Orientador: Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosselli_LucianaKauer_D.pdf: 3396544 bytes, checksum: 1ed6069e60d6f5966add93778319a1d0 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o programa de seqüenciamento genômico da bactéria Xylella fastidiosa gerou um enorme número de ORFs ("Open Reading Frames" - quadro de leitura aberto ou genes putativos) pertencentes às categorias de patogenicidade, virulência e adaptação deste importante fitopatógeno. Uma destas ORFs (XF 1729) foi anotada como sendo uma fenilacetaldeído desidrogenase de 31,4 kDa. No entanto, a análise de sua seqüência primária de aminoácidos revelou similaridades com proteínas pertencentes à superfamília de aldo-ceto redutases. As proteínas desta superfamília são oxidorredutases NADPH-dependentes relacionadas funcionalmente e estruturalmente. Neste trabalho, a seqüência similar de X fastidiosa foi clonada no vetor de expressão pET32Xa/LIC com o objetivo de super expressar a proteína recombinante fusionada a seis resíduos de histidina em Escherichia colí BL21(DE3). A proteína expressa na fração solúvel foi purificada por cromatografia de afinidade em metal imobilizado (resina Agarose-IDA-Ni). O conteúdo de sua estrutura secundária foi verificado por espectroscopia de dicroísmo circular. As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) forneceram os parâmetros estruturais gerais (raio de giro de 27,5 :I: 0,8 Á e máxima dimensão de 90 Á) e indicaram que a proteína apresenta-se como um monômero em solução. Além disto, os cálculos estruturais ab initio mostraram que a proteína apresenta algumas similaridades com uma aldo-ceto redutase previamente cristalizada. A proteína XF 1729 purificada foi capaz de catalisar a redução dos substratos DL-gliceraldeído (Kcat 2.26 S-l, Km 8.20:1: 0.98 mM) e 2-nitrobenzaldeido (Kcat 11.74 S-l, Km 0.14:1: 0.04 mM) na presença de NADPH. A seqüência de aminoácidos da proteína XFI729 apresentou mais alta identidade (maior que 40%) com inúmeras proteínas de função desconhecida. Entre as AKRs identificadas, encontramos aproximadamente 29% dê identidade com YakC (AKRI3) de Schizosaccharomyces pombe, 30% e 28% com AKRIIA e AKRIIB, ambas de Baci/lus subtiZis, respectivamente. Os resultados estabeleceram a proteína XF 1729 como um novo membro da superfamília das AKRs, da nova sub-família AKR13B 1. Finalmente, os experimentos de caracterização por cromatografia de gel filtração indicaram que a proteína apresenta wna forma alongada, gerando wn peso molecular aparente maior que o esperado. Além da proteína AKRl3B 1, selecionamos mais duas proteínas codificadas pelas ORFs XFl934 e XFl532 para estudos de estrutura e função. A proteína HetI (XFI934), de 22,4 kDa, apresenta similaridade proteínas da família phosphopantetheinyl transferase, sendo necessária à síntese de ácido graxo via acetato na bactéria. A proteína XF1532, de 36,8 kDa, é sirpilar a reguladores transcricionais de extresse oxidativo, sendo sua seqüência similar (44%) à proteína OxyR de Escherichia coZi, a qual pertence à família LysR de reguladores transcricionais. As duas ORFs foram clonadas e expressas em Escherichia coZi, no entanto não foi possível obter a proteína na fração solúvel, impossibilitando o seguimento dos estudos de caracterização estrutural e funcional. A descrição da metodologia utilizada para produção destas proteínas e os resultados preliminares obtidos estão descritos no item Resultados Complementares desta tese. Um amplo benefício no conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da X fastidiosa tem sido esperado, desde o seqüenciamento completo de seu genoma. Neste sentido, passos iniciais foram dados no sentido de se caracterizar a função das proteínas codificadas por seus genes / Abstract: The Xylella fastidiosa genome program generated a large number of gene sequences that belong to pathogenicity, virulence and adaptation categories from this important plant pathogen. One of these genes (XF 1729) was described in the genome annotation as being a phenylacetaldehyde dehydrogenase. However, the XF 1729 primary sequence analysis showed similarities to Aldo-keto reductase superfamily proteins. The AKRs are NADPH-dependent oxidoreductases structurally and functionally related. In this work, the similar sequence XF 1729 from Xylella fastidiosa was cloned onto the pET32Xa/LIC vector in order to over-express a recombinant His- Tag fusion protein in E. coli BL21(DE3). The expressed protein in the soluble fraction was purified 'by immobilized metal affinity chromatography (agarose-IDA-Ni resin). Secondary structure contents were verified by circular dichroism spectroscopy. Small-Angle X Ray Scattering (SAXS) measurements furnish general structural parameters (the particle radius of gyration of 27.5:J::0.8A and the particle maximum dimension of 90A) and provide a strong indication that the protein has a monomeric form in solution. Also, ab initio calculations show that the protein has some similarities with a previously crystallized aldo-keto reductase