Fazemos parte de um cenário mundial em que o esgotamento das fontes de energias fósseis atrelado à poluição gerada por esse uso, preocupam os diferentes setores do comércio, da indústria, do governo e das instituições em defesa do meio ambiente. Nesse sentido, a busca por novas fontes energéticas renováveis tem dirigido diversas pesquisas, além de drenar bilhões de dólares em investimentos. Uma das linhas de pesquisa mais importantes é a da produção do etanol de segunda geração (2G), um etanol produzido a partir dos resíduos gerados na produção do etanol de primeira geração. No caso do Brasil, esses resíduos compreendem principalmente a palha e o bagaço de cana-de-açúcar; essa biomassa é formada majoritariamente por celulose (∼45%), hemicelulose (∼25%) e lignina (∼20), e sua hidrólise envolve pré-tratamentos adequados e uso de enzimas que agem especificamente em seus alvos. Dessa forma, a produtividade de etanol aumenta, sem necessariamente ampliar áreas de cultivo. Essa vertente é muito promissora, porém os custos ainda são relativamente altos e a aplicabilidade depende bastante de adaptações do setor industrial e aprimoramentos na produção em si (atividade específica das enzimas e sua ação sinérgica). O objetivo principal deste projeto é reconhecer e mapear as bases moleculares que comandam a atividade da enzima xilose isomerase (XI), que converte xilose (presença majoritária na hemicelulose) em xilulose, possibilitando a utilização desta por Saccharomyces cerevisiae (já que a xilose não é fermentescível), para obtenção do etanol de segunda geração como produto final. Para isso, foi realizada uma busca extensiva de genes de diversos microrganismos, que codifiquem para XI, e que essas ainda não possuam estruturas resolvidas publicadas. A maioria das ORFs (Open Reading Frame, do inglês), ou regiões codificadoras, foram amplificadas, clonadas em vetores específicos e transformadas em bactérias Escherichia coli Rosetta (DE3). Parte dessas cepas transformadas resultaram na produção da XI de interesse. Com isso, foi possível obter cristais e iniciar a resolução de estruturas cristalográficas. Esses resultados foram cruzados e correlacionados com os de atividade enzimática, cinética química e estabilidade térmica, fornecendo boa perspectiva para o entendimento das bases moleculares que regem a atividade xilose isomerásica. / We are part of a world scenario in which the depletion of fossil energy sources linked to the pollution generated by this use, concern the different sectors of commerce, industry, government and institutions in defense of the environment. In this regard, the search for new renewable energy sources has headed many researches, besides generating billions of dollars in investments. One of the most important research lines is the production of second generation ethanol (2G), an ethanol produced from the waste generated in the production of the first generation one. In the case of Brazil, these residues mainly include sugar cane straw and bagasse. This biomass is mostly composed of cellulose (∼45%), hemicellulose (∼25%) and lignin (∼20), and its hydrolysis involves adequate pre-treatments and the use of enzymes that specifically act on their targets. In this way, ethanol productivity increases without necessarily expanding growing areas. This aspect is very promising, but the costs are still relatively high and the applicability badly depends on adaptations of the industrial sector and improvements in the production itself (specific activity of the enzymes and their synergistic action with others). The main goal of this project is to recognize and map the molecular bases that control the activity of the enzyme xylose isomerase (XI), which converts xylose (the mostly present carbohydrate in hemicellulose) into xylulose, allowing its use by Saccharomyces cerevisiae (since xylose is not fermentable), to obtain the second generation ethanol as final product. To reach this, an extensive search of genes of several microorganisms, that code for XI, and still do not have solved high resolution structures published are carried out. Most ORFs (Open Reading Frames) were amplified, cloned into specific vectors and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) bacteria. Some of these transformed strains leaded to the production of XI of interest. Furthermore, it was possible to obtain protein crystals and to start trying to solve crystallographic structures. These results were cross - checked and correlated with those of enzymatic activity, chemical kinetics and thermal stability, providing a good perspective for understanding the molecular bases which govern isomerase activity.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T18:16:32Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 38144 bytes, checksum: 79678cb9a936baa34af6a9a600570e58 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T18:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 38144 bytes, checksum: 79678cb9a936baa34af6a9a600570e58 (MD5) Previous issue date: 2005-08-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Com o objetivo de avaliar o processo de conversão de xilose em xilitol por um novo isolado de Debaryomyces hansenii em meio semi-sintético, foi determinada a influência de diferentes variáveis de cultivo, a relação entre o crescimento da biomassa e a produção de xilitol, e a recuperação do produto final, utilizando ferramentas matemáticas e modelagem metabólica. Avaliando a influência do pH inicial do meio e da temperatura de cultivo na conversão de 50 g L -1 de xilose (S o ), foi observado que o pH ótimo está entre 4,0 e 8,0, com a produção de xilitol (P m ) entre 37,5±1,7 e -1 41,8±0,78 g L e o rendimento (Y P/S ) ente 0,70±0,01 e 0,76±0,01/0,02 g g -1 , enquanto, a temperatura ótima está entre 30°C e 35°C com P m entre 41,0±1,1 e 41,6±1,1 g L -1 e Y P/S entre 0,75±0,02 e 0,77±0,04 g g -1 . A conversão também foi estudada sob forte limitação de oxigênio, sendo observada uma produção de xilitol desprezível, e sob condição semi- aeróbia, quando foram obtidos os melhores valores de produção de xilitol (P max > 70 g L -1 e Y P/S > 0,65 g g -1 , para S o ≅ 100 g L -1 ). Foi determinado que o acúmulo de xilitol no meio de cultivo está associado ao estado fisiológico característico de fase de crescimento desacelerado e à concentração de biomassa que influencia a disponibilidade de oxigênio dissolvido e a manutenção da capacidade de conversão, limitada apenas pela disponibilidade de substrato e nitrogênio. Aplicando design fatorial (3 3 e 3 2 ), foi observado que a combinação de maior concentração de xilose (S o = 165 g L -1 ), na presença de alta concentração inicial de células (X o = 6,4 g L -1 ) e alta aeração (300 rpm) beneficiou o processo de conversão. Na simulação da composição do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, as células suportaram as condições impostas pela presença de inibidores e de outros açúcares. A cristalização de xilitol em meio semi-sintético fermentado tratado com carvão ativo (20 g L -1 ) foi favorecida pelo aumento na concentração de xilitol (675 ≤ P o Xyt ≤ 911 g L -1 ). Baixa temperatura (-10 ≤ T c ≤ 15°C) foi mais eficiente em termos de rendimento de cristalização, enquanto o grau de pureza apresentou um comportamento contrário. a presença simultânea de xilose residual reduziu o conteúdo de xilitol dos cristais de 97,7 para 85,3%, porém aumentou 1,6 vezes o rendimento de cristalização de 0,27 para 0,42. Finalmente, o estudo cinético da cristalização de xilitol revelou o efeito positivo da presença de xilose residual (168±8.0 g L -1 ) que aumentou a velocidade constante de crescimento de cristais, assim permitindo a operaração a maiores temperaturas e menor P o Xyt . Os resultados obtidos nas etapas do processo de conversão de xilose em xilitol, confirmaram o potencial da levedura Debaryomyces hansenii UFV-170 na conversão de xilose em xilitol. / Two hundred fifty-two yeast isolated from a dairy industry environment, eighteen yeast isolated from coffee fruits and eleven filamentous fungi from the Universidade Federal de Viçosa, Microbiology Department fungal collection were screened for xylitol production by growing them in mineral medium supplemented with 1% D-xylose and 0.5% yeast extract, at 30°C and 100 rpm. Nineteen yeast that presented volumetric productivities (Q P ) between 0.06 and 0.12 g L -1 h -1 and yields (Y P/S ) from 0.14 to 0.57 g g -1 were selected. Xylitol production by the filamentous fungi was low, varying from 0.14 to 0.52 g L -1 presenting volumetric productivities (Q P ) from 0.002 to 0.006 g L -1 h - . In a second screening of the nineteen yeast selected, for six isolated, xylitol production varied from 4.60 to 6.23 g L -1 when starting with 10.73 g L -1 D-xylose. Specific productivities (q P ) varied between 0.17 and 0.26 mmol g -1 h -1 , Q P from 0.10 to 0.13 g L -1 h -1 and Y P/S from 0.43 to 0.58 g g -1 . Yeast 1.70 stood out, producing 6.23 g L - xylitol (Q P =0.13 g L -1 h -1 , q P =0.26 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.58 g g -1 ). Yeast 1.70 proved promising for xylitol production and its optimal growth conditions were therefore determined. The best D-xylose concentration was 51.35 g L -1 , resulting in production of 32.70 g L -1 xylitol (Q P =0.49 g L -1 h -1 , q P =0.49 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.64 g g -1 ). The best fermentation parameters were obtained using 1.45 g L -1 of cellular mass xiiias initial inoculum (36.2 g L -1 xylitol from 56.80 g L -1 D-xylose, Q P =0.60 g L -1 h -1 , q P =0.58 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.65 g g -1 ). The best aeration rate was obtained at 200 rpm, producing 27.20 g L -1 xylitol from 46.70 g L -1 D-xylose (Q P =0.90 g L -1 h -1 , q P =0.74 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.57 g g -1 ). The addition of 0.5% MERCK ® yeast extract produced 33.00 g L -1 xylitol from 49.40 g L -1 D-xilose (Q P =0.64 g L -1 h -1 , q P =0.67 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.65 g g -1 ) while the addition of 0.5% DIFCO ® yeast extract produced 33.65 g L -1 xylitol from 47.00 g L -1 D-xylose (Q P =0.67 g L -1 h -1 , q P =0.60 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.72 g g -1 ). Yeast 1.70 was characterized through physiological, biochemical and morphological tests, in an attempt to identify it. However, in spite of a morphological similarity to the genus Pichia, results were inconclusive.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-26T15:38:46Z No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeRibeiroJanner.pdf: 3587734 bytes, checksum: 6494e7c26c43ea25cd5467838b18e9b9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-27T12:18:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeRibeiroJanner.pdf: 3587734 bytes, checksum: 6494e7c26c43ea25cd5467838b18e9b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-27T12:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeRibeiroJanner.pdf: 3587734 bytes, checksum: 6494e7c26c43ea25cd5467838b18e9b9 (MD5) / Para o melhor aproveitamento da biomassa na produção de etanol lignocelulósico, a xilose, principal açúcar que compõe a hemicelulose, poderia ser fermentada juntamente com a glicose. No processo fermentativo, o micro-organismo mais utilizado é a levedura Saccharomyces cerevisiae, uma excelente produtora de etanol. Contudo, esta levedura não é capaz de fermentar pentoses, como a xilose. Embora já tenham sido desenvolvidas linhagens recombinantes que são capazes de metabolizar xilose, o processo ainda não é eficiente, sendo uma das limitações o transporte deste açúcar, que é realizado por meio de transportadores de hexose. Para analisar o influxo de xilose e assim verificar a afinidade de transportadores