A produção de PHAs é limitada devido ao alto custo da fonte de carbono para á produção. No Brasil, o uso de xilose uma fonte de carbono abundante no bagaço de cana é uma alternativa. Neste estudo o catabolismo de xilose em B. sacchari foi estudado para explorar seu potencial para a produção de PHB. Primeiro a organização do operon de xilose foi descrita e foi demostrado que a superexpressão de xylAB melhoro a velocidade máxima de crescimento assim como o teor de acumulo de PHB. Depois foi identificado o fenômeno de repressão catabólica, o qual foi abolido a traves da superexpressão dos genes xylE xylAB. Finalmente foi criado um set de plasmídeos induzíveis para fazer engenharia no consume de xilose em B. sacchari. A superexpressão de xylR permitiu que B. sacchari atinge a velocidade máxima de crescimento mais alta reportada e o melhor fator de conversão de xilose a PHB. Foi concluído então que a superexpressão de xylAB e xylR ajudam a melhorar a velocidade máxima de crescimento e a capacidade de acumulo de PHB usando xylose como fonte de carbono em B. sacchari. / Polyhydroxyalkanoate production is limited by the high production cost of carbon sources. The use of cheap carbon sources like xylose is an alternative to address this issue. In this work we aimed to understand and engineer xylose catabolism in B. sacchari, a bacteria isolated in Brazil to exploit its potential for producing PHB from renewable sources. Initially, we described organization of xylose assimilation genes and demonstrated that xylAB overexpression is an efficient strategy to improve B. sacchari growth rate and production of PHB using xylose as sole carbon source, achieving the highest conversion rate and titer described. Then we identified B. sacchari sequential preference for different sugars (glucose>arabinose>xylose) and overexpress xylE-xylAB to abolish this preference. Finally we created a set of inducible vectors and use them to engineer xylose metabolism. Overexpression of xylR, allowed B. sacchari cells to achieve the highest growth rate and PHB conversion factor and yield reported using xylose as a sole carbon source. Finally, we conclude that overexpression of xylAB and xylR genes improved growth rate, conversion factor and yield when PHB is produced using xylose as carbon source in B. sacchari.

O pré-tratamento a quente do inoculo associado ao controle do pH tem sido aplicado para selecionar bactérias produtoras de hidrogênio, como por exemplo, Clostridium sp. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi obter consórcio de bactérias anaeróbias produtoras de hidrogênio a partir de inóculo proveniente de lodo granulado de reator UASB, usado no tratamento de dejetos de suinocultura. Para tanto, foi realizado tratamento a quente do inóculo e, posterior, enriquecimento com diluições seriais visando obter consórcio anaeróbio. Foram utilizados 20% (v/v) desse consórcio como inóculo nos ensaios de determinação de gás hidrogênio em reatores com diferentes concentrações de sacarose e xilose. Os reatores anaeróbios (2 L) foram alimentados com sacarose e xilose, separadamente, em triplicata, a 37 graus Celsius, pH 5,5 e headspace com \'HE\' (100%) para as seguintes condições: (1) 630,0 mg sacarose/L; (2) 1184,0 mg sacarose/L; (3) 1816,0 mg sacarose/L, (4) 4128,0 mg sacarose/L, (5) 630,0 mg xilose/L; (6) 1341,0 mg xilose/L; (7) 1848,0 mg xilose/L e (8) 3588,0 mg xilose/L. A produção de \'H IND.2\' foi verificada em todos os reatores anaeróbios e não houve geração de metano. Os rendimentos de substrato a \'H IND.2\' para as condições (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) e (8) foram, respectivamente, 15% (1,2 mol \'H IND.2\'/mol sacarose), 20% (1,6 mol \'H IND.2\'/mol sacarose), 15% (1,2 mol \'H IND.2\'/mol sacarose), 4% (0,3 mol \'H IND.2\'/mol sacarose); 3,0% (0,2 mol \'H IND.2\'/mol xilose), 8,0% (0,5 mol \'H IND.2\'/mol xilose), 10,0% (0,6 mol \'H IND.2\'/mol xilose) e, 14% (0,8 mol \'H IND.2\'/mol xilose). Em todos os reatores foram detectados os ácidos acético e butírico e etanol. A morfologia predominante foi de bacilos Gram positivos e formadores de endósporos. Análises de clonagem e sequenciamento do consórcio bacteriano revelaram semelhanças com Clostridium, Burkolderia, Klebsiella e bactérias não cultivadas. A produção biológica de gás hidrogênio foi devida a consórcios de bactérias que estiveram presentes nas condições estudadas, identificados, principalmente, por espécies de, Clostridium sp., Clostridium acidotolerans e Klebsiella pneumoniae, reconhecidas como geradoras de \'H IND.2\' e ácidos voláteis. / The heat treatment of the inoculum associated with the pH control has been applied to select hydrogen-producing bacteria such as Clostridium sp. Therefore, this study aimed at preserving and keeping the anaerobic bacteria cultures producing hydrogen that comes from the granular sludge in UASB reactor, used to treat waste from pig farming, after heat treatment. For this, heat treatment of the inoculum was done and later, enrichment with serial dilutions to get anaerobic consortium. The 20% (v/v) of the bacterial consortium was used in essays for