protein. The recombinant XF1729 purified to homogeneity catalyzed the reduction ofDL-glyceraldehyde (Kcat 2.26 S-I, Km 8.20:J:: 0.98 mM) and 2-nitrobenzaldehyde (Kcat 11.74 S-I, Km 0.14:J:: 0.04 mM) in the presence of NADPH The amino acid sequence deduced from XF 1729 showed the highest identity (40% or higher) with several functionally unknown proteins. Among the identified AKRs, we found approximately 29% of identity with YakC (AKR13) from Schizosaccharomyces pombe, 30% and 28% with AKR11A and AKR11B, both from Bacillus subtilis, respectively. The results establish XF 1729 as the new member of AKR family, AKR13B1. Finally, the first characterization by gel filtration chromatography assays indicates that the protein has an elongated shape, which generates an apparent higher rnolecular weight. Since Xylellafastidiosa 9a5c strain (associated with CVC) is the first plant pathogen to be fully sequenced, a large benefit for the whole field of disease research can be expected. An initial step has been taken towards the characterization the protein function encoded by its genes / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Substratos alternativos têm sido usados para promover um melhor estabelecimento de plantas em viveiros, de forma a assegurar que plantas sadias sejam transferidas ao campo. No caso do Citrus spp. Esta preocupação é real pela possibilidade do campo poder apresentar um histórico de doenças na área, tal como a Clorose Variegada do Citros causada pela Xylella fastidiosa (X.f.). Este estudo avaliou a adição de vermicomposto a um substrato comercial e o desenvolvimento de plântulas de quatro variedades de citros inoculadas ou não com X.f. em condições de casa-de-vegetação, por um período de 450 dias. Medidas biométricas do crescimento da planta e o uso de indicadores do balanço nutricional usando o programa DRIS - Diagnosis and Recommendation Integrated System foram aplicadas em plantas de 9 meses de idade. As variáveis estudadas foram: substrato vermicomposto (100%, 50%, 0%) , variedade (Baia, Pêra, Natal e Escape) e inoculação (com ou sem X.f.) em um total de 24 tratamentos (variedade x substrato x inoculação), com seis repetições. Quanto ao desenvolvimento das plantas, avaliou-se o diâmetro do caule, a altura da planta, a produção de biomassas das raízes e partes aéreas, a taxa de infecção natural por fungos micorrízicos naturais do solo, a concentração de macro e micronutrientes na parte aérea. Quando se usou vermicomposto (100% or 50%), efeitos positivos foram observados nos parâmetros de desenvolvimento das plantas. Por outro lado, a infecção micorrízica e DRIS foram inversamente correlacionadas indicando estar ocorrendo um desbalanço nutricional neste estádio de desenvolvimento das plantas. Não foi observado um efeito significativo da inoculação com X.f. no desenvolvimento das plantas ou mesmo nos parâmetros biométricos, exceto para os teores foliares de nitrogênio e fósforo, onde nas plantas inoculadas o teor foliar de nitrogênio (1,46%) foi maior em relação às plantas não inoculadas (1,30%) e para fósforo ocorreu o oposto (0,32% e 0,40%, respectivamente). / Alternative substrates have being used for a better establishment of plants at nursery stages, thus ensuring that healthier plants will be transferred to the field. In the case of Citrus, this is a concern especially when there is a past history of diseases at field conditions, such as Citrus Variegated Chlorosis caused by Xylella fastidiosa (X.f.). This study evaluated the addition of vermicompost to a commercial substrate and the performance of seedlings of four citrus varieties inoculated or not with X. f. at greenhouse condition, for a period of 450 days. Biometric measurements of plant growth and nutritional balance indicators using DRIS - Diagnosis and Recommendation Integrated System were performed in 9 month-old plants. Mycorrhizal infection by native vesicular-arbuscular fungi was also evaluated in all plants. The studied variables were: vermicompost substrate (100%, 50%, 0%), variety (Baia, Pêra, Natal and Escape) and inoculation (with or without X.f.), in a total of 24 treatments (variety x substrate x inoculation) with 6 replicates each. Growth development evaluated stem diameter, plant height, shoot and root biomass accumulations, arbuscular mycorrhizal infection, and macro and micronutrient concentration in the shoot. When using vermicompost (100% or 50%), positive effects were observed in the plant growth parameters. On the other hand, mycorrhizal infection and DRIS were inversely correlated to the substrate addition, indicating that nutrient imbalances may be occurring at this plant growth stage. No significant effect of X.f. inoculation was observed on the plant growth and the biometric parameters studied, except for increased foliar nitrogen content - 1,46% for inoculated and 1,30% for uninoculated plants, and decreased foliar phosphorus content - 0,32% for inoculated and 0,40% for uninoculated plants.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.

