked mental retardation syndrome. The predicted protein lacks the 25 C-terminal amino acid residues conserved in vertebrates and in Drosophila. This was the first description of a mutation in a ubiquitin conjugating enzyme gene causative of a human disease. In the present work, we focused on the UBE2A gene, its alternative transcripts and isoforms, and the effect of the c.382C8594;T mutation. We screened for UBE2A mutations 23 males presenting X-linked mental retardation (XLMR), previously mapped to the interval encompassing this gene, and one isolated case, who shared clinical features with our previously described patients. No mutations were detected in this selected series of patients suggesting that mutations in UBE2A is not a common cause of XLMR, similarly to the majority of the XLMR genes hereto described. Very recently four Xq24 microdeletions encompassing UBE2A and three missence mutations were found by other groups in mentally retarded males that shared several clinical features with our patients. Comparing these and our patients, a clinical picture emerges of mental retardation associated with severe speech impairment, present in all of them. Short stature, large mouth with downturned corners and thin lips, short and broad neck, low posterior hairline, widely spaced nipples, marked generalized hirsutism and seizures are common features. However, microcephaly was observed only in patients carrying UBE2A deletions, while carriers of missense or nonsense mutations showed macrocephaly. We evaluated the effect of the UBE2A c.382C8594;T mutation on transcription and translation. This mutation affects the last UBE2A exon and, as expected, does not lead to nonsense mediated RNA decay, demonstrated by the presence of UBE2A mRNA in leucocytes of an affected male. However, only a small amount of the mutated protein was detected in the patients cells, suggesting the loss of UBE2A function as the cause of the syndrome. The posttranslational degradation of the mutated protein could also disturb the cellular homeostasis, a gain of function that remained a possibility. The detrimental effect of the c.382C8594;T mutation was further supported by the presence of only the normal transcript in leucocytes of a heterozygous woman, who had completely skewed X inactivation, thus pointing to the selective advantage of lymphocytes carrying the normal allele on the active X chromosome. Our search in DNA and protein sequence databases suggested that the UBE2A gene produces three alternative transcripts all classified as protein coding. These three tanscripts contain the mutation site (c.382C8594;T). We showed that all three UBE2A transcripts are expressed in human leucocytes, adipocytes, placenta, cerebral cortex and hippocampus. We also detected an alternative transcript in murine, which corresponds to the human transcript 3. This alternative transcript was present in all murine tissues analyzed, including samples from a UBE2A knockout mouse. However, we failed to detect the proteins encoded by the alternative transcripts. This could result from low affinity of the used commercial antibody to the isoforms. Alternatively, a small amount of these proteins in the pool of cellular proteins, might have not been detected by Western blotting. We performed in vivo and in vitro assays to address the role of the alternative UBE2A isoforms, and to evaluate the effect of c.382C-T mutation on UBE2A function. Taking into account the high amino acid conservation between the human UBE2A and the Saccharomyces cerevisiae ortholog RAD6, we used a 916;rad6 yeast strain to verify whether UBE2A alternative and mutated isoforms were able to complement its UV-sensitivity phenotype, as previously demosntrated for UBE2A isoform 1. We also performed in vitro assays to evaluate their ubiquitination activity towards histone H2A, a known in vitro substrate of RAD6 and UBE2A. Only UBE2A isoform 1 could rescue the UV sensitivity phenotype of the knockout yeast strain. The expression of the alternative isoforms 2 and 3 was partially toxic to this yeast strain, and toxicity increased under heat shock conditions. However, these two isoforms do not seem to be stable in yeast cells: as in human tissues, we failed to detect UBE2A isoforms 2 and 3 in yeast cells expressing the corresponding transcripts. The mutant isoform was stable in yeast, but was unable to rescue the UV-sensitivity phenotype, its expression resulting in severe toxicity to the 916;rad6 strain. On the other hand, toxicity was not observed when the mutant UBE2A isoform was expressed in wild type yeast. These findings suggest that isoforms 2 and 3 do not have ubiquitin conjugating activity and, apparently, are degraded immediately after translation. The fact that toxicity is enhanced when these isoforms are expressed under heat shock conditions supports Degradation hypothesis. The degradation could also be due to the absence of a functional partner, in yeast, that could contribute to their stability. Since the alternative isoforms were not detected in the human tissues analyzed, the degradation might occur in human cells as well. E2 enzymes share a catalytic domain and