determination of hydrogen gas in reactors with different concentrations of sucrose and xylose. The reactors (2 L), fed with sucrose and xylose, separately, in triplicate, to 37 Celsius degrees, pH 5.5 and headspace with \'HE\' (100%) for the conditions: (1) 630.0 mg sucrose/L, (2) 1184.0 mg sucrose/L, (3) 1816.0 mg sucrose/L, (4) 4128.0 mg sucrose/L, (5) 630.0 mg xylose/L, (6) 1341.0 mg xylose /L, (7) 1848.0 mg xylose/L and (8) 3588.0 mg xylose/L. \'H IND.2\' production was detected in all the anaerobic reactors and there was no methane generation. \'H IND.2\' yield for the conditions (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and (8) were, respectively, 15% (1, 2 mol \'H IND.2\'/mol sucrose), 20% (1.6 mol \'H IND.2\'/mol sucrose), 15% (1.2 mol \'H IND.2\'/mol sucrose), 4% (0.3 mol \'H IND.2\'/mol sucrose), 3.0% (0.2 mol \'H IND.2\'/mol xylose), 8.0% (0.5 mol \'H IND.2\'/mol xylose), 10.0% (0.6 mol \'H IND.2\'/mol xylose), and 14% (0.8 mol \'H IND.2\'/mol xylose). The metabolic intermediarie products were acetic, butyric acid and ethanol in all anaerobic reactors. The main morphology was Gram positive bacilli and endospores formers. The cloning and sequencing analysis of the bacterial consortium revealed the presence of Clostridium genus (57%), Burkolderia genus (30%), Klebsiella genus (8%) and uncultivated bacteria (5%). The hydrogen gas production was due to bacterial consortium that were present in the studied conditions, marked mainly by species Clostridium sp., Clostridium acidotolerans and Klebsiella pneumoniae, recognized as \'H IND.2\' and volatile acids producing.

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-10. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:55:40Z : No. of bitstreams: 1 000863174_20171210.pdf: 5326772 bytes, checksum: 71e86eae7b59061316409d1ca5915a01 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-12-15T12:43:38Z: 000863174_20171210.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-12-15T12:44:29Z : No. of bitstreams: 1 000863174.pdf: 48014137 bytes, checksum: 92b96a2c7611fb7e1f5524d5b08a73e0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O comportamento fisiológico de um determinado microrganismo pode se mostrar diferente frente às variações das condições de cultivo. Em processos biotecnológicos, esse conhecimento permite definir os parâmetros fermentativos a serem controlados de modo a se otimizar custos e rendimento. Neste trabalho, foi padronizado um teste de avaliação da produção de etanol por leveduras a partir de xilose, utilizando placas de Petri, o qual permitiu o reconhecimento de 17 leveduras fermentadoras xilose. Dessas cepas, quando em fermentação em meio líquido, destacaram-se a Candida shehatae, var. shehatae PT1- 1BASP, que produziu 12 g.L-1 de etanol e Aureobasidium pullulans LB3.1, com 7 g.L-1. A produção de etanol por essas duas cepas foi avaliada com relação à parâmetros fermentativos, como tolerância a compostos reconhecidos como inibidores do crescimento de leveduras, temperatura de incubação, pH inicial do mosto, concentração do inóculo e adição de nutrientes minerais. A definição das melhores condições de fermentação elevou o consumo de xilose por ambas as cepas, ao mesmo tempo que diminui a produção de biomassa e aumentou o rendimento em etanol por A. pullulans LB3.1. As linhagens C. shehatae PT1-1BASP e A. pullulans LB3.1 atingiram um máximo de produção de etanol de 18,7 g.L-1 e 17,5 g.L-1, respectivamente. Além dessas duas leveduras, a cepa Brettanomyces bruxellensis ISA 2211, contaminante de vinhos, foi avaliada com relação à tolerância a SO2 diante de variações nas condições de cultivo. A adição de vitaminas e extrato de levedura ao mosto aumentou a resistência da levedura ao dióxido de enxofre, enquanto a presença do etanol, em combinação com o SO2, exerceu maior inibição do crescimento. Foi estudada também nesse trabalho, a capacidade de B. bruxellensis ISA 2211 de utilizar o ácido ρ-cumárico como fonte de carbono, observando-se que o crescimento da levedura nessa condição foi... / The microorganisms can show different behavior in different conditions of cultivation. In biotechnological processes, this knowledge allows that fermentation parameters to be controlled in order to optimize costs and yield. In this work it was standardized a test of ethanol production by yeast from xylose using Petri dishes assay, which allowed the recognition of 17 xylose fermenting yeasts. Using submerged fermentation it was detected that Candida shehatae, var. shehatae PT1-1BASP produced 12 g L -1 of ethanol and Aureobasidium pullulans LB3.1, 7 g L-1. Ethanol production by these two strains was evaluated with respect to fermentation parameters, such as tolerance to compounds recognized as inhibitors of growth of yeast, temperature of incubation, initial pH of the must, concentration of the inoculum and nutrient addition. The definition of the best fermentation conditions increased the xylose consumption by both strains, while it decreases the production of biomass and increased ethanol yield by A. pullulans LB3.1. The C. shehatae PT1-1BASP and A. pullulans LB3.1 reached a maximum ethanol yield of 18.7 gL-1 and 17.5 gL-1, respectively. Besides these two yeasts, Brettanomyces bruxellensis the ISA 2211, a wine contaminating strain, was evaluated with respect to SO2 tolerance in the face of variations in culture conditions. The addition of vitamins and yeast extract to must increased the yeast resistance to sulfur dioxide, while the presence of ethanol, in combination with SO2, had greater growth inhibition. It was also studied in this work, the ability of B. bruxellensis ISA 2211 to use the ρ-coumaric acid as a carbon source, noting that the growth of yeast in that condition was dependent on the acid concentration in the medium, not tolerating concentrations high than 5 mmol. L-1