capazes de realizar a internalização deste açúcar, foi construído um nanosensor baseado na proteína periplasmática XBP (Xylose Binding Protein) e em proteínas fluorescentes. Assim, a XBP foi fusionada e flanqueada por duas variantes da GFP (Green Fluorescent Protein), a eCFP (Cyan Fluorescent Protein) e a Vênus (Yellow Fluorescent Protein), cujos espectros de emissão e excitação, respectivamente, são sobrepostos, permitindo assim a ocorrência do FRET. Alterações neste fenômeno podem ser mensuradas, permitindo o monitoramento de moléculas com resolução espacial e temporal in vivo e de mudanças conformacionais de proteínas associadas à interação de um ligante. Além disso, foi construída uma versão truncada do nanosensor, portando uma deleção na XBP para monitorar o processo de ligação do açúcar à proteína, mediante uma alteração mais expressiva do FRET. Primeiramente foram realizados estudos de modelagem a fim de verificar se o nanosensor apresentaria uma estrutura que favoreceria o FRET. Com a sequência definida, o gene foi sintetizado e posteriormente, foi realizada uma deleção de 69 pb no domínio de ligação à xilose por meio de PCR. Os dois genes codantes para o nanosensor intacto e truncado foram expressos em Escherichia coli. Após a purificação de ambas as proteínas por meio de cromatografia de afinidade, verificou-se ocorrência do FRET por ensaios de fluorimetria para os dois nanosensores. O nanosensor intacto exibiu uma Kd por xilose de aproximadante 3,41 μM a 25 ºC enquanto que o nanosensor truncado apresentou uma Kd de aproximadamente 0,97 μM na mesma temperatura, possuindo este maior afinidade pelo açúcar que o nanosensor intacto. Para este também foram calculados os parâmetros termodinâmicos da interação, a qual exibiu um H de aproximadamente 13 kcal/mol, S de 68 cal/mol.K e G de -7 kcal/mol. Estes valores indicam que a interação é espontânea, entropicamente guiada e favorecida por interações hidrofóbicas. Ensaios de especificidade do nanosensor intacto demonstraram que este também possui afinidade pelos açúcares xilulose (Kd de 0,24 μM) e xilitol (Kd de 0,31 μM). A expressão do nanosensor intacto em Saccharomyces cerevisiae revelou que os fluoróforos encontram-se funcionais no citoplasma da célula, porém não foi verificada a ocorrência do FRET, sendo necessária a otimização do ensaio in vivo. _______________________________________________________________________ ABSTRACT / Xylose, a highly abundant pentose present in hemicellulose, can be fermented along with glucose to improve harnessing of biomass to produce lignocellulosic ethanol. The yeast Saccharomyces cerevisiae is widely used in fermentative processes but is unable to use pentoses. Although strains that metabolize xylose had already been developed, the process remains inefficient. One bottleneck is the uptake of this sugar, since this is carried out by hexose transporters. Hence, studies on xylose transport are of utmost interest. In order to analyze the xylose uptake and therefore evaluate the affinity of sugar transporters, a nanosensor was built based on XBP (Xylose Binding Protein) fused to two variants of GFP (Green Fluorescent Protein), the eCFP and the eYFP, whose emission and excitation spectra, respectively, are overlapped, allowing the occurrence of FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Modifications in this phenomenon can be measured, which enables molecules monitoring of conformational changes in proteins, which is associated with a binding event. Besides, a new version of the nanosensor was constructed by PCR, which contains a deletion in XBP in order to evaluate if there is an increase in FRET efficiency. First of all, modelling studies were performed to verify if the nanosensor would present a tridimensional structure that enables the FRET occurrence. Then, the encoding genes for both nanosensors were expressed in Escherichia coli. Following the protein purification of both nanosensors by affinity chromatography, the occurrence of FRET was checked by fluorimetric assays. The intact nanosensor exhibited a Kd of 3,41 μM at 25 ºC, while the truncated nanosensor exhibited 0,97 μM for Kd at the same temperature, demonstrating that the last one has more affinity for xylose than the intact nanosensor. For this, the thermodynamics parameters of the interaction were calculated, which exhibited a H of 13 kcal/mol, S of 68 cal/mol and a G of -7 kcal/mol. These values indicated that the interaction is spontaneous, driving by entropy and favored by hydrophobic interactions. Also, specificity assays for intact nanosensor showed that it has affinity for xylulose (Kd of 0,24 μM) and xylitol (Kd of 0,31 μM). The expression of the intact nanosensor in Saccharomyces cerevisiae showed that the fluorophores are functional, but occurrence of FRET was not observed, being necessary the optimization of the in vivo assay.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-11-11T14:55:25Z No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-04T13:59:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T13:59:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / O aumento na demanda por fontes de energia alternativa e as preocupações com os impactos ambientais tem incentivado o desenvolvimento de tecnologias para a produção de combustíveis a partir de biomassa lignocelulósica, como o etanol de segunda geração (2G). No entanto um dos açúcares mais abundante nas biomassas lignocelulósicas, a xilose, não pode ser convertida a etanol devido à incapacidade da levedura Saccharomyces cerevisiae, microrganismo mundialmente utilizado na indústria para produção de etanol, de converter eficientemente esse substrato em xilulose. A tecnologia baseada em metabolômica mostra-se eficiente, como uma ferramenta para auxiliar na determinação das etapas limitantes na via metabólica de fermentação da xilose. Neste trabalho, foram