variations among them consist of insertions or terminal extensions, never deletions. Both isoforms 2 and 3 would have deletions of the catalytic domain, suggesting that they are not functional. A regulatory role for these transcripts is a possibility. Our in vitro assays confirmed that UBE2A isoform 1 is capable of histone H2A ubiquitination. The assays for isoforms 2 and 3 were inconclusive, since their lack of ubiquitin conjugating activity could be caused by incorrect in vitro refolding, required because the proteins were obtained from bacterial inclusion bodies after heterologous expression. The mutated protein, however, was able to interact with the ubiquitin molecule, but failed to transfer it to histones, thus pointing to the importance of the C-terminal segment in this process. Our in vitro assays stongly suggested that UBE2A autoubiquitination occur, an activity previously considered a possible E2 regulatory mechanism. Since there is evidence that some E2s form functional dimers, we hypothesized that, due to their high amino acid conservation, UBE2A and its paralog UBE2B might form heterodimers in vivo, as a mutual regulating mechanism. Under this hypothesis, the degradation of the mutated protein could be UBE2B dependent. The reduced autoubiquitination capacity of the mutated isoform could impair its degradation, and require the participation or the paralog. This would explain why the mutated protein was stable in the 916;rad6 yeast strain, but not in the patient´s cells with a functional UBE2B. Following the same reasoning, in wild type yeast, the presence of RAD6 would explain the absence of the mutated protein and toxicity. The non-viability of the double (UBE2A and UBE2B) knockout cells prevented testing whether the mutated protein was stable in the absence of its paralog. However, proteasome inhibition in cultured cells from one of our patients resulted in accumulation of the mutated protein, confirming its degradion via the ubiquitin-proteasome pathway. In conclusion, the UBE2A c.382C8594;T mutation seems to lead to mental retardation in our patients due to loss of UBE2A function: the mutated isoform is unable to rescue the UV-sensitivity phenotype of 916;rad6 yeast or to ubiquitinate histones in vitro. In addition, patients carrying UBE2A deletions share clinical manifestations with our patients. On the other hand, the possibility remains of a clinical effect of the requirement of UBE2B for degrading the mutated UBE2A. Our data suggest reciprocal ubiquitination in addition to autoubiquitination as UBE2A and UBE2B regulatory mechanism that would explain the conservation of the two paralog genes in mammals.

O sistema NADPH oxidase humano é responsável pela geração de reativos intermediários do oxigênio e defeitos neste sistema resultam na Doença Granulomatosa Crônica (DGC). Nesta tese de doutorado, investigamos o efeito do IFN-g sobre eventos pós-transcricionais em pacientes com DGC ligada ao X, ocasionada por defeitos de splicing. Os dados obtidos sugerem que o uso do IFN-g in vitro interfere no processamento da mensagem causando aumento da expressão de transcritos do gene CYBB e NCF1 em células B-EBV de indivíduos sadios e pacientes DGC analisados. Observamos também que o IFN-g dimunui a expressão dos genes THOC4 NONO, SF3A1, SRRM1 e UPF3A e promove aumento de expressão de SRSF10, SNRPA1 e C2 em células B-EBV de paciente X-DGC secundária a defeitos de splicing. Identificamos que o IFN-g e o TNF-α aumentam a expressão das proteínas envolvidas no processo do splicing. Concluímos que o IFN-g aumenta a expressão de genes importantes para uma resposta eficiente do sistema imunológico, incluindo os do sistema NADPH oxidase, além de promover aumento da expressão de genes e de proteínas relacionados ao processo de splicing, que podem estar relacionados aos efeitos benéficos observados no uso do IFN-g em pacientes com DGC ligada ao X, ocasionada por defeitos de splicing. / The human phagocyte NADPH oxidase is responsible for the generation of reactive oxygen intermediates and defects in this system result in Chronic Granulomatous Disease (CGD). In this PhD Thesis, we investigated the effect of IFN-g on post-transcriptional events in normal individuals and patients with X-linked CGD, caused by splicing defects. The obtained data suggests that the use of IFN-g in vitro interferes in the message processing causing an increase of expression of CYBB and NCF1 gene transcripts in B-EBV cells of healthy individuals and analyzed CGD patients. We also observed that IFN-g decreases the expression of THOC4, NONO, SF3A1, SRRM1 and UPF3A, and increases the expression of SRSF10, SNRPA1 and C2 genes in cells from X-CGD patients, due to splicing defects. We identified that IFN-g and TNF-α induce expression of proteins involved in the splicing process. We conclude that IFN-g increases the expression of important genes for an effective immune response, including the NADPH oxidase system genes, and promotes augment of gene and protein expression related to the splicing process, which may be related to the beneficial effects related to the use of IFN-g in CGD patient caused by splicing defects.