A crescente demanda por tecnologias que produzam biocombustíveis de maneira sustentável vem incentivando a utilização de diversos materiais lignocelulósicos para tal finalidade. O objetivo deste trabalho foi comparar o potencial de produção de açúcares (glicose e xilose) da palha e do bagaço de cana-de-açúcar. Inicialmente, as duas biomassas foram caracterizadas, mostrando percentuais muito similares de celulose e hemicelulose (42,1% e 22,6% para o bagaço e 39,2% e 22,7% para a palha, respectivamente). Isto evidencia potenciais similares de produção de açúcares. Posteriormente, foram realizados experimentos em laboratório para comparar os resultados de rendimento de xilose e produção de furfural após as reações de hidrólise ácida das duas biomassas, com o intuito de verificar se este processo, comumente utilizado para o bagaço, pode ser utilizado para a palha. As variáveis que foram avaliadas foram a concentração de ácido (0,5-3,0%m/m), o tempo reacional (15-60min) e a relação sólido-líquido (RSL - 0,1-0,2m/m). Concentrações de 42,72g/L e de 41,31g/L de xilose foram encontradas para a palha e para o bagaço, respectivamente, alcançando rendimentos de xilose superiores a 80%, em reações em laboratório. Também foram realizados ensaios de hidrólise ácida em planta piloto e de hidrólise enzimática em laboratório para avaliar os resultados de rendimento de glicose da palha. Os resultados de rendimento de xilose e produção de inibidores para estas reações foram avaliados e comparados com os dados obtidos em laboratório. Concentrações de 35,2g/Lde xilose e de 27,3g/L de glicose foram encontradas para a palha, alcançando rendimentos de xilose próximos a 100% e de glicose superiores a 64%, em reações de pré-tratamento em planta piloto e em reações de hidrólise enzimática em laboratório. Os resultados evidenciaram que as variáveis concentração de ácido e relação sólido:líquido são as mais influenciam na produção de xilose e glicose / The growing demand for technologies that produce sustainable biofuels encourages the use of various lignocellulosic materials for this purpose. The aim of this study was to compare the potential production of sugars (glucose and xylose) from sugarcane straw and bagasse. First, the biomasses were characterized, showing very similar percentage of cellulose and hemicellulose (42.1% and 22.6% for the bagasse and 39.2% and 22.7% for the straw, respectively). This is a evidence that the potential of sugar production for bagasse and straw are almost the same. Laboratory experiments were carried out to compare the results of xylose yield and production of furfural after acid hydrolysis reactions for both biomasses in order to determine whether this process, commonly used for bagasse, can be used for straw. The variables that were evaluated were acid concentration (0.5 to 3.0 wt.%), reaction time (15-60min) and liquid-solid ratio (RSL - 0.1-0.2 wt.%). Concentrations of 42.72 g/L to 41.31 g/L of xylose were found to straw and bagasse, respectively, reaching xylose yields higher than 80% in laboratory reactions. Also acid hydrolysis reactions in pilot plant and enzymatic hydrolysis reactions in laboratory were carried out to evaluate the results of straw glucose yields. Also the results of xylose yields and production of inhibitors for these reactions were evaluated and compared to the data obtained in the laboratory. Concentrations of 35.2g/L of xylose and 27.3g/L of glucose were found for straw, reaching xylose yields close to 100% and glucose yields up to 64%, in pretreatment reactions in pilot plant and in enzymatic hydrolysis reactions in the laboratory. It was observed that acid concentration and solid: liquid ratio are the variables that most influence in the results of formation of xylose and glucose