desenvolvidos e otimizados dois protocolos para análise de metabolômica targeted, utilizando como plataforma analítica a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS) com experimentos de MRM. Os métodos de separação foram baseados na cromatografia por pareamento iônico utilizando uma coluna de fase reversa (HSS-T3) e na cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), utilizando uma coluna quimicamente modificada com o grupo amida. Catorze padrões de metabólitos presentes na via de fermentação da xilose puderam ser identificados através de dois métodos complementares. Estes protocolos foram aplicados qualitativamente durante a avaliação de duas leveduras, Scheffersomyces stipitis e Spathaspora passalidarum. O preparo de amostra foi realizado em duas etapas: quenching e extração dos metabólitos. Os métodos de separação e detecção se mostraram promissores para a análise de rotina em processos de fermentação de xilose. / The increase in demand for alternative energy sources and concerns about the environmental impacts has encouraged the development of technologies for the production of fuels from lignocellulosic biomass, such as ethanol from second generation (2G). However one of the most abundant sugars in lignocellulosic biomass, xylose, can not be converted into ethanol due to the inability of yeast Saccharomyces cerevisiae, which is a microorganism used worldwide in the industry for the production of ethanol, to convert this substrate into xylulose efficiently. The technology based on metabolomics proves to be efficient as a tool to identify the crucial steps in the metabolic pathway of xylose fermentation. In this work, we developed and optimized two protocols for targeted metabolomics analysis, using as an analytical platform liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) with MRM experiments. Separation methods were based on the ion pairing chromatography using a reverse phase column (HSS-T3) and hydrophilic interaction chromatography (HILIC) with a chemically modified column with amide group. Fourteen patterns of metabolites present in the xylose fermentation pathway could be identified using two complementary methods. These protocols were applied qualitatively during the evaluation of two yeast, Scheffersomyces stipitis and Spathaspora passalidarum. The sample preparation was performed in two stages: quenching and extraction of metabolites. The methods of separation and detection were promising for routine analysis in the xylose fermentation processes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-10-16Bitstream added on 2014-06-13T19:35:27Z : No. of bitstreams: 1 kiiper_pg_me_rcla.pdf: 773936 bytes, checksum: 1b480acb49acd45ba8d3f3f9a6e99ca8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A utilização de solvente Organosolv em condições de acidez e temperaturas elevadas para a realização da deslignificação de bagaço de cana e hidrólise da fração de hemicelulose tem sido muito estudada e existem muitos parâmetros experimentais já descritos na literatura. Tem sido obtidos bons resultados de deslignificação e hidrólise parcial do bagaço a partir do prétratamento ácido com solvente Organosolv utilizando misturas de etanol e água, normalmente em proporções iguais de volume de cada. Este estudo descreve um método de deslignificação e hidrólise da hemicelulose do bagaço da cana combinando a utilização da mistura dos solventes orgânicos, acetona e álcool, com água e solução ácida diluída. A mistura do solvente organosolv (acetona+álcool/água – 1:1 v/v), concentração ácida de 0,5 - 2,0% de H2SO4, e tempo de reação de 30 a 120 minutos e 5,0% de bagaço (p/v) foi realizado para o pré-tratamento. O efeito do ácido, solvente e temperatura no rendimento e extensão da deslignificação e hidrólise da oram estudados. Os resultados obtidos indicam importantes diferenças no pré-tratamento ácido com solvente Organosolv, devido ao uso da acetona e concentração ácida empregados nos experimentos deste estudo. Os melhores resultados foram obtidos com 1,0% de H2SO4 e 120 °C. Sob estas condições o rendimento de açúcares obtidos da hidrólise ácida da porção de hemicelulose do bagaço de cana foi de 7.53%. Estes resultados demonstram um rendimento de açúcares fermentescíveis que podem ser utilizados como fonte de carbono para a fermentação alcoólica por Pachysolen tannophilus. A conversão de Xilose em etanol por Pachysolen tannophilus é relativamente ineficiente nas condições de fermentação estudada. Esta ineficiência é atribuída em partes, ao consumo de etanol pela levedura concorrente à sua produção, baixa eficiência... / The utilization of Organosolv solvents under acid and high temperature conditions in the delignification and hemicelulose and cellulose hydrolysis of wood and bagasse has already been reported in the literature for several experimental parameters. Organosolv treatment of sugarcane bagasse has also been reported and has shown good results with ethanol–water mixtures, normally at volume ratios close to unit. This study describes a method of the delignification hemicelulose hydrolysis of sugarcane bagasse combining the use of ethanol+acetone/water mixtures and diluted acid solutions. Ethanol+acetone/water mixture (1:1 v/v), acid concentration of 0,5 - 2,0% of H2SO4, reaction times from 30 to 120 min, and 5,0% of sugarcane bagasse (w/v) was carried out for bagasse pre-treatment. The effect of acid, solvent and temperature on the yield and extent of delignification and hemicelulose hydrolysis was studied. The obtained results indicate important differences from the Organosolv process, which may be due to the presence of acetone and acid concentration employed in this work. The best results were obtained at 1,0% of H2SO4 and 120 °C. Under these conditions the sugar yield obtained from hemicelulose hydrolysis from sugarcane bagasse 7.53%. These results shows that the sugar yield obtained can be used as carbon source for Pachysolen tannophilus fermentation to produce ethanol. The conversion of D-xylose to ethanol by the yeast Pachysolen tannophilus is relatively inefficient in batch culture. The inefficiency has been attributed in part to concurrent utilization of ethanol, slow fermentation metabolism of the yeast and to the formation of xylitol and other by-products. The xylose concentration in the must was 2,0% during 120 hours of fermentation. The best ethanol yield was obtained in the first 24 hours, as the ethanol began to be consumed and the sugar concentration became low... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-29T16:50:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 779343 bytes, checksum: bb6da3269b45321b19e14fd929a014d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-29T16:50:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 779343 bytes, checksum: bb6da3269b45321b19e14fd929a014d4 (MD5) Previous issue date: 2017-07-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A levedura Spathaspora passalidarum converte de maneira eficiente xilose a etanol, se destacando para fermentação de hidrolisados lignocelulósicos. Possui uma cópia adicional do gene que codifica a enzima xilose redutase (XYL 1.2) com preferência pelo cofator NADH, permitindo o estabelecimento do equilíbrio redox durante o metabolismo de xilose. O objetivo deste trabalho foi analisar como a glicose influencia a fermentação de xilose por S. passalidarum. A avaliação do crescimento em meio contendo xilose e 2-DOG revelou que S. passalidarum não possui repressão por glicose no metabolismo de xilose. Foram feitos ensaios fermentativos em batelada com xilose e/ou glicose em aerobiose e hipoxia, para avaliação dos parâmetros cinéticos de fermentação e crescimento. S. passalidarum apresentou maiores rendimentos de biomassa no cultivo em glicose comparado ao cultivo em xilose nas duas condições de oxigênio. O melhor rendimento e produtividade de etanol foram encontrados no cultivo em xilose em aerobiose (Y (P/S) = 0,45 g/g e Qp= 1,51 g/L.h). A mistura de açúcares, glicose e xilose não interfere nos rendimentos ou produtividades de etanol, visto que foram similares aos encontrados durante a fermentação de xilose. O perfil de consumo dos açúcares em cofermentação foi diferente nas duas condições de oxigênio. As análises da expressão dos genes que codificam as enzimas do metabolismo de xilose (XR, XDH e XK) por qRT-PCR revelaram que esses genes são induzidos por xilose e não são reprimidos por glicose. Os dois genes que codificam a enzima xilose redutase (XR) em S. passalidarum apresentaram perfil de expressão diferente em xilose e cofermentação. No cultivo em xilose (aerobiose e hipoxia) e cofermentação em aerobiose, o gene XYL 1.2 foi mais expresso do que o gene XYL 1.1. Entretanto, no cultivo em cofermentação em hipoxia o gene XYL 1.1 foi mais expresso do que o gene XYL 1.2, sugerindo que a expressão destes genes pode ser controlada pelo estado redox da célula. Dessa forma, o consumo simultâneo ou não dos açúcares glicose e xilose em diferentes condições de oxigênio por S. passalidarum, não é uma questão de repressão da glicose na síntese das enzimas do metabolismo de xilose, e sim uma adaptação fisiológica da célula para estabelecer o equilíbrio redox. / The yeast Spathaspora passalidarum efficiently converts xylose to ethanol, standing out for fermentation of lignocellulosic hydrolysate. It has an extra copy of the gene that encodes the enzyme xylose reductase (XYL 1.2) which prefers the cofactor NADH, allowing the establishment of a redox balance during xylose metabolism. The aim of this work was to analyze how glucose exerts influence on xylose fermentation by S. passalidarum. The evaluation of growth on medium containing xylose and 2-DOG revealed that S. passalidarum does not show glucose repression on xylose metabolism. Batch fermentative experiments were performed with xylose and/or glucose in aerobic condition and hypoxia, in order to evaluate the kinetic parameters of fermentation and growth. S. passalidarum showed higher biomass yields when cultivated in glucose compared to xylose in both oxygen conditions. The best ethanol yield and productivity was found in growth with xylose in aerobic condition (Y (P/S) = 0,45 g/g e Qp= 1,51 g/L.h). The mix of sugars glucose and xylose did not interfere on ethanol yield and productivity, once these parameters were similar to those found during xylose fermentation. The profile of sugar consumption in co-fermentation was different in the two oxygen conditions tested. The expression levels of the genes that encode the xylose metabolism enzymes (XR, XDH e XK) were analyzed by qTR-PCR and the results revealed that these genes are induced by xylose and are not repressed by glucose. The two genes that encodes the enzyme xylose reductase (XR) in S. passalidarum showed distinct expression profiles in xylose and co-fermentation. When cultivated in xylose (aerobic condition and hypoxia) and aerobic co-fermentation, the gene XYL 1.2 was more expressed than the gene XYL 1.1. However, the gene XYL 1.1 was more expressend than the gene XYL 1.2 when cultivation was performed in hypoxic co-fermentation, which suggests that the expression levels of these two genes might be controlled by the redox state of the cell. Thus, the simultaneous or non-simultaneous consumption of glucose and xylose under different oxygen conditions by S. passalidarum is not about glucose repression on the synthesis of xylose metabolism enzymes, but rather a physiological adaptation of the cell to establish the redox balance.