A citricultura paulista pode ser considerada uma das mais competitivas e importantes atividades agroindustriais do Brasil, gerando aproximadamente 400 mil empregos e adicionando anualmente U$ 1,4 bilhões ao país. Entretanto ainda apresenta uma produtividade inferior àquela encontrada na Flórida, principalmente devido a deficiências nutricionais e hídricas e a doenças que há diversos anos atingem às lavouras. Nos últimos dez anos a clorose variegada dos citros (CVC), conhecida popularmente como a doença do amarelinho, apresenta-se como o principal problema, sendo a bactéria gram-negativa Xylella fastidiosa seu agente causal. Em vista da importância do cultivo da laranja no país, o projeto \"Genoma Xylella fastidiosa\" foi proposto, visando o seqüenciamento total do genoma deste fitopatógeno bem como o treinamento de pessoal capacitado na utilização das modernas técnicas de biologia molecular. Segmentos de DNA provenientes de 7 cosmídeos e diversos clones provenientes de bibliotecas de \"shotgun\" genômico foram seqüenciados em nosso laboratório, totalizando 271.220 pb do genoma da bactéria. Em seguida foi feita a anotação das orfs preditas por programa GLIMMER, sendo que em nosso laboratório foram anotadas aproximadamente 290 ORFs. Seqüenciamentos diretamente do genoma e de clones das bibliotecas de RDA foram também realizados, complementando as metodologias de primer walking e construção de bibliotecas de fago utilizadas em outros laboratórios do projeto para o fechamento de \"gaps\". Todos os resultados obtidos em nosso laboratório, somados às contribuições de todos os grupos do projeto, serão base para a melhor compreensão dos mecanismos utilizados pela bactéria, podendo favorecer o desenvolvimento de novas estratégias para o combate desta praga. / The São Paulo\'s citriculture can be considered one of the most competitive and important agroindustrial activity from Brazil. It provides aproximately 400,000 jobs and adds US$ 1,4000,000,000 for the country\'s economy. This activity, however, still shows less productivity than the one from Florida, mainly due to nutritional and hydric deficiencies and plagues that are already present for a long time. In the last ten years, the citrus variegated chlorosis (CVC), also known as little yellow disease, constitutes the main problem for the orange farmers. This disease is caused by gram-negative bacterium Xylella fastidiosa. Due to the importance of the orange cultive in the country, the project called Xylella fastidiosa\'s Genome was proposed. The main goals of this project are to sequence the entire genome of this phytopathogen and the trainning of specialized people in the use of modern techniques of molecular biology. DNA fragments cloned in 7 cosrnids and also form genomic shotgun libraries were sequenced in our laboratory. A total of 271,220 bp of bacteria genome were obtained. The next step was the annotation of the open reading frames (ORFs). This was made using the GLIMMER computer program which generates, in our laboratory, aproximately 290 ORFs. Direct sequencing of the genome and clones of RDA libraries were also done for obtaining nucleotide sequences form gaps. These methodologies complement the primer walking and phage library construction used by other laboratories included in the project. All results, obtained either by our laboratory or the other groups from the project, will be used for a better understanding of the mechanisms used by the bacteria, Altogether, they can be favor the development of new strategies in the plague combact.