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:26:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:45:35Z : No. of bitstreams: 1 000844282_20161201.pdf: 63329 bytes, checksum: 6dc853b30cdce2e06ad742cc1747cf1c (MD5) Bitstreams deleted on 2016-12-02T12:25:15Z: 000844282_20161201.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-12-02T12:25:57Z : No. of bitstreams: 1 000844282.pdf: 337184 bytes, checksum: f2684b72284de0be5cf54c1b0bee7c9a (MD5) Bitstreams deleted on 2016-12-02T12:41:54Z: 000844282.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-12-02T12:42:34Z : No. of bitstreams: 1 000844282.pdf: 337184 bytes, checksum: f2684b72284de0be5cf54c1b0bee7c9a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A hidrólise de polissacarídeos presentes na biomassa lignocelulosica libera grande quantidade de pentoses, cuja fermentação a etanol poderia ser um complemento ao etanol obtido pela fermentação da glicose oriunda da sacarificação da celulose (etanol 2G). Entretanto, apesar dos esforços em pesquisa, esta ainda é uma tecnologia a ser desenvolvida. Por outro lado, o uso das pentoses como substrato para obtenção de outros bioprodutos com maior valor agregado que o etanol é uma via alternativa economicamente sustentável. O presente projeto propôs o estudo de cepas de leveduras assimiladoras xilose focando os metabólitos gerados a partir do uso desse açúcar como única fonte de carbono. Para esse estudo, foram selecionadas as leveduras Pichia kluyveri G1.1; Hanceniaspora sp. G4.1; Hanceniaspora sp. G7.1; Candida oleophila G10.1; Metschnikowia koreensis G18 com base nos potenciais de assimilação de xilose por elas apresentados em trabalho prévio. Os dados mostraram que as cepas Hanceniaspora sp. G4.1, Hanceniaspora sp. G7.1 e C. oleophila G10.1 consumiram 100% da xilose do meio em 120 h. M. koreensis G18 consumiu aproximadamente 70% em 96 h e a cepa P. kluyveri G1.1, foi a que apresentou menor taxa de consumo de xilose (50% em 120 h). A avaliação qualitativa dos ácidos orgânicos secretados pelas cepas nesses cultivos revelou a presença dos ácidos oxálico, cítrico, maleico, tartárico, málico, pirúvico, lático, fumárico, acético, propiônico, isobutírico e butírico nos meios de cultura das leveduras. Em cultivos utilizando meios com diferentes valores de pH iniciais e concentrações de xilose, constatou-se a influência desses fatores sobre a produção de ácidos orgânicos por M. koreensis G18, porém, não foram significantes para as demais leveduras / The hydrolysis of polysaccharides from lignocellulosic biomass releases high quantity of pentoses, whose fermentation to ethanol could be a complement that obtained by fermentation of glucose derived from cellulose saccharification (2G ethanol). However, despite efforts in research, this is still a technology in development. Moreover, the use of pentoses as a substrate for obtaining value-added bioproducts is an alternative to ethanol and an economically viable route. This project proposes the study of xylose assimilating yeast focused on metabolites generated from the use of xylose as carbon source. Pichia kluyveri G1.1; Hanceniaspora sp. G4.1; Hanceniaspora sp. G7.1; Candida oleophila G10.1; Metschnikowia koreensis G18 were selected for this study based on their potential of assimilation of xylose studied in previous work. The data showed that Hanceniaspora sp. G4.1, Hanceniaspora sp. G7.1 and C. oleophila G10.1 consumed 100% of xylose from the culture medium in 120 h. M. koreensis G18 consumed approximately 70% in 96 h and P. kluyveri G1.1 was the strain that presented the lowest xylose consumption rate ( 50% in 120 h). Qualitative evaluation of the organic acids secreted by strains in these cultures revealed the presence of oxalic, citric, maleic, tartaric, malic, pyruvic, lactic, fumaric, acetic, propionic, isobutyric, and butyric acid. In cultivation using culture media with different initial pH values and concentrations of xylose it was observed that these factors influence the production of organic acids by M. koreensis G18, however, were not significant for other yeasts

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-20T14:17:05Z No. of bitstreams: 1 DissHJSL.pdf: 2157542 bytes, checksum: d557acac1c0f359eabb057d96b49b7ae (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:35:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissHJSL.pdf: 2157542 bytes, checksum: d557acac1c0f359eabb057d96b49b7ae (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:35:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissHJSL.pdf: 2157542 bytes, checksum: d557acac1c0f359eabb057d96b49b7ae (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T12:35:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissHJSL.pdf: 2157542 bytes, checksum: d557acac1c0f359eabb057d96b49b7ae (MD5) Previous issue date: 2015-04-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The aim of this work was to evaluate hydrogen, ethanol and organic acids productions from several substrate, including, agribusiness byproducts, such as cheese whey, hydrolyzed cellulose and crude glycerol, and simple substrates, such as glucose and xylose. Three continuous reactors were operated. A thermophilic Anaerobic Fluidized Bed Reactor (AFBR), denominated R1, was operated to evaluate hydrogen production from hydrolyzed cellulose. The substrate concentration was 2000mg.L-1 different Hydraulic Retention Times (HRT) ranging from 24 to 6h. Another thermophilic RALF (R2) was used in order to evaluate xylose and glucose co-fermentation to produce hydrogen and ethanol. R2 was operated with HRT starting in 16 h and decreased to 1 h. The substrates concentration was 2000mg.L-1 of each carbohydrate. Hydrogen and propionic acids production was evaluated in Expanded Granular Sludge Bed (ESGB) reactor, operating