Este trabalho teve o objetivo de identificar genes candidatos para deficiência mental de herança ligada ao cromossomo X (DMLX). Foram investigadas quatro famílias, nas quais a deficiência mental de causa desconhecida segregava num padrão típico de herança ligada ao X, e 24 irmandades que incluíam pelo menos dois afetados do sexo masculino. O padrão de inativação do cromossomo X foi determinado nas mães dos afetados, pois desvios extremos no padrão de inativação são frequentes em mulheres portadoras de mutações no cromossomo X que causam DMLX. Nas famílias com padrão de herança ligada ao X, a deficiência mental foi mapeada, usando marcadores moleculares do tipo microssatélite, localizados ao longo do cromossomo X. Desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos foram investigados por hibridação genômica comparativa baseada em array (array-CGH). Genes candidatos posicionais que já haviam sido associados a deficiência mental foram sequenciados pelo método de Sanger, em busca de mutações patogênicas. Em três famílias com DMLX, o probando teve seu exoma sequenciado. Nas três famílias com DMLX em que o sequenciamento do exoma foi realizado, foram detectadas mutações missense, levando à substituição de resíduos de aminoácidos conservados, que segregavam com a deficiência mental. Essas mutações foram consideradas como prováveis causas dos fenótipos nessas famílias: c.12378C>G no gene HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase); c.1413C>A no gene SHROOM4 (shroom family member 4) e c.262G>A no gene KIAA2022. As mulheres heterozigóticas quanto a essas mutações apresentaram desvio completo de inativação do cromossomo X (100:0). Mutações de ponto ou interrupção desses genes por rearranjos cromossômicos foram previamente descritas em alguns pacientes com deficiência mental. Em uma família, em que a DMLX estava associada a microcefalia e malformação de Dandy-Walker, uma microduplicação de aproximadamente 300 kb em Xq28 (ChrX :153,578,110-153,880,794;Hg19) foi detectada segregando com a doença. As mulheres heterozigóticas quanto a essa duplicação apresentaram desvios de inativação do X (80:20 e 90:10). Duplicações semelhantes foram anteriormente descritas em três famílias europeias e em um caso esporádico; a malformação de Dandy-Walker foi documentada em alguns desses pacientes. No estudo das 24 irmandades com pelo menos dois indivíduos do sexo masculino apresentando deficiência mental, o padrão de inativação do cromossomo X de suas mães foi determinado. Quatro mulheres (16,7%) apresentaram desvio total de inativação do cromossomo X (100:0), frequência significativamente maior do que a descrita para população geral de mulheres adultas (cerca de 2 %). Considerando que desvios extremos de inativação do cromossomo X são observados em aproximadamente 30% das portadoras de mutações que causam DMLX, concluiu-se que as quatro mães de homens que apresentam deficiência mental eram provavelmente portadores de mutações no cromossomo X, causadoras da deficiência mental em seus filhos. Não foram encontradas microdeleções ou microduplicações no cromossomo X nos probandos das quatro irmandades. / This study aimed at identifying candidate genes for X-linked intellectual disability (ID). Four families in which ID of unknown cause segregated as an X-linked trait, and 24 sibships with at least two affected males were investigated. The pattern of X-inactivation was determined in the mothers of affected males, taking into account that extremely skewing of X-inactivation is frequently found in women carrying mutations causative of X-linked intellectual disability (XLID). In the XLID families, ID was mapped by the genotyping of microsatellite markers localized throughout the X chromosome. Cryptic X-chromosome imbalances were investigated by array-based comparative genomic hybridization (a-CGH). Positional candidate genes that had been associated with ID were directly sequenced in the search for causative mutations. In three XLID families, the propositus had their exome sequenced. In three XLID families missense mutations that led to substitutions of conservative aminoacid residues were found that segregated with ID, and were probably causative of the clinical phenotypes: c.12378C>G in HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase) gene; c.1413C>A in the SHROOM4 (shroom family member 4) gene; c.262G>A in the KIAA2022 gene. Heterozygotes for these mutations had completely skewed X-inactivation (100:0 inactivation ratio). Point mutations or disruption of these genes by rearrangement breakpoints have been previously described in a few patients with ID. In one family in which XLID was associated with microcephaly and Dandy-Walker malformation, a duplication of approximately 300 kb at Xq28 (ChrX:153,578,110-153,880,794 - Hg19) was found segregating with the disease. Heterozygotes for this duplication had skewed X-inactivation (80:20 and 90:10 inactivation ratios). Similar duplications have been described in three European families and one sporadic case, Dandy-Walker malformation being documented in some patients. In the study of the 24 sibships with at least two males presenting with ID, the maternal pattern of X-inactivation was determined. Four women (16.7%) showed completely skewing of X-inactivation (100:0 inactivation ratio), a frequency significantly higher than the reported frequency of skewing >= 95% in women from the general population (about 2%). Considering this finding and that extremely skewed X-inactivation have been reported in about 30% of carriers of mutations causing XLID, it was assumed that the four mothers of males presenting with ID were most probably carriers of the mutations causative of ID in their sons. Chromosome X microimbalances were not found in the propositus, in these four sibships.

The first part of the thesis describes a systematic function analysis that identified in vitro E2 partners for ten different HECT E3 ligase proteins. Using mass spectrometry, the linkage composition for the resulting autoubiquitylation products of a number of functional E2-HECT pairs was determined. HECT domains from different subfamilies catalyze the formation of very different types of Ub chains, largely independent of the E2 in the reaction. The second part of the thesis describes the characterization of the RAD6-interactome. Using affinity purification coupled with mass spectrometry, I identified a novel RAD6-interacting E3 ligase, KCMF1, which binds to a different surface on RAD6 than the other RAD6-associated E3 ligases. KCMF1 also recruits additional proteins to RAD6, and this new complex points to novel RAD6 functions. Interestingly, the RAD6A R11Q mutant polypeptide, found in X-linked mental retardation patients specifically loses the interaction with KCMF1, but not with other RAD6-associated E3 ligases.