Orientadores: Gustavo Henrique Goldman, Juliana Velasco de Castro Oliveira / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T07:09:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_ThuannyAndrade_M.pdf: 7098529 bytes, checksum: 5b56fca196314bf7920ad2d7b03aefc7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A completa utilização da biomassa lignocelulósica é um dos pré-requisitos para tornar o processo do etanol de segunda geração economicamente competitivo. Entretanto, a fermentação dos açúcares disponíveis na biomassa celulósica apresenta um desafio único em decorrência da presença de outros açúcares, além da glicose, tais como xilose e arabinose, os quais não são fermentáveis por Saccharomyces cerevisiae, a principal levedura utilizada na indústria. Em leveduras, a conversão de D-xilose a D-xilulose ocorre em duas etapas: inicialmente D-xilose é reduzida a D-xilitol pela enzima xilose redutase (XR); em seguida, D-xilitol é oxidado a D-xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (XDH). Em S. cerevisiae, essas duas enzimas possuem cofatores distintos, provocando assim um desequilíbrio redox na célula, impedindo a utilização anaeróbica de pentoses. Uma alternativa para que S. cerevisiae possa produzir etanol através destes açúcares é modificá-la geneticamente com genes provenientes de micro-organismos que naturalmente realizem esta conversão. Dessa forma, este projeto isolou e caracterizou as leveduras Rhodotorula dairenensis TAB01 e Pseudozyma brasiliensis sp.nov. GHG001, a partir do intestino de insetos parasitas da cana-de-açúcar, através da análise de expressão dos genes xyl1 e xyl2 que codificam, respectivamente, as enzimas XR e XDH. Adicionalmente, foi avaliada a hiper-expressão destes na cepa industrial de S. cerevisiae PE-2 e na cepa PE-2 super-expressando o gene XKS1 de S. cerevisiae (PE-XKS), o qual codifica a enzima xilulose quinase (XK). P. brasiliensis GHG001 e R. dairenensis TAB01 mostraram-se promissoras para o estudo. Estas duas espécies são ótimas assimiladoras de xilose e seus genes de XR e XDH foram expressos heterologamente em S. cerevisiae, gerando as cepas PE Rd, PE Pb, PE-XKS Rd e PE-XKS Pb, que foram testadas quanto a capacidade de utilizar xilose para crescimento. Porém, essas cepas recombinantes não conseguiram utilizar xilose como única fonte de carbono, o que evidencia o quão importante é o desbalanço de cofatores das enzimas no metabolismo de xilose. Além disso, devido a uma notável importância biotecnológica, também foi caracterizada uma enzima xilanolítica produzida por P. brasiliensis GHG001 a qual apresentou uma alta atividade xilanolítica. Essa xilanase, pertencente à família GH11, apresentou pH e temperatura ótimos iguais a 4 e 55°C, respectivamente, sendo sua estrutura secundária constituída de folhas beta. A sua atividade enzimática é influenciada por alguns íons como Ca2+ e os resultados de sua cinética indicaram um comportamento sigmoidal característico de enzimas alostéricas. Usando xilano como substrato, esta xilanase produz xilooligossacarídeos que podem ser usados industrialmente como prébióticos, que junto a outras aplicabilidades desta enzima na indústria, demonstram seu alto potencial biotecnológico / Abstract: Full utilization of lignocellulosic biomass is one of the prerequisites to make the process of second generation ethanol economically competitive. However, the fermentation of sugars available in cellulosic biomass presents a unique challenge due to the presence of other sugars besides glucose, such as xylose and arabinose, which are not fermentable by Saccharomyces cerevisiae, the main yeast used in the industry. In yeasts, the conversion of D-xylose to D-xylulose occurs in two steps: first D-xylose is reduced to xylitol by the enzyme D-xylose reductase (XR), and then D-xylitol is oxidized to D-xylulose by the enzyme xylitol dehydrogenase (XDH). In S. cerevisiae, these two enzymes have different cofactors, thereby causing a redox imbalance in the cell, preventing the use of pentoses anaerobically. An alternative to S. cerevisiae can produce ethanol by these sugars is genetically modifying it with genes derived from microorganisms that naturally carry out this conversion. Thus, this project characterized the yeasts Rhodotorula dairenensis TAB01 and Pseudozyma brasiliensis GHG001, isolated from the gut of insects pests of sugarcane, through the analysis of genes expression of xyl1 and xyl2 which encoding respectively, the XR and XDH enzymes and measured the enzymatic activity of the same. Additionally, was evaluated the overexpression of these in S. cerevisiae industrial strains PE-2 and PE-2 XKS1 overexpressing xks1 gene of S. cerevisiae, which encodes the enzyme xylulokinase (XK). P. brasiliensis GHG001 and R. dairenensis TAB01 shown promise for this study as they are great xylose assimilators and their assimilating xylose genes are expressed in the presence of this sugar. XR and XDH were heterologously expressed in S. cerevisiae, generating strains Rd PE, PE Pb, PE-XKS Rd and PE-XKS Pb, which were tested for the ability to utilize xylose for growth. However, these recombinant strains were unable to utilize xylose as sole carbon source, which shows how important is the imbalance of cofactors of the metabolize xylose enzymes. Moreover, due to a remarkable biotechnological importance, has also been characterized a xylanolytic enzyme produced by P. brasiliensis GHG001 which showed a high activity, yet unreported by other eukaryotic microorganism. This xylanase belonging to family GH11, showed pH and temperature optima equal to 4 and 55°C, respectively, and its secondary structure consists of ?