with Cheese Whey (CW) and Crude Glycerol (CG) co-fermentation in several ratios: 5:1, 5:2, 5:3, 5:4 and 5:5 (m/m) and decreasing HRT from 8 to 0.5h. For R1, maximum yield was 1.1 mol H2.mol-1 glucose, obtained in HRT of 8h. In R2, the consumption of both substrates was verified. However, glucose consumption was higher than xylose. Maximum hydrogen yield, 0,401 mol H2 mol-1 glucose equivalent was achieved in HRT of 16h. Maximum ethanol yield, 0,25mol EtOH.mol- 1glicoseequivalent, occurred in 0.5h HRT. The EGSB reactor maximum hydrogen yield, 0,120 mmol.g-1DQO, was obtained using a 5:1 CW/RG ratio and HRT of 8h. Maximum propionic acid, 0,99g.g-1substrate, was also verified in HRT of 8h, however, with a 5:3 CW/CG ratio. At the end of the work it was made comparison of three reactors. Toward the hydrogen yield the greatest result was obtained by R1 with the value of 2,02 mmolH2.g-1DQO applied, this result occurred in HRT of 8h. In relation to energy efficiency the highest value was observed in R2, 47kJ.h-1.L-1, obtained in HRT of 0,5h. / O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de hidrogênio, etanol e ácidos orgânicos a partir de diferentes substratos, incluindo resíduos e subprodutos agroindustriais como: soro de queijo, celulose hidrolisada e glicerol bruto e fontes orgânicas simples como: glicose e xilose comerciais. Foram operados três reatores contínuos. Um reator anaeróbio de leito fluidizado (RALF) termofílico, denominado R1, foi operado para avaliar a produção de hidrogênio a partir de hidrolisado celulósico na concentração 2000mg.L-1 sob diferentes tempos de detenção hidráulica (TDH), partindo de 24 até 8 h. Outro RALF termofílico (R2) foi utilizado para avaliar a possibilidade de cofermentação de xilose e glicose para a produção de hidrogênio e etanol. O R2 foi operado em TDH decrescente partindo de 16 até 1 h e concentração fixada em 2000mg.L-1 de cada carboidrato. Foi avaliada, também, a produção de hidrogênio e ácido propiônico em reator granular de leito expandido (EGSB en. Expanded granular sludge bed) (R3) operando com co-fermentação de soro de queijo (SQ) e glicerol bruto (GB) em diferentes razões: 5:1, 5:2, 5:3, 5:4 e 5:5 (m/m) e TDH decrescente de 8 até 0,5 h. Para o R1 o rendimento máximo obtido foi 1,1 mol H2 mol-1 glicose valor este observado em TDH de 8 h. No R2 foi verificado consumo de ambos os substratos em todos os TDH aplicados, porém a conversão de glicose foi superior a da xilose. O rendimento máximo de hidrogênio, 0,401 mol H2 mol-1 glicose equivalente, foi verificado em TDH de 16 h enquanto o máximo rendimento de etanol, 0,25mol EtOH.mol-1glicose equivalente, foi obtido em TDH de 0,5 h. Em relação ao EGSB, o máximo rendimento de hidrogênio, 0,120 mmol.g-1DQO, foi verificado sob relação SQ:GB 5:1 e TDH de 8 h. O máximo rendimento de ácido propiônico, 0,99g.g-1 substrato, também foi verificado em TDH de 8 h, porém em relação SQ:GB 5:3. Ao final do trabalho foi feita comparação entre os três reatores. Em relação ao rendimento de hidrogênio o maior resultado foi obtido pelo R1 com o valor de 2,02 mmolH2.g1DQO aplicada, resultado este verificado em TDH de 8 h. Já em relação ao rendimento energético o maior valor foi observado no R2, 47 KJ.h-1.L-1, obtido em TDH de 0,5h.

Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Fernando Carlos Pagnocca / Banca: Sandra Regtina Ceccato Antonini / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: Crispin Humberto Garcia Cruz / Resumo: O comportamento fisiológico de um determinado microrganismo pode se mostrar diferente frente às variações das condições de cultivo. Em processos biotecnológicos, esse conhecimento permite definir os parâmetros fermentativos a serem controlados de modo a se otimizar custos e rendimento. Neste trabalho, foi padronizado um teste de avaliação da produção de etanol por leveduras a partir de xilose, utilizando placas de Petri, o qual permitiu o reconhecimento de 17 leveduras fermentadoras xilose. Dessas cepas, quando em fermentação em meio líquido, destacaram-se a Candida shehatae, var. shehatae PT1- 1BASP, que produziu 12 g.L-1 de etanol e Aureobasidium pullulans LB3.1, com 7 g.L-1. A produção de etanol por essas duas cepas foi avaliada com relação à parâmetros fermentativos, como tolerância a compostos reconhecidos como inibidores do crescimento de leveduras, temperatura de incubação, pH inicial do mosto, concentração do inóculo e adição de nutrientes minerais. A definição das melhores condições de fermentação elevou o consumo de xilose por ambas as cepas, ao mesmo tempo que diminui a produção de biomassa e aumentou o rendimento em etanol por A. pullulans LB3.1. As linhagens C. shehatae PT1-1BASP e A. pullulans LB3.1 atingiram um máximo de produção de etanol de 18,7 g.L-1 e 17,5 g.L-1, respectivamente. Além dessas duas leveduras, a cepa Brettanomyces bruxellensis ISA 2211, contaminante de vinhos, foi avaliada com relação à tolerância a SO2 diante de variações nas condições de cultivo. A adição de vitaminas e extrato de levedura ao mosto aumentou a resistência da levedura ao dióxido de enxofre, enquanto a presença do etanol, em combinação