The first part of the thesis describes a systematic function analysis that identified in vitro E2 partners for ten different HECT E3 ligase proteins. Using mass spectrometry, the linkage composition for the resulting autoubiquitylation products of a number of functional E2-HECT pairs was determined. HECT domains from different subfamilies catalyze the formation of very different types of Ub chains, largely independent of the E2 in the reaction. The second part of the thesis describes the characterization of the RAD6-interactome. Using affinity purification coupled with mass spectrometry, I identified a novel RAD6-interacting E3 ligase, KCMF1, which binds to a different surface on RAD6 than the other RAD6-associated E3 ligases. KCMF1 also recruits additional proteins to RAD6, and this new complex points to novel RAD6 functions. Interestingly, the RAD6A R11Q mutant polypeptide, found in X-linked mental retardation patients specifically loses the interaction with KCMF1, but not with other RAD6-associated E3 ligases.

X-linked myopathy with excessive autophagy (XMEA) is a skeletal muscle disorder inherited in recessive fashion, affecting boys and sparing carrier females. Onset is in childhood with weakness of the proximal muscles of the lower extremities, progressing slowly to involve other muscle groups. Pathological analysis of skeletal muscle biopsies shows no inflammation, necrosis or apoptosis. Instead, forty to 80% of fibers exhibit giant autophagic vacuoles with heterogeneous degradative content. Numerous critical functions of all cells are compartmentalized in particular pH environments established by the intracellular transmembrane V-ATPase proton pump complex. Assembly of this complex, directed by the Vma21p chaperone, is well-studied in yeast but completely unknown in other organisms. The aim of my project was a better understanding of XMEA pathogenesis, with a focus on finding the disease-causing gene. In this thesis, I identify mutations in XMEA patients in a novel, previously uncharacterized gene, which we name VMA21. Most of the mutations are located in splicing-relevant positions and decrease splicing efficiency. After establishing that XMEA is caused by hypomorphic alleles of the VMA21 gene, I show that VMA21 is the diverged human orthologue of the yeast Vma21p protein, and that like Vma21p, it is an essential assembly chaperone of the V-ATPase. Decreased VMA21 reduces V-ATPase activity, resulting in altered lysosomal pH and a blockage at the degradative step of autophagy. Towards understanding disease pathogenesis, I show evidence of compensatory autophagy upregulation consecutive to the impaired clearance. Accumulated autolysosomes due to increased autophagy continue to face the degradative block and are slow to disappear. Instead, they merge to each other and form the characteristic giant XMEA vacuoles. These results uncover a novel mechanism of disease, namely macroautophagic overcompensation leading to cell vacuolation and tissue atrophy. This work describes the clinical outcome at the cusp of tolerable reduction in V-ATPase, with implications on common diseases like osteoporosis and cancer metastasis, where increased V-ATPase activity is an important component. Our XMEA patients show that the safety margin of reducing V-ATPase activity in humans is wide, increasing the potential to utilize chemical or biological V-ATPase inhibitors as possible therapies.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.

Em trabalho anterior, identificamos a mutação c.382C8594;T no gene UBE2A, localizado em Xq24 e codificador de enzima conjugadora de ubiquitina, como causa de nova síndrome de deficiência mental (DM) de herança ligada ao cromossomo X. Foi a primeira descrição de mutação nesse gene e a primeira associação de mutação em gene que codifica conjugase de ubiquitina com patologia humana. Neste trabalho, focalizamos o gene UBE2A quanto a expressão dos transcritos alternativos, função das isoformas por eles codificadas e o efeito da mutação c.382C 8594; T como causa de deficiência mental (DM). No Capítulo I, revisamos os aspectos genéticos da DM, dando ênfase à herança ligada ao cromossomo X, principal causa de DM herdada e resumimos o estudo que levou à identificação da mutação em UBE2A como causa de quadro sindrômico de DM. Revisamos o papel da via de ubiquitinação de proteínas e das enzimas que participam do processo, em especial as conjugases de ubiquitina. Levantamos evidências na literatura que não deixam dúvida sobre a importância da via de ubiquitinação no sistema nervoso, tanto em processos de neurodesenvolvimento como neurodegeneração. No Capítulo II, avaliamos a contribuição de mutações em UBE2A como causa de DM. Apresentamos os resultados do sequenciamento direto da região codificadora do gene UBE2A em afetados de 23 famílias em que a DM segrega ligada à segmento que inclui Xq24, onde está localizado o gene UBE2A. Uma dessas famílias foi averiguada no Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociência, USP (LGH-IB/USP), coordenado pelo Dr. Paulo A. Otto e pela Dra. Angela Vianna Morgante. As demais 22 famílias pertencem ao