This project was designed to correlate environmental variables with the development of Pierce’s Disease (PD), an infection caused by the gram negative bacterium Xylella fastidiosa (Xf), in grapes (Hopkins et al. 2002). PD is one of the most difficult crop pathogens to manage because it is vectored by insects and its continued presence in the vine is usually fatal. PD is influenced by the interaction of host, disease and vector, and probably many other environmental variables. The general objective was to study and identify the most important variables involved in the expression of Pierce’s Disease. Over a two year period, from a total of eight sites in northern and southern California data was collected on forty-five environmental variables including those relating to soil moisture, soil chemistry, soil nutritional status, vine nutritional status, vine water status, in-season and dormant season climate, incidence of Xf in adjacent vineyard vegetation, sharpshooter species and abundance at each location, and proximity of vineyard field sites to citrus or riparian areas. The environmental variables were analyzed with canonical correspondence analysis (CCA) to determine significance of each as they correspond with increased disease severity. The significance of environmental variables produced by CCA indicates increased soil moisture as the leading cause for increased PD incidence; several other environmental variables positively correlate with increased disease presence. Conversely, vineyard factors identified by CCA as not conducive to disease formation may play an inhibitory role in PD severity. We undertook polymerase chain reaction (PCR) to test for the presence of PD in vegetative samples, using a 733 base pair probe specific to Xf. These samples indicate alternative hosts in adjacent locations which act as reservoirs of Pierce’s Disease as well as verifying diseased vines within the vineyard locations.

Orientador: Mônica Alonso Cotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:15:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreau_AlbertoLuisDario_D.pdf: 4972430 bytes, checksum: 23390541e98ea8174b689428392b8457 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Na primeira parte deste trabalho, nós investigamos o processo de crescimento de um biofilme de bactérias (Xylella fastidiosa) inoculadas sobre lamínulas de vidro. O tamanho e a distância entre os biofilmes foram estudados por imagens de microscopia óptica; e uma análise fractal foi realizada usando conceitos de escala e imagens de AFM. Observamos que biofilmes diferentes mostram características fractais semelhantes, embora as variações na morfologia possam ser identificadas para diferentes estádios de crescimento do biofilme. Dois tipos de padrões estruturais são identificados através da dimensão fractal (Df) sugerindo que o crescimento do biofilme pode ser entendido como o modelo de Eden nos estágios de formação e no final, enquanto para o estágio de maturação aparecem evidências do modelo DLA (diffusion-limited aggregation). Estes resultados foram correlacionados à formação da matriz do biofilme que pode dificultar a difusão dos nutrientes e por isso criar condições para um crescimento DLA. Ainda com o AFM, fizemos medidas de espectroscopia de força para estudar a interação específica entre antígeno-anticorpo relacionados ao vírus CTV (citrus tristeza virus). Para tanto foi realizado o estudo da imobilização deste material biológico nas superfícies da ponta do AFM, e nos substratos planos de Si e InP. Usamos para isto imagens topográficas de AFM, imagens de microscopia eletrônica e ensaios imunoquímicos de ELISA; com isso pudemos confirmar que tanto o antígeno quanto o anticorpo foram imobilizados e que eles continuavam em seus estados nativos. Com as medidas de espectroscopia de força, detectamos que a diferença de força entre as interações específicas (antígeno-anticorpo) e não-específicas (antígeno-antígeno) foi de aproximadamente 60%. Utilizamos a mesma rotina de preparação em substrato de InP para o desenvolvimento de um biossensor baseado no funcionamento de um transistor FET (field-effect transistor). Os anticorpos foram imobilizados na superfície do semicondutor, enquanto doses de antígenos livres eram adicionadas a uma célula líquida que mantinha contato com esta superfície. Com curvas de corrente vs tensão em regiões lineares do dispositivo, estudamos a resposta, a sensibilidade e a especificidade do sensor, obtendo resultados promissores indicando viabilidade no desenvolvimento e no uso do mesmo. Por fim, estudamos a durabilidade de pontas de AFM com CNT (carbon nanotube) encapsulados com carbono amorfo numa amostra padrão semicondutora de pontos quânticos, além de estudar a sua estabilidade em meio líquido. Duas pontas foram estudadas, uma fabricada pelo nosso grupo e outra comercial, fornecida pela empresa americana CDI (Carbon Design Inovation). Utilizamos ferramenta de FT (fourier transform) para o estudo da resolução das pontas em imagens topográficas de AFM, e verificamos que ambas as pontas duraram mais de 400 imagens tendo uma perda da resolução de ~ 7% no ar e de ~ 5% ¿ em relação às medidas a seco ¿ em meio líquido, mostrando a viabilidade de seu uso no estudo de amostras biológicas / Abstract: We have investigated the growth process of Xylella fastidiosa biofilms inoculated on glass. The size and the distance between biofilms were analyzed by optical microscopy images; a fractal analysis was carried out using scaling concepts and Atomic Force Microscopy (AFM) images. We observed that different biofilms show similar fractal characteristics, although morphological variations can be identified for the different biofilm stages. Two types of structural patterns are suggested from the observed fractal dimensions Df: and suggest that the biofilm growth can be understood as an Eden model in the initial and final stages, while diffusion-limited aggregation (DLA) seems to dominate the maturation stage. Changes in the correlation length parallel to the surface were also observed; these results were correlated to the biofilm matrix formation which can hinder nutrient diffusion and thus create conditions to drive DLA growth. Atomic force spectroscopy was used as a method to investigate the specific antibody-antigen binding using proteins of the CTV (citrus tristeza virus). Subsequently, the chemical processes of covalent immobilization of the used biomolecules to different solid supports ¿ Si3N4 AFM Tips, Si and InP plane substrates ¿ was developed and characterized. The verification of the chemical binding process by different methods like AFM topography experiments, electron microscopy and ELISA immunochemical assays showed a successful immobilization of the biomolecules and that they were still in their native state. The analysis of the spectroscopic force data showed a significant difference in binding force between the specific antibody-antigen complexes and the non-specific controls (approximately 60%). The same chemical immobilization process was used to bind biomolecules to solid InP supports to develop a biosensor based on the field-effect transistor (FET) principle. The same antibodies, as used in atomic force experiments, were immobilized covalently to the semiconductor surface. The antibody-antigen complexation by adding the specific antigens to the functionalized surface was detected through changes in the current vs tension curves of semiconductor sample. The characterization of the electrochemical response, the molecular sensibility and the specificity of this biosensor showed a suitable method to detect specific molecular binding events. Further, the durability and stability of AFM tips with bonded carbon nanotubes with encapsulated amorphous carbon was studied on a standard semiconductor sample with quantum dots in air and liquid environment. Two different CNT AFM-tips were studied within this study in acoustic mode. One was assembled in our group and the other tip was provided by the american CDI (Carbon Design Innovation) company. The topographic AFM images were analyzed via FT (Fourier Transform) to study the spatial resolution of these tips. In air, both types of CNT tips showed a minor resolution decrease of approximately 6% after 400 topographic scans. In liquid environment an overall 10% lower spatial resolution of the tips was observed compared to the resolution in air which nevertheless makes these CNT AFM-tips suitable for experiments with native biological samples / Doutorado / Biofísica / Doutor em Ciências

Orientador: Mônica Alonso Cotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:58:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorite_GabrielaSimone_D.pdf: 14464970 bytes, checksum: f2238701a88fbbba91e337eda7db2965 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Apresentamos nesta tese uma investigação dos processos físico-químicos da adesão e desenvolvimento de biofilmes da bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa (Xf) em diferentes superfícies. Este estudo visa corroborar ou complementar diferentes aspectos dos modelos atualmente em discussão para biofilmes bacterianos, além de, num caráter tecnológico, fornecer subsídios para um eventual controle da formação dos biofilmes de Xf. Para isso utilizamos uma abordagem diferenciada à comumente empregada em biologia - e mais próxima à ciência dos materiais - visando isolar e quantificar a relevância dos parâmetros que contribuem na formação de um biofilme em diferentes superfícies, tentando aproximá-las do xilema da planta. Nossos resultados mostram uma semelhança de desenvolvimento (forma, tamanho e quantidade) nos biofilmes de Xf cultivados em superfícies de vidro e Si, e um melhor desenvolvimento dos biofilmes em Si do que nas superfícies de etil celulose, EC, e acetato de celulose, AC. De um ponto de vista fenomenológico, os biofilmes apresentam diferentes estruturas, taxa de desenvolvimento e tendências na expressão gênica entre superfícies com e sem presença de celulose derivatizada. Na caracterização das superfícies utilizadas consideramos o efeito do meio de cultura em suas propriedades. Nas superfícies de vidro e Si, constatamos a formação de um filme condicionante devido à adsorção dos constituintes deste meio. O grau de hidrofobicidade das superfícies de vidro e Si diminui significativamente após contato com o meio de cultura enquanto as superfícies de celulose derivatizada apresentam pouca (EC) ou nenhuma alteração (AC); observamos também um aumento do potencial de superfície (PS) para Si e EC e, ainda, uma diminuição de PS em AC. Estas evidências sugerem uma correlação entre PS mais altos e grau de hidrofobicidade baixos com a presença de biofilmes de Xf em maior número e tamanho. Além disso, medidas de espectroscopia de força utilizando ponta funcionalizada com a proteína de adesão XadA1 evidenciam também um comportamento distinto na superfície de AC. Estes resultados apontam para a importância da interação eletrostática no processo inicial de adesão da bactérias às superfícies estudadas. Por fim, a presença de material extracelular ao redor dos biofilmes e células de Xf em superfícies de vidro e Si foi observada indicando a presença de uma matriz exopolimérica protetora. Espectroscopia de infravermelho mostra a presença de polissacarídeos ¿ constituinte da matriz polimérica ¿ desde o estágio inicial de formação do biofilme, indicando uma possível contribuição dessa matriz para o processo de adesão que precede o desenvolvimento do biofilme / Abstract: In this work, we report an investigation on relevant physicochemical processes of bacterial surface adhesion and biofilm development for the phytopathogen Xylella fastidiosa (Xf) on different surfaces. This study aims to corroborate or supplement different aspects of the bacterial biofilms models currently under discussion and, in a technological point of view, provides experimental input for an eventual control of Xf biofilm formation. For this purpose, we have used an approach not commonly found in biology ¿ and more similar to materials science ¿ in order to isolate and quantify the relevance of the parameters that contribute to the formation of a biofilm on different surfaces, as well as trying to make these surfaces closer to the plant xylem. Our results show a similar development (shape, size and quantity) for Xf biofilms grown on Si and glass surfaces, and an improved development of biofilms grown on Si than on ethyl cellulose, EC, and cellulose acetate, AC. Under a phenomenological point of view, biofilms present different structures, rate of development and trends in gene expression between surfaces with and without the presence of derivatized cellulose. In order to characterize the surfaces, we considered the effect of culture medium on their properties. In Si and glass surfaces, we observe the formation of a conditioning film due to adsorption of the constituents of the culture medium. The degree of hydrophobicity of glass and Si surfaces decreases significantly after contact with this medium. On the other hand, cellulose derivatized surfaces present lower (EC) or no (AC) modifications of this property. In addition, we observed an increase in the surface potential (SP) for Si and EC and also a SP decrease for AC. These evidences suggest a correlation between higher SP values and lower degree of hydrophobicity with the presence of biofilms of Xf in larger numbers and size. Furthermore, force spectroscopy measurements using a functionalized tip with the adhesion protein XadA1 also show a different behavior on the AC surface. These results reveal the importance of electrostatic interaction in the initial bacterial adhesion for the surfaces studied here. Finally, the presence of extracellular material around the Xf cells and biofilms on glass and Si surfaces was observed indicating the presence of a protective exopolymeric matrix. Infrared spectroscopy shows the presence of polysaccharides - a constituent of the polymeric matrix - from the very initial stages of biofilm formation, indicating a possible contribution of this matrix for the adhesion process which precedes biofilm development / Doutorado / Biofísica / Doutora em Ciências

A Escaldadura das Folhas da Ameixeira é o principal problema fitossanitário para a produção de ameixas no Brasil. A doença é causada pela bactéria Xylella fastidiosa, transmitida por cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae). Neste trabalho foi realizado o levantamento, análise faunística e a flutuação populacional de Cicadellinae em pomares de ameixeira localizados nos Estados do Rio Grande do Sul (RS) e São Paulo (SP). A captura das cigarrinhas foi realizada com cartões adesivos amarelos (8,5 x 11,5 cm) em dois pomares de ameixeira de cada estado, localizados nos municípios de Paranapanema (SP) e Bento Gonçalves e Farroupilha (RS). Em cada pomar, foram instalados 20 cartões, distribuídos em 10 pontos espaçados 35 x 35 m, com duas alturas de amostragem (0,5 e 1,7m acima do nível do solo). Os cartões adesivos foram trocados quinzenalmente no período de setembro de 2006 a setembro de 2008. Com base na análise faunística, as espécies de cigarrinhas