com o SO2, exerceu maior inibição do crescimento. Foi estudada também nesse trabalho, a capacidade de B. bruxellensis ISA 2211 de utilizar o ácido ρ-cumárico como fonte de carbono, observando-se que o crescimento da levedura nessa condição foi... / Abstract: The microorganisms can show different behavior in different conditions of cultivation. In biotechnological processes, this knowledge allows that fermentation parameters to be controlled in order to optimize costs and yield. In this work it was standardized a test of ethanol production by yeast from xylose using Petri dishes assay, which allowed the recognition of 17 xylose fermenting yeasts. Using submerged fermentation it was detected that Candida shehatae, var. shehatae PT1-1BASP produced 12 g L -1 of ethanol and Aureobasidium pullulans LB3.1, 7 g L-1. Ethanol production by these two strains was evaluated with respect to fermentation parameters, such as tolerance to compounds recognized as inhibitors of growth of yeast, temperature of incubation, initial pH of the must, concentration of the inoculum and nutrient addition. The definition of the best fermentation conditions increased the xylose consumption by both strains, while it decreases the production of biomass and increased ethanol yield by A. pullulans LB3.1. The C. shehatae PT1-1BASP and A. pullulans LB3.1 reached a maximum ethanol yield of 18.7 gL-1 and 17.5 gL-1, respectively. Besides these two yeasts, Brettanomyces bruxellensis the ISA 2211, a wine contaminating strain, was evaluated with respect to SO2 tolerance in the face of variations in culture conditions. The addition of vitamins and yeast extract to must increased the yeast resistance to sulfur dioxide, while the presence of ethanol, in combination with SO2, had greater growth inhibition. It was also studied in this work, the ability of B. bruxellensis ISA 2211 to use the ρ-coumaric acid as a carbon source, noting that the growth of yeast in that condition was dependent on the acid concentration in the medium, not tolerating concentrations high than 5 mmol. L-1 / Doutor

A crescente demanda por tecnologias que produzam biocombustíveis de maneira sustentável vem incentivando a utilização de diversos materiais lignocelulósicos para tal finalidade. O objetivo deste trabalho foi comparar o potencial de produção de açúcares (glicose e xilose) da palha e do bagaço de cana-de-açúcar. Inicialmente, as duas biomassas foram caracterizadas, mostrando percentuais muito similares de celulose e hemicelulose (42,1% e 22,6% para o bagaço e 39,2% e 22,7% para a palha, respectivamente). Isto evidencia potenciais similares de produção de açúcares. Posteriormente, foram realizados experimentos em laboratório para comparar os resultados de rendimento de xilose e produção de furfural após as reações de hidrólise ácida das duas biomassas, com o intuito de verificar se este processo, comumente utilizado para o bagaço, pode ser utilizado para a palha. As variáveis que foram avaliadas foram a concentração de ácido (0,5-3,0%m/m), o tempo reacional (15-60min) e a relação sólido-líquido (RSL - 0,1-0,2m/m). Concentrações de 42,72g/L e de 41,31g/L de xilose foram encontradas para a palha e para o bagaço, respectivamente, alcançando rendimentos de xilose superiores a 80%, em reações em laboratório. Também foram realizados ensaios de hidrólise ácida em planta piloto e de hidrólise enzimática em laboratório para avaliar os resultados de rendimento de glicose da palha. Os resultados de rendimento de xilose e produção de inibidores para estas reações foram avaliados e comparados com os dados obtidos em laboratório. Concentrações de 35,2g/Lde xilose e de 27,3g/L de glicose foram encontradas para a palha, alcançando rendimentos de xilose próximos a 100% e de glicose superiores a 64%, em reações de pré-tratamento em planta piloto e em reações de hidrólise enzimática em laboratório. Os resultados evidenciaram que as variáveis concentração de ácido e relação sólido:líquido são as mais influenciam na produção de xilose e glicose / The growing demand for technologies that produce sustainable biofuels encourages the use of various lignocellulosic materials for this purpose. The aim of this study was to compare the potential production of sugars (glucose and xylose) from sugarcane straw and bagasse. First, the biomasses were characterized, showing very similar percentage of cellulose and hemicellulose (42.1% and 22.6% for the bagasse and 39.2% and 22.7% for the straw, respectively). This is a evidence that the potential of sugar production for bagasse and straw are almost the same. Laboratory experiments were carried out to compare the results of xylose yield and production of furfural after acid hydrolysis reactions for both biomasses in order to determine whether this process, commonly used for bagasse, can be used for straw. The variables that were evaluated were acid concentration (0.5 to 3.0 wt.%), reaction time (15-60min) and liquid-solid ratio (RSL - 0.1-0.2 wt.%). Concentrations of 42.72 g/L to 41.31 g/L of xylose were found to straw and bagasse, respectively, reaching xylose yields higher than 80% in laboratory reactions. Also acid hydrolysis reactions in pilot plant and enzymatic hydrolysis reactions in laboratory were carried out to evaluate the results of straw glucose yields. Also the results of xylose yields and production of inhibitors for these reactions were evaluated and compared to the data obtained in the laboratory. Concentrations of 35.2g/L of xylose and 27.3g/L of glucose were found for straw, reaching xylose yields close to 100% and glucose yields up to 64%, in pretreatment reactions in pilot plant and in enzymatic hydrolysis reactions in the laboratory. It was observed that acid concentration and solid: liquid ratio are the variables that most influence in the results of formation of xylose and glucose

O pré-tratamento a quente do inoculo associado ao controle do pH tem sido aplicado para selecionar bactérias produtoras de hidrogênio, como por exemplo, Clostridium sp. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi obter consórcio de bactérias anaeróbias produtoras de hidrogênio a partir de inóculo proveniente de lodo granulado de reator UASB, usado no tratamento de dejetos de suinocultura. Para tanto, foi realizado tratamento a quente do inóculo e, posterior, enriquecimento com diluições seriais visando obter consórcio anaeróbio. Foram utilizados 20% (v/v) desse consórcio como inóculo nos ensaios de determinação de gás hidrogênio em reatores com diferentes concentrações de sacarose e xilose. Os reatores anaeróbios (2 L) foram alimentados com sacarose e xilose, separadamente, em triplicata, a 37 graus Celsius, pH 5,5 e headspace com \'HE\' (100%) para as seguintes condições: (1) 630,0 mg sacarose/L; (2) 1184,0 mg sacarose/L; (3) 1816,0 mg sacarose/L, (4) 4128,0 mg sacarose/L, (5) 630,0 mg xilose/L; (6) 1341,0 mg xilose/L; (7) 1848,0 mg xilose/L e (8) 3588,0 mg xilose/L. A produção de \'H IND.2\' foi verificada em todos os reatores anaeróbios e não houve geração de metano. Os rendimentos de substrato a \'H IND.2\' para as condições (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) e (8) foram, respectivamente, 15% (1,2 mol \'H IND.2\'/mol sacarose), 20% (1,6 mol \'H IND.2\'/mol sacarose), 15% (1,2 mol \'H IND.2\'/mol sacarose), 4% (0,3 mol \'H IND.2\'/mol sacarose); 3,0% (0,2 mol \'H IND.2\'/mol xilose), 8,0% (0,5 mol \'H IND.2\'/mol xilose), 10,0% (0,6 mol \'H IND.2\'/mol xilose) e, 14% (0,8 mol \'H IND.2\'/mol xilose). Em todos os reatores foram detectados os ácidos acético e butírico e etanol. A morfologia predominante foi de bacilos Gram positivos e formadores de endósporos. Análises de clonagem e sequenciamento do consórcio bacteriano revelaram semelhanças com Clostridium, Burkolderia, Klebsiella e bactérias não cultivadas. A produção biológica de gás hidrogênio foi devida a consórcios de bactérias que estiveram presentes nas condições estudadas, identificados, principalmente, por espécies de, Clostridium sp., Clostridium acidotolerans e Klebsiella pneumoniae, reconhecidas como geradoras de \'H IND.2\' e ácidos voláteis. / The heat treatment of the inoculum associated with the pH control has been applied to select hydrogen-producing bacteria such as Clostridium sp. Therefore, this study aimed at preserving and keeping the anaerobic bacteria cultures producing hydrogen that comes from the granular sludge in UASB reactor, used to treat waste from pig farming, after heat treatment. For this, heat treatment of the inoculum was done and later, enrichment with serial dilutions to get anaerobic consortium. The 20% (v/v) of the bacterial consortium was used in essays for determination of hydrogen gas in reactors with different concentrations of sucrose and xylose. The reactors (2 L), fed with sucrose and xylose, separately, in triplicate, to 37 Celsius degrees, pH 5.5 and headspace with \'HE\' (100%) for the conditions: (1) 630.0 mg sucrose/L, (2) 1184.0 mg sucrose/L, (3) 1816.0 mg sucrose/L, (4) 4128.0 mg sucrose/L, (5) 630.0 mg xylose/L, (6) 1341.0 mg xylose /L, (7) 1848.0 mg xylose/L and (8) 3588.0 mg xylose/L. \'H IND.2\' production was detected in all the anaerobic reactors and there was no methane generation. \'H IND.2\' yield for the conditions (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and (8) were, respectively, 15% (1, 2 mol \'H IND.2\'/mol sucrose), 20% (1.6 mol \'H IND.2\'/mol sucrose), 15% (1.2 mol \'H IND.2\'/mol sucrose), 4% (0.3 mol \'H IND.2\'/mol sucrose), 3.0% (0.2 mol \'H IND.2\'/mol xylose), 8.0% (0.5 mol \'H IND.2\'/mol xylose), 10.0% (0.6 mol \'H IND.2\'/mol xylose), and 14% (0.8 mol \'H IND.2\'/mol xylose). The metabolic intermediarie products were acetic, butyric acid and ethanol in all anaerobic reactors. The main morphology was Gram positive bacilli and endospores formers. The cloning and sequencing analysis of the bacterial consortium revealed the presence of Clostridium genus (57%), Burkolderia genus (30%), Klebsiella genus (8%) and uncultivated bacteria (5%). The hydrogen gas production was due to bacterial consortium that were present in the studied conditions, marked mainly by species Clostridium sp., Clostridium acidotolerans and Klebsiella pneumoniae, recognized as \'H IND.2\' and volatile acids producing.

Este trabalho teve como objetivo estudar a permeabilização celular de Candida guilliermondii FTI 20037 empregando processos químicos (agentes tensoativos) e físicos (congelamento-descongelamento) e verificar o potencial uso das células permeabilizadas na redução de xilose em xilitol. Os ensaios de permeabilização empregaram suspensão celular de 2 g/L, temperatura de 30ºC e pH 7. Para os processos químicos foram avaliados CTAB (Brometo de cetiltrimetilamônio) e Triton X-100 e os ensaios foram realizados empregando metodologia do planejamento experimental. O monitoramento da permeabilidade celular foi realizado através da dosagem in situ e no sobrenadante da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), selecionada como marcador do tratamento. As enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XD) também foram dosadas. A permeabilização de C. guilliermondii com CTAB permitiu a dosagem in situ de G6PD e XD, mas não de XR. As três enzimas avaliadas não foram detectadas no sobrenadante. As condições que promoveram máxima permeabilidade celular (0,41 mM de CTAB, 200 rpm de agitação e 50 min de tempo de contato) resultaram em níveis in situ de G6PD de 283,4 ± 60,7 U/L e 122,4 ± 15,7 U/gcélulas. Nestas condições de tratamento, o CTAB influenciou negativamente a atividade catalítica de G6PD, XR e XD presentes no homogenato das células rompidas (não tratadas). O estudo de permeabilização celular com Triton X-100 mostrou que o tensoativo foi pouco efetivo, permitindo a dosagem in situ apenas da G6PD. As condições que promoveram máxima permeabilidade celular, ou seja, 2,78 mM de Triton X-100, 200 rpm de agitação e 50 min de tempo de contato, resultaram em níveis in situ de G6PD de 44,7 ± 0,0 U/L e 16,9 ± 0,0 U/gcélulas. Nestas condições, Triton X-100 não afetou a atividade catalítica de G6PD, XR e XD presentes no homogenato das células rompidas (não tratadas). O processo físico de permeabilização consistiu no congelamento da suspensão celular (-18ºC) por período de 48h, seguido do descongelamento em banho-maria (30ºC). Este tratamento permitiu a dosagem in situ das enzimas G6PD (108,7 ± 3,8 U/L e 54,3 ± 1,9 U/ gcélulas) e XR (26,4 ± 0,1U/L e 13,2 ± 0,1 U/gcélulas), mas não da XD. O tratamento não foi suficiente para liberar G6PD, no entanto, cerca de 60% da atividade total de XR foi detectada no sobrenadante (47,1 ± 0,4 U/L e 23,6 ± 0,2 U/gcélulas). Os ensaios de biotransformação mostraram que, nas condições avaliadas, a conversão de xilose em xilitol foi dependente do tipo de tratamento de permeabilização do biocatalisador. Os ensaios de cultivo mostraram que o tratamento das células com Triton X-100 não foi suficiente para causar perda de viabilidade e atividade metabólica de C. guilliermondii, enquanto o congelamento-descongelamento promoveu perda parcial da viabilidade celular. O tratamento das células com CTAB foi mais agressivo, causando a perda total de viabilidade celular. Foi também verificado que resting cells (células em estado de repouso) de C. guilliermondii sem tratamento e permeabilizadas com Triton X-100 foram capazes de converter xilose em xilitol com rendimento de ~60%, após 10 h de reação. Com o presente trabalho pode se concluir que os métodos estudados podem ser especialmente úteis para a determinação in situ de G6PD. Além disto, a utilização de células permeabilizadas pode ajudar a superar os problemas/custos associados com a extração e purificação das enzimas e conseqüentemente contribuírem para o desenvolvimento de uma tecnologia de baixo custo para a produção de xilitol. / This work describes the effect of the surfactants (CTAB and Triton X-100) and freezing-thawing treatment on the permeabilization of C. guilliermondii cells. The potential use of these cells (unpermeabilized and permeabilized by CTAB, Triton X-100 and freezing-thawing treatment) was also evaluated. Response surface methodology was used to investigate the effect of different parameters (detergent concentration, agitation and treatment time) on the permeabilization of C. guilliermondii cells. The experimentation was aimed to find the values of process variables to achieve maximal glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) activity in situ. The intracellular G6PD of the C. guilliermondii could not be detected in intact (unpermeabilized) whole cells. However, on treatment of C.guilliermondii with detergents (CTAB and Triton X-100) and freeze-thawing, the G6PD activity could be measured.The effectiveness of detergent permeabilization of C.guilliermondii cells was dependent on its concentration and exposure time. Maximum permeabilization, measured in terms of assayable G6PD activity in situ, was obtained when the cells were treated with CTAB. Triton X-100 and freeze-thawing were also found to permeabilize the cells, but to a lesser degree than CTAB. The optimum operating conditions for permeabilization process were 0.41 mM (CTAB) or 2.78 mM (Triton X-100) under agitation of 200 rpm at 30ºC temperature and process duration of 50 min and pH 7. At these conditions of process variables, the maximum value of enzyme activity was found to be 283.4 ± 60.7 U/L (122.4 ± 15.7 U/gcells) and 44.7 ± 0.0 U/L (16.9 ± 0.0 U/gcells) for permeabilized cells with CTAB and Triton X-100, respectively. The Triton X-100 was not enough to cause loss of viability and metabolic activity of C. guilliermondii. Freezing-thawing treatment promoted partial loss of cell viability. On the other hand the cells treated with CTAB were totally affected. The biotransformation of xylose to xylitol was studied by employing C. gulliermondii FTI 20037 in two different forms namely unpermeabilized cells and permeabilized cells. The maximum xylitol yield of about 60% was observed with unpermeabilized yeast cells and Triton X-100 permeabilized cells after 10 h of reaction time. In conclusion, surfactants and freezing-thawing treatment provides a simple and mild procedure for C.guilliermondii permeabilization. The method may be especially useful for the in situ determination of G6PD. Response surface methodology was found effective in optimizing and determining the interactions among process variables for the permeabilization process. The use of permeabilized cells can help to overcome the problems/costs associated with enzyme extraction and purification from yeast cells and in the development of a low-cost technology for xylitol production.