banco de amostras do Consórcio Europeu de Deficiência Mental (European Mental Retardation Consortium EURO-MRX). A triagem foi também realizada em um indivíduo afetado por DM sindrômica que compartilha características clínicas com nossos pacientes. Como acontece com a maioria dos genes do cromossomo X, o gene UBE2A não parece ser responsável por parcela significativa dos casos de DM, já que novas mutações em UBE2A não foram detectadas nessa triagem. Avaliamos o efeito da mutação c.382C 8594; T nos níveis da transcrição e da tradução em homem afetado e em mulher portadora. A presença da mutação que leva a um códon de parada prematura não resultou na degradação do RNA, que detectamos nas células do afetado. Já na mulher portadora, apenas o transcrito normal foi detectado, de acordo com nossos dados anteriores que mostraram desvio completo no padrão de inativação do cromossomo X nas portadoras da mutação, tendo um mesmo cromossomo X ativo nas células do sangue. A vantagem proliferativa das células em que o cromossomo X com alelo mutado estava inativo deve ter levado a esse padrão de inativação desviado do casual, evidenciando o efeito deletério da mutação. Entretanto, o mecanismo pelo qual a mutação afeta a via de UBE2A permanece interrogado. A proteína UBE2A alterada foi encontrada em baixa quantidade nas células do paciente, o que pode ser o resultado de síntese prejudicada ou de degradação pós-traducão. Independente do mecanismo responsável, o fato de apenas uma pequena quantidade da proteína mutada ter sido encontrada, nos permite afirmar que, nas células desses indivíduos, há perda de função de UBE2A. Devemos, contudo, considerar que a proteína mutada é sintetizada e que, no caso de a menor quantidade dever-se à degradação pós-tradução, esse processo pode prejudicar a homeostase celular e contribuir para o quadro clínico. O capítulo II focaliza os transcritos alternativos de UBE2A. Diversos bancos de dados apontam para a existência de três transcritos alternativos do gene UBE2A humano, mas não há trabalho científico que caracterize os tecidos em que os transcritos são expressos ou a função das proteínas por eles codificadas. A mutação c.382C 8594; T localiza-se no éxon 6 do gene, comum a todos os transcritos, de forma que, no caso de eles codificarem proteínas funcionais, a mutação comprometeria três proteínas, e não apenas uma. Demonstramos que os três transcritos de UBE2A são xpressos em leucócitos, pré-adipócitos, placenta, córtex cerebral e hipocampo humanos. Detectamos também os três transcritos nas células de sangue e pré-adipócitos de um de nossos pacientes portador da mutação c.382C 8594; T. Embora os bancos de dados apontem para a existência de apenas um transcrito de UBE2A em camundongos, identificamos um transcrito alternativo correspondente ao transcrito alternativo 3 humano. Este foi detectado inclusive em camundongos nocaute quanto ao gene UBE2A o processo de geração do animal nocaute foi realizado por recombinação homóloga em que o cassete de neomicina foi inserido no éxon 1 do gene, de maneira que não eliminou a existência do transcrito correspondente ao transcrito 3 humano, que utiliza uma 5 UTR alternativa localizada no íntron 3. Entretanto, as proteínas codificadas pelos transcritos alternativos não foram detectadas nos extratos protéicos analisados humanos e de camundongo. Esse resultado poderia ser explicado pela falta de especificidade do anticorpo utilizado ou por essas isoformas representarem pequena parcela do pool de proteínas da célula. Os anticorpos comerciais anti-RAD6 e anti-HR6A/HR6B foram produzidos após imunização de coelhos com a porção N-terminal da isoforma 1. Seria, portanto, possível que não fossem capazes de detectar as isoformas 2 e 3, em que o segmento utilizado para a produção dos anticorpos está total ou parcialmente ausente. No caso de as proteínas estarem pouco representadas na célula, experimentos de co-imunoprecipitação auxiliariam na identificação dessas isoformas nos extratos protéicos. Entretanto, para a detecção de todas as isoformas de UBE2A seria necessário anticorpo que reconhecesse a porção C-terminal de UBE2A. Em 2009, duas novas mutações em UBE2A foram descritas em estudo colaborativo realizado no Welcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, Reino Unido, após sequenciamento em larga escala de aproximadamente 700 genes do cromossomo X de cerca de 200 indivíduos com DM de herança ligada ao X. Ambas as mutações c.215C 8594; T e c.328C 8594; G eram do tipo missense. Não foram fornecidas informações quanto ao quadro clínico dos portadores dessas mutações e também não foi esclarecido porque apenas a alteração c.215C 8594; T que resulta na troca do resíduo de fenilalanina da posição 72 por um resíduo de serina (F72S) foi considerada pelos autores como possivelmente patogênica. Nossos estudos in vitro, apresentados no Capítulo III, sugerem que ambas as alterações afetam a função de UBE2A. Em 2010, foram publicados dois trabalhos associando novas alterações em UBE2A a quadro de DM. Honda e col. (2010) descreveram uma microdeleção em Xq24 que inclui UBE2A e outros oito genes, em um menino com DM e