-sheets. This enzyme has influence of some ions such as Ca2+ and showed a sigmoidal kinetic behavior, characteristic of allosteric enzymes. From xylan, the xylanase produces xylooligosacharides which can be used industrially as prebiotics, which together with other applicability of this enzyme in the industry, demonstrate their high biotechnological potential / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-04T13:08:41Z No. of bitstreams: 2 Dissertação- Kassandra Mendes Versão Final com ficha.pdf: 2822925 bytes, checksum: 48b536c35ab8f530a79dd738feceb4d6 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T13:08:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação- Kassandra Mendes Versão Final com ficha.pdf: 2822925 bytes, checksum: 48b536c35ab8f530a79dd738feceb4d6 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / Os resíduos agroindustriais, fontes de matéria-prima lignocelulósica, podem ser utilizados tanto na produção de bioetanol quanto na obtenção de produtos químicos de alto valor agregado, como polióis, ácidos orgânicos e aldeídos, substituindo assim as fontes não-renováveis. Dentre os resíduos da cana-de-açúcar, foca-se na palha de cana-de-açúcar que apresenta grande potencial para geração de calor, eletricidade, produção de etanol celulósico e outros produtos. Sendo composta basicamente de celulose e hemicelulose (fontes de açúcares) e lignina, forma uma complexa estrutura bastante recalcitrante com difícil disponibilização de seus carboidratos. Para tal fim aplica-se uma etapa de pré-tratamento, que tem como objetivo alterar ou remover a lignina e a hemicelulose, aumentar a área superficial da celulose e diminuir seu grau de polimerização e sua cristalinidade. Neste trabalho foi realizado o pré-tratamento da palha da cana-de-açúcar com ácido sulfúrico diluído variando-se os seguintes fatores: temperatura, tempo de reação, carga de sólidos e concentração de ácido em relação à massa do resíduo. No sentido de se proporcionar a ocorrência de mistura de carboidratos para processamento químico visando obtenção de produtos de alto valor agregado foi aplicado um planejamento experimental do tipo Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR) consistindo de 27 experimentos. Visou-se obter a melhor condição para otimização da produção de xilose aliada a uma baixa formação de produtos de degradação (ácido fórmico, ácido acético, hidróxi-metil-furfural e furfural). Baixa carga de sólidos (10% em massa), baixa concentração de ácido (0,5% em massa), tempo intermediário (15 min) e temperatura baixa (105°C) foram identificadas como as melhores condições para se operar o processamento. Cosntatou-se que tal condição favoreceu uma melhor quantidade de xilose presente no hidrolisado aliada a poucas quantidades de produtos de degradação.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T12:34:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1875901 bytes, checksum: 7f1d304af718ecd82eb71caef248e486 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T12:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1875901 bytes, checksum: 7f1d304af718ecd82eb71caef248e486 (MD5) Previous issue date: 2011-12-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Kluyveromyces marxianus são leveduras promissoras para a fermentação de glicose e xilose, os principais açúcares presente no hidrolisado de bagaço de cana. No presente trabalho, foi investigado o consumo de xilose em presença de glicose bem como a capacidade de K. marxianus em fermentar várias combinações desses dois açúcares. Células de K. marxianus UFV-3 cultivadas em 20 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose apresentaram um período de adaptação de 30h para o início do consumo da xilose, após a glicose ter sido totalmente consumida. Entretanto, esse período de adaptação não foi observado quando as células foram cultivadas em 5 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose. Nessas condições, as células começaram a consumir xilose logo após a glicose ter sido exaurida do meio. Além disso, foi demonstrado que glicose e xilose podem ser consumidas simultaneamente, quando a respiração é bloqueada. A produção de etanol foi maior quando em mistura de glicose e xilose comparado à glicose sozinha. Por outro lado, K. marxianus UFV-3 não foi capaz de produzir etanol a partir de xilose nas condições avaliadas. Visando selecionar uma linhagem capaz de fermentar xilose, células de K. marxianus UFV-3 foram submetidas à engenharia evolutiva. Mutagênese foi aplicada com o intuito de aumentar a variabilidade genética da população e diminuir o tempo de seleção. Duas técnicas para inserção de mutações aleatórias foram utilizadas: REMI (Integração Mediada por Enzima de Restrição) e radiação ultravioleta (UV). Populações mutantes foram submetidas à seleção em quimiostatos e em bateladas sequenciais. Em quimiostato conduzido sob hipoxia, com uma taxa de diluição de 0.15 h-1 e uma mistura de 5 gL-1 glicose e 10 gL-1 xilose, isolou- se um mutante da população de células submetidas à REMI (KmRhyp). Este isolado produziu 12% mais etanol que a linhagem selvagem, mas com dobro de xilitol. Em batelada sequencial foi isolado um mutante da população irradiada por UV (KmUVsb) capaz de formar etanol de xilose e produzir menor quantidade de xilitol que a linhagem selvagem. Diferenças entre a linhagem selvagem e KmUVsb foram relacionadas a diferenças observadas na atividade de algumas enzimas. A razão entre as atividades específicas da xilitol desidrogenase e da xilose redutase foi maior para a linhagem mutante. As atividades específicas das enzimas da via fermentativa: piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase também foram maiores em KmUVsb. Culturas conduzidas em quimiostato limitado por xilose sob condições de aerobiose foram submetidas a um pulso de glicose (50 mmoles.L-1). Nem a linhagem selvagem nem a mutante produziram etanol instantaneamente, confirmando efeito Crabtree-negativo. Etanol foi detectado no sobrenadante após 60 minutos, e a produção deste metabólito foi duas vezes maior na linhagem mutante. Além disso, KmUVsb foi capaz de crescer em anaerobiose estrita na presença de xilose como única fonte de carbono. / Kluyveromyces marxianus strains are promising candidates to ferment glucose and xylose, the main sugars in hydrolyzed