mais abundantes, constantes, freqüentes e dominantes foram analisadas para se conhecer a sua flutuação populacional. Nos dois pomares do RS foram coletados 1103 indivíduos de Cicadellinae distribuídos em 27 espécies. Destas, Erythrogonia dorsalis (Signoret, 1853), Sibovia sagata (Signoret,1854), Spinagonalia rubrovittata Cavichioli, 2008, Macugonalia cavifrons Stål, 1862, Dilobopterus dispar (Germar, 1821), Bucephalogonia xanthophis (Berg, 1879) e Molomea lineiceps Young, 1968 foram predominantes. Em SP, foram coletados 293 cicadelíneos, distribuídos em 10 espécies, sendo Oncometopia facialis (Signoret, 1854) e Molomea consolida Schröder, 1959 predominantes. Verificou-se uma menor diversidade e abundância de espécies de Cicadellinae nos pomares localizados em SP quando comparados com os pomares do RS. A distribuição populacional das espécies predominantes nos pomares do RS concentrou-se nos meses de janeiro a março, e em SP, de outubro a janeiro, correspondendo aos períodos de colheita e póscolheita em ambas as regiões. Os menores índices de captura de cicadelíneos foram obtidos nos meses de entressafra em todos os pomares amostrados. / The plum leaf scald (PLF) is a major threat for plum production in Brazil. PLF is caused by the bacteria Xylella fastidiosa which is transmitted by sharpshooter leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae). In this investigation, we surveyed the Cicadellinae species associated with plum orchards located in Rio Grande do Sul (RS) and São Paulo (SP) states, Brazil, in order to identify potential vectors of X. fastidiosa in these regions. We also studied the seasonal fluctuation of predominant species determined by faunistic analysis. In each area, adult sharpshooters were sampled using yellow sticky cards (8,5 x 11,5 cm) in two orchards in Paranapanema (SP) and one in Bento Gonçalves and Farroupilha (RS), respectivelly. In all orchards, traps were spaced 35 m apart in 10 sample units. Vertical distribution was also evaluated by placing cards at 0.5 and 1.7 m above soil level in each sample unit. The survey was conducted during two years from September 2006 to September 2008, by removing sticky cards fortnightly. In plum orchards located in RS state, we collected a total of 1103 specimens of 27 sharpshooter species. Erythrogonia dorsalis (Signoret, 1853), Sibovia sagata (Signoret,1854), Spinagonalia rubrovittata Cavichioli, 2008, Macugonalia cavifrons Stål, 1862, Dilobopterus dispar (Germar, 1821), Bucephalogonia xanthophis (Berg, 1879) and Molomea lineiceps Young, 1968 were predominant in these orchards. We collected 293 individuals of 10 sharpshooter species in SP state, where Oncometopia facialis (Signoret, 1854) and Molomea consolida Schröder, 1959 were predominant. We found a lower diversity and abundance of Cicadellinae species in plum orchards located in SP when compared to RS state. The predominant species were more abundant from January to March in RS and, from October to January in SP, corresponding to plum harvest and pos-harvest periods in both regions. The lowest population of sharpshooters in plum orchards was observed during the plant dormancy period.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Agnes Thiane.pdf: 3586857 bytes, checksum: 523f528a78c1439ce6c21cb3ef1c1c69 (MD5) Previous issue date: 2013-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This dissertation presents the processing of seven image datasets and the determination and refinement of two protein structures of Sure (stationary phase survival protein E)from Xylella fastidiosa(XfSurE). The crystals were obtained by the research groupof Prof.Dr.RicardoApariciowith theprotein produced by the group of Profa. Dra.Anete Pereira de Souza, both from the State University of Campinas.Xylella fastidiosa strain 9a5c is aplague bacterium that causes a disease called Citrus Variegated Chlorosis (CVC) in orange grove; itwas the first bacterium to have its genome completely sequenced in Brazil. Studies show that this protein has several functions, amongst them, of a nucleotidase able to dephosphorylate various ribo anddeoxyribonucleic 5-monophosphates and ribonucleoside 3-monophosphatesto inorganic phosphate and nucleosides. Seven different sets of diffraction images were processed,four of them presented rings from ice diffraction. All structures have space group C2, but there are four different unit cells.Molecular replacement was performed with Phaser program and only two sets of images had their three-dimensional structures refined in an iterative process with the programs Coot and Phenix, which were subsequently largely validated. One of them shows a tetramer and the other a dimer in the asymmetric unit. During refinement, Mn+2, I- and PO43-ions were modeled. Comparisons between XfSurE and CbSurE (the correspondent protein fromCoxiella burnetti) indicate that XfSurE isin open conformation, unlike CbSurE. The protein shows the characteristic Rossmann fold-like, with the tetramerizationloop and C-terminal projection into the counter-monomer. / No presente trabalho realizaram-se o processamento de sete conjuntos de imagens e a determinação e refinamento de duas estruturas da proteína SurE (stationaryphasesurvivalprotein E) de Xylella fastidiosa (XfSurE). Os cristais foram obtidos pelo grupo de pesquisa do Prof. Dr. Ricardo Aparicio a partir da proteína produzida pelo grupo da Profa. Dra. Anete Pereira de Souza, ambos da Universidade Estadual de Campinas. XfSurElinhagem 9a5c é uma bactéria praga que causa uma enfermidade chamada Clorose Variegada dos Citros (CVC), grave em laranjeiras; foi à primeira bactéria que teve seu genoma completamente sequenciado no Brasil. Estudos revelam que essa proteína apresenta várias funções, dentre elas, de nucleotidase, capaz de desfosforilar vários ribo e desoxirribonucleicos 5-monofosfatados e ribonucleosídios 3-monofosfatos em fosfato inorgânico e nucloesídios.Dos sete conjuntos, quatro apresentaram anéis de difração por gelo no padrão de difração. Todas as estruturas apresentam grupo de espaço C2, mas há quatro celas unitárias diferentes A substituição molecular foi realizada com o programa Phaser e apenas dois conjuntos de imagens tiveram suas estruturas tridimensionais refinadas em um processo iterativo com os programas Coot e Phenix, queforam posteriormente amplamente validadas. Uma apresenta um tetrâmero e a outra um dímero na unidade assimétrica. Durante o refinamento, modelaram-seíons Mn2+, I- e PO43-. Comparações entre a XfSurE e CbSurE (a correspondente de Coxiella burnetti) indicamque XfSurE está em conformação aberta, ao contrário de CbSurE. A proteína apresenta o enovelamento característico deRossmann-fold-like, com as alças de tetramerização e com projeção de C-terminal no contra-monômero.

Resumo: Foi construído um microarranjo com as 2600 ORFs identificadas no projeto de sequenciamento da bactéria Xylella fastidiosa estirpe 9a5c, e utilizado para analisar diferenças na expressão gênica global da bactéria dentro de uma laranja doce suscetível (Pera) e uma tolerante (cultivar Navelina ISA 315). Foram achados mais genes diferencialmente expressos envolvidos na degradação, reguladores, componentes de membrana, adesinas tipo fímbrias, transportadores, elementos genéticos móveis e genes de patogenicidade na variedade sintomática. Assim, na cultivar Navelina ISA 315, foram diferencialmente expressos mais genes relacionados com a resposta ao estresse, seja detoxificação de espécies reativas do oxigênio ou proteínas chaperonas, assim como uma adesina do tipo hemaglutinina. Isso sugere diferenças na agregação celular e composição do biofilme assim como um maior estresse da bactéria na cultivar tolerante, provocado pelas próprias defesas da planta ou por microrganismos endofíticos que estão competindo com a X. fastidiosa. A técnica de microarranjos foi validada pela RT-qPCR, e apresentou-se como uma ferramenta poderosa na análise das mudanças na expressão gênica da bactéria X. fastidiosa em plantas de laranja doce in vivo, apresentando uma visão mais real da natureza do que os sistemas in vitro, que não a conseguem imitar completamente. Foram levantadas neste trabalho algumas hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade mas no entanto, mais pesquisas ainda são necessárias para lograr melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade e das interações patógeno-hospedeiro / Abstract: A DNA microarray was constructed containing 2600 ORFs identified by the Genome sequencing project of Xylella fastidiosa 9a5c strain, and used to check global gene expression differences in the bacteria within a susceptible and a tolerant sweet orange plant, the variety Pera and the cultivar Navelina ISA 315, respectively. More genes related to degradation, regulation, membrane components, fimbrial adhesins, transport, genetic mobile elements and patogenicity genes were differentially expressed in Pera variety. On the other hand, in the cultivar Navelina ISA 315, more genes related to stress response, detoxification of oxygen reactive species or other substances, "heat shock" proteins, as well as an adhesin of the hemagglutinin type, suggesting differences in cellular aggregation and biofilm composition, as well as a higher estress of the bacteria in tolerant cultivar, produced either by plant defenses or by endophitic microorganisms which are competing with X. fastidiosa. This "handmade" DNA microchip was validated by RT-qPCR, and has revealed as a powerful technique for the analysis of global changes in gene expression of X. fastidiosa in sweet orange plants in vivo, generating a more real image of what is happening in nature than in vitro systems which would never reproduce nature conditions exactly. Some hypotheses were raised in this study about patogenicity mechanisms, therefore, more research is still necessary to achieve a better understanding of pathogenicity mechanisms and host-pathogen interactions / Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Coorientador: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Banca: Marcos Antonio Machado / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Doutor