características também presentes em nossos pacientes. Budny e col. (2010) descreveram mutações missense em UBE2A em duas famílias em que segregava quadro de DM sindrômica semelhante ao de nossos pacientes. Por comunicação pessoal de Arjan de Brouwer (Departamento de Genética Humana da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda), soubemos da existência de três outras microdeleções de segmentos do cromossomo X que incluem UBE2A, em pacientes do sexo masculino, não aparentados. Comparamos as características clínicas de nossos pacientes com as dos portadores das microdeleções em Xq24 e com aquelas dos portadores de mutações missense em UBE2A. A DM grave e o comprometimento significativo ou ausência de fala são comuns a todos. Outras características como baixa estatura, sinófris, boca grande e lábios finos com comissuras voltadas para baixo, pescoço curto e largo, implantação baixa de cabelos na nuca, mamilos espaçados, pênis pequeno, hirsutismo generalizado e a ocorrência de convulsões parecem predominar. Entretanto, enquanto a microcefalia aparece em dois dos três portadores de microdeleções avaliados, a macrocefalia parece predominar no grupo em que ocorrem as mutações de ponto. No Capítulo III, abordamos estudos funcionais in vivo e in vitro para avaliar se as isoformas alternativas de UBE2A compartilham suas funções de conjugase de ubiquitina e compreender o efeito da mutação c.382C8594;T na função de UBE2A. Buscamos estabelecer modelo celular para avaliar o efeito da mutação na formação de neuritos. Trabalho previamente publicado havia demonstrado que a diferenciação neuronal de células PC12 concomitantemente com a inibição parcial do mRNA de UBE2B (parálogo de UBE2A) resultava na redução de 20-30% do comprimento de neuritos. Entretanto, nossos ensaios de diferenciação de pré-adipócitos não responderam nossas questões sobre o efeito da mutação na formação de neuritos, pois não conseguimos obter, nas células do controle ou nas do paciente, a densidade de neuritos descrita anteriormente na diferenciação de pré-adipócitos. Diferentemente das células PC12, de origem ectodérmica, os pré-adipócitos tem origem mesodérmica, o que dificulta sua diferenciação em linhagem derivada de outro folheto germinativo. A elevada conservação entre as proteínas ortólogas UBE2A e UBE2B humanas e RAD6 de levedura e a observação de que ambas as parálogas humanas são capazes de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de Saccharomyces cerevisiae nos levou a considerar a linhagem de levedura 916;rad6 como modelo para nossos estudos funcionais. Também, avaliamos a capacidade das isoformas 2 e 3 e da isoforma Q128X de UBE2A para ubiquitinar histonas H2A in vitro, conforme previamente descrito para a isoforma UBE2A/1. Os resultados dos ensaios in vivo indicam que apenas a expressão do transcito 1 de UBE2A é capaz de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de S. cerevisiae. A expressão dos transcritos 2 ou 3 não resulta na restituição do fenótipo de sensibilidade à UV - a expressão gera certa toxicidade, agravada quando as células são cultivadas a 37o C. Entretanto, as isoformas por eles codificadas não parecem ser estáveis na levedura: assim como nos tecidos humanos testados, não conseguimos detectá-las nos extratos protéicos das leveduras que expressavam esses transcritos. A expressão do transcrito 1 contendo a mutação c.382CT revelou que a isoforma UBE2A/Q128X, por sua vez, é estável na linhagem 916;rad6, porém, além de não restituir o fenótipo de sensibilidade à UV, foi, dentre as isoformas de UBE2A, a mais tóxica. Os fenótipos de toxicidade não foram observados após expressão em linhagem selvagem de S. cerevisiae. Esses resultados indicam que as isoformas 2 e 3 de UBE2A não apresentam atividade de conjugase de ubiquitina e que são, aparentemente, degradadas imediatamente após sua expressão em levedura. O fato de o fenótipo de toxicidade ser agravado, em condições de choque térmico, apóia a hipótese de degradação dessas isoformas, em levedura. A degradação pode ser resultado da ausência de parceiro que permita sua estabilidade, mas a ausência das isoformas também em extratos protéicos de tecidos humanos sugere que o mesmo processo de degradação ocorra em mamíferos. Segundo a classificação das E2, as diversas conjugases de ubiquitina têm em comum o domínio UBC altamente conservado e as variações observadas consistem em inserções ou extensões C-terminais, mas nunca deleções, como ocorre nas isoformas 2 e 3 de UBE2A. Os transcritos alternativos teriam, assim, função regulatória. Os ensaios in vitro confirmaram a capacidade de UBE2A/1 ubiquitinar histonas H2A. Os ensaios com UBE2A/2 e UBE2A/3 não foram conclusivos, uma vez que a incapacidade de ubiquitinação de histonas que observamos pode ter consequência da renaturação in vitro, que pode ter ocorrido prejudicando sua função. Entretanto a obtenção das isoformas puras nos permitiu verificar que, caso a isoforma 2 estivesse presente nos extratos de levedura, ela seria reconhecida pelo anticorpo anti-RAD6. Verificamos que a proteína mutada UBE2A/Q128X é capaz de interagir com a E1, da qual recebe a molécula de ubiquitina, mas não é capaz de transferi-la para a histona. O segmento C-terminal ausente nessa isoforma é, portanto, importante nesse processo. Os ensaios in vitro despertaram nossa atenção para o fenômeno de autoubiquitinação de UBE2A, possível mecanismo de autorregulação previamente considerado na literatura. O fato de alguns trabalhos sugerirem que as E2 atuem também como dímeros in vivo e in vitro e a elevada conservação entre as parálogas humanas UBE2A e UBE2B nos levaram a considerar a possibilidade de mecanismo de regulação recíproca. Dessa maneira, a degradação de UBE2A/Q128X nas células do paciente poderia ser dependente de UBE2B. A reduzida capacidade de autoubiquitinação da isoforma mutada dificultaria sua degradação e tornaria necessária a atividade da paráloga. Isso explicaria porque ela é estável quando expressa na linhagem de levedura 916;rad6, mas não nas células do paciente. A presença de RAD6 estaria diretamente relacionada à ausência de toxicidade após a expressão de UBE2A/Q128X em linhagem selvagem a degradação da isoforma mutada está ocorrendo nessas células. A não viabilidade de camundongo duplo-nocaute quanto as parálogas UBE2A e UBE2B não permite testar a estabilidade da isoforma mutada em células de mamíferos. Observamos, de fato, que a inibição do proteassoma nas células do paciente leva ao acúmulo dessa proteína. A presença da mutação c.382C8594;T nas células do paciente parece resultar no fenótipo de DM devido à perda de função de UBE2A: a isoforma mutada não restitui o fenótipo de sensibilidade à UV de S. cerevisiae e não foi capaz de ubiquitinar histonas H2A in vitro. Além disso, indivíduos com microdeleções de UBE2A apresentam fenótipo semelhante ao de nossos pacientes. Por outro lado, a presença da proteína mutada que necessitaria de UBE2B para ser degradada pode caracterizar um ganho tóxico de função - comprometeria a função de ambas as parálogas. É possível que os dois mecanismos contribuam para o quadro clínico. Os dados dos ensaios in vivo e in vitro abrem caminhos de investigação do processo de regulação de UBE2A e UBE2B no nível da proteína, sugerindo a autoubiquitinação e a ubiquitinaão recíproca como possíveis mecanismos reguladores, que podem explicar a conservação das duas parálogas de RAD6 em mamíferos. / We have previously described a nonsense mutation (c.382C8594;T) in the UBE2A gene, at Xq24, which encodes a ubiquitin conjugating enzyme (E2), as the cause of a new X-linked mental retardation syndrome. The predicted protein lacks the 25 C-terminal amino acid residues conserved in vertebrates and in Drosophila. This was the first description of a mutation in a ubiquitin conjugating enzyme gene causative of a human disease. In the present work, we focused on the UBE2A gene, its alternative transcripts and isoforms, and the effect of the c.382C8594;T mutation. We screened for UBE2A mutations 23 males presenting X-linked mental retardation (XLMR), previously mapped to the interval encompassing this gene, and one isolated case, who shared clinical features with our previously described patients. No mutations were detected in this selected series of patients suggesting that mutations in UBE2A is not a common cause of XLMR, similarly to the majority of the XLMR genes hereto described. Very recently four Xq24 microdeletions encompassing UBE2A and three missence mutations were found by other groups in mentally retarded males that shared several clinical features with our patients. Comparing these and our patients, a clinical picture emerges of mental retardation associated with severe speech impairment, present in all of them. Short stature, large mouth with downturned corners and thin lips, short and broad neck, low posterior hairline, widely spaced nipples, marked generalized hirsutism and seizures are common features. However, microcephaly was observed only in patients carrying UBE2A deletions, while carriers of missense or nonsense mutations showed macrocephaly. We evaluated the effect of the UBE2A c.382C8594;T mutation on transcription and translation. This mutation affects the last UBE2A exon and, as expected, does not lead to nonsense mediated RNA decay, demonstrated by the presence of UBE2A mRNA in leucocytes of an affected male. However, only a small amount of the mutated protein was detected in the patients cells, suggesting the loss of UBE2A function as the cause of the syndrome. The posttranslational degradation of the mutated protein could also disturb the cellular homeostasis, a gain of function that remained a possibility. The detrimental effect of the c.382C8594;T mutation was further supported by the presence of only the normal transcript in leucocytes of a heterozygous woman, who had completely skewed X inactivation, thus pointing to the selective advantage of lymphocytes carrying the normal allele on the active X chromosome. Our search in DNA and protein sequence databases suggested that the UBE2A gene produces three alternative transcripts all classified as protein coding. These three tanscripts contain the mutation site (c.382C8594;T). We showed that all three UBE2A transcripts are expressed in human leucocytes, adipocytes, placenta, cerebral cortex and hippocampus. We also detected an alternative transcript in murine, which corresponds to the human transcript 3. This alternative transcript was present in all murine tissues analyzed, including samples from a UBE2A knockout mouse. However, we failed to detect the proteins encoded by the alternative transcripts. This could result from low affinity of the used commercial antibody to the isoforms. Alternatively, a small amount of these proteins in the pool of cellular proteins, might have not been detected by Western blotting. We performed in vivo and in vitro assays to address the role of the alternative UBE2A isoforms, and to evaluate the effect of c.382C-T mutation on UBE2A function. Taking into account the high amino acid conservation between the human UBE2A and the Saccharomyces cerevisiae ortholog RAD6, we used a 916;rad6 yeast strain to verify whether UBE2A alternative and mutated isoforms were able to complement its UV-sensitivity phenotype, as previously demosntrated for UBE2A isoform 1. We also performed in vitro assays to evaluate their ubiquitination activity towards histone H2A, a known in vitro substrate of RAD6 and UBE2A. Only UBE2A isoform 1 could rescue the UV sensitivity phenotype of the knockout yeast strain. The expression of the alternative isoforms 2 and 3 was partially toxic to this yeast strain, and toxicity increased under heat shock conditions. However, these two isoforms do not seem to be stable in yeast cells: as in human tissues, we failed to detect UBE2A isoforms 2 and 3 in yeast cells expressing the corresponding transcripts. The mutant isoform was stable in yeast, but was unable to rescue the UV-sensitivity phenotype, its expression resulting in severe toxicity to the 916;rad6 strain. On the other hand, toxicity was not observed when the mutant UBE2A isoform was expressed in wild type yeast. These findings suggest that isoforms 2 and 3 do not have ubiquitin conjugating activity and, apparently, are degraded immediately after translation. The fact that toxicity is enhanced when these isoforms are expressed under heat shock conditions supports Degradation hypothesis. The degradation could also be due to the absence of a functional partner, in yeast, that could contribute to their stability. Since the alternative isoforms were not detected in the human tissues analyzed, the degradation might occur in human cells as well. E2 enzymes share a catalytic domain and variations among them consist of insertions or terminal extensions, never deletions. Both isoforms 2 and 3 would have deletions of the catalytic domain, suggesting that they are not functional. A regulatory role for these transcripts is a possibility. Our in vitro assays confirmed that UBE2A isoform 1 is capable of histone H2A ubiquitination. The assays for isoforms 2 and 3 were inconclusive, since their lack of ubiquitin conjugating activity could be caused by incorrect in vitro refolding, required because the proteins were obtained from bacterial inclusion bodies after heterologous expression. The mutated protein, however, was able to interact with the ubiquitin molecule, but failed to transfer it to histones, thus pointing to the importance of the C-terminal segment in this process. Our in vitro assays stongly suggested that UBE2A autoubiquitination occur, an activity previously considered a possible E2 regulatory mechanism. Since there is evidence that some E2s form functional dimers, we hypothesized that, due to their high amino acid conservation, UBE2A and its paralog UBE2B might form heterodimers in vivo, as a mutual regulating mechanism. Under this hypothesis, the degradation of the mutated protein could be UBE2B dependent. The reduced autoubiquitination capacity of the mutated isoform could impair its degradation, and require the participation or the paralog. This would explain why the mutated protein was stable in the 916;rad6 yeast strain, but not in the patient´s cells with a functional UBE2B. Following the same reasoning, in wild type yeast, the presence of RAD6 would explain the absence of the mutated protein and toxicity. The non-viability of the double (UBE2A and UBE2B) knockout cells prevented testing whether the mutated protein was stable in the absence of its paralog. However, proteasome inhibition in cultured cells from one of our patients resulted in accumulation of the mutated protein, confirming its degradion via the ubiquitin-proteasome pathway. In conclusion, the UBE2A c.382C8594;T mutation seems to lead to mental retardation in our patients due to loss of UBE2A function: the mutated isoform is unable to rescue the UV-sensitivity phenotype of 916;rad6 yeast or to ubiquitinate histones in vitro. In addition, patients carrying UBE2A deletions share clinical manifestations with our patients. On the other hand, the possibility remains of a clinical effect of the requirement of UBE2B for degrading the mutated UBE2A. Our data suggest reciprocal ubiquitination in addition to autoubiquitination as UBE2A and UBE2B regulatory mechanism that would explain the conservation of the two paralog genes in mammals.