sugarcane bagasse. In this work, it was investigated the xylose consumption in the presence of glucose and the K. marxianus UFV-3 ability to ferment various combinations of these two sugars. K. marxianus UFV-3 cultured on 20 gL-1 glucose and 20 gL-1 xylose presented a lag phase of 30h to start xylose consumption after glucose depletion. However, this period of adaptation was not observed when cells were grown on 5 gL -1 glucose and 20 gL-1 xylose. Under these conditions, the cells began to consume xylose after glucose had been exhausted. Furthermore, it was demonstrated that glucose and xylose can be consumed simultaneously, when respiratory chain is blocked. The ethanol production was higher in a glucose/ xylose mixture compared to glucose alone. K. marxianus UFV-3 was not able to produce ethanol from xylose. In order to select a strain able to ferment xylose, K. marxianus UFV-3 were subjected to evolutionary engineering. Mutagenesis was applied to increase the genetic variability of the population and to reduce the selection time. Two methods for random mutations were used: REMI (Restriction Enzyme Mediated Integration) and ultraviolet irradiation (UV). Mutant populations were subjected to selection in chemostats and sequential batches. In chemostats conducted under hypoxia, with a dilution rate of 0.15 h -1 in a 5 gL-1 glucose and 10 gL-1 xylose mixture, a mutant from REMI population was isolated (KmRhyp). The isolate produced 12% more ethanol but with twice xylitol compared to the wild type. In sequential batches, it was isolated a mutant from the UV irradiated population (KmUVsb) which was able to form ethanol from xylose with 2-times less xylitol than wild type strain. The differences between wild type and KmUVsb were related to differences in the activity of some enzymes. The ratio of xylitol dehydrogenase specific activity to xylose reductase specific activity was higher in the mutant strain. The specific activities of fermentative pathway enzymes: pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase were also higher in KmUVsb. Cultures conducted in xylose- limited chemostats under aerobiosis were subjected to glucose pulse (50 mmoles/L). Neither the wild type nor the mutant strain formed ethanol instantly, confirming Crabtree-negative effect. Ethanol was detected on the supernatant after 60 minutes and it was twice as high as for mutant strain. In addition, KmUVsb was able to grow under strict anaerobiosis in the presence of xylose as the only carbon source.

Orientador: Lucia Regina Durrant / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T14:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rossi_RaquelAndradede_M.pdf: 2252972 bytes, checksum: c504b3299931a04c688b6e1100f129fb (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O bagaço da cana-de-açúcar é considerado uma biomassa lignocelulósica promissora para a produção de etanol, devido a sua composição em açúcares, grande disponibilidade e baixo custo. A levedura Saccharomyces cerevisiae, embora apresente atributos ideais para o uso industrial, não é capaz de fermentar alguns açúcares presentes nesta biomassa, como xilose e arabinose (açúcares não convencionais). Assim, é interessante a busca por leveduras em nichos ecológicos onde esses açúcares estão presentes. O Brasil apresenta uma rica biodiversidade, qualificada pela diversidade em: ecossistemas, espécies biológicas e endemismos. Utilizar ecossistemas característicos do território brasileiro como fonte de coleta oferece a oportunidade não só de obter novas espécies, mas também de isolar aquelas capazes de fermentar diferentes substratos. De acordo com o exposto, o objetivo deste trabalho foi de isolar, a partir de amostras de biomas brasileiros, leveduras que apresentassem a habilidade em fermentar alguns açúcares, além da glicose e frutose, especialmente os que compõem o hidrolisado do bagaço da cana-de-açúcar (açúcares não convencionais). Os resultados demonstraram que as linhagens isoladas não apresentaram habilidade em fermentar as principais pentoses (xilose e arabinose) presentes no bagaço da cana-de- açúcar. Contudo, 19 foram capazes de assimilar a xilose, e 12 linhagens, a arabinose. Desta forma, como sugestão, o hidrolisado do bagaço da cana-de-açúcar pode ser utilizado para a produção de biomassa protéica (single cell protein) pelas linhagens que assimilaram xilose e arabinose / Abstract: Sugarcane bagasse is considered a promising lignocellulosic biomass for ethanol production, due to its sugar composition, high availability and low price. Although, Saccharomyces cerevisiae has the ideal attributes for industrial use, it is not able to ferment some sugars present in this biomass such as xylose and arabinose (non-convencional sugars). Thus, it is interesting to search for yeasts in ecological niches where these sugars are present. Brazil has a rich biodiversity, qualified for its diversity in: ecosystems, biological species and endemisms. To use the ecosystems characteristics of the Brazilian territory as a source for sample collection offers the opportunity not only to obtain new species, but also to isolate those capable of fermenting diverse substrates. Therefore, the aim of this study was to isolate from samples of Brazilian biomes, yeasts that have the ability to ferment some sugars, besides glucose and fructose, especially those components of the sugarcane bagasse hydrolizate (non-convencional sugars). The results demonstrated that the isolated strains had no ability to ferment the main pentoses (xylose and arabinose) present in sugarcane bagasse. However, 19 strains were able to assimilate xylose, and 12 strains, arabinose. Thus, as suggestion, the sugarcane bagasse hydrolyzate can be used for the production of single cell protein by the strains that assimilate xylose and arabinose / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos