Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2004. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

Thesis (M.A.)--Oregon State University, 2008. / Printout. Includes bibliographical references (leaves 256-266). Also available on the World Wide Web.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-14Bitstream added on 2014-06-13T20:00:43Z : No. of bitstreams: 1 tumitan_arp_dr_arafcf.pdf: 486259 bytes, checksum: e8184ac2899ff2bbb1e4a6c4b9f77604 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo deste estudo foi verificar a influência da infecção por Y. enterocolitica na modulação de macrófagos M1 e M2 em camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6). Camundongos de ambas as linhagens foram infectados com Y. enterocolitica O:8 WA 2707. Células do lavado peritoneal e células esplênicas foram retiradas no 1º, 3º e 5º dia pós-infecção. Em cultura de macrófagos foi verificada a atividade das enzimas iNOS e arginase, medidas por seus produtos NO/citrulina e ornitina, respectivamente, e a produção de TGFb-1. Em cultura de linfócitos foram verificadas as respostas Th1 e Th2, avaliadas pela produção das citocinas IFN-g e IL-4. No 1º e 3º dia após infecção com Y. enterocolitica, os macrófagos de camundongos C57BL/6 aumentaram a produção de NO/citrulina e não produziram TGFb-1; enquanto que os macrófagos de BALB/c aumentaram a produção de ornitina e de TGFb-1. Os linfócitos de C57BL/6 aumentaram a produção de IFN-g e não produziram IL-4, enquanto que os BALB/c apresentaram um aumento mais discreto nos níveis de IFN-g e produziram IL-4 no 5º dia pós-infecção. / The objective of this study was to verify the modulation of Y. enterocolitica infection in M1 and M2 macrophage modulation in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice. Both strains of mice were infected with Y. enterocolitica O:8 WA 2707. Peritoneal macrophages and spleen cells were obtained on days 1, 3 and 5 post-infection. We verified the iNOS and the arginase activities in macrophage cultures, measured by their NO/citruline and ornithine products, respectively. The TGF b-1 production was also measured in supernatants of macrophage cultures. The Th1 and Th2 responses were evaluated in supernatants of lymphocyte cultures, by IFNg and IL-4 production. In the 1st and 3rd day after infection with Y. enterocolitica, macrophages from C57BL/6 mice increased their NO/citruline production and they didn't produce TGF b-1 ; while macrophages from BALB/c mice increased their ornithine and TGF b-1 production. The lymphocytes from C57BL/6 mice increased their IFNg production and didn't produce IL-4, while BALB/c showed a discreet increase in the IFNg levels and produced IL-4 in the 5th day post-infection.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000009.pdf: 10930205 bytes, checksum: 4adfda0171bec85ac94d9251a429a8eb (MD5) Previous issue date: 2007 / A exacerbação da atividade pestosa no início dos anos 1960 e o desconhecimento de aspectos da epidemiologia levaram o Governo Brasileiro, através do Departamento Nacional de Endemias Rurais (DNERu), a convidar Marcel Baltazard, do Instituto Pasteur de Paris, para elaborar um projeto de pesquisa visando a elucidação da conservação, focalização, epizootização e epidemização da peste no Brasil, com vistas à implementação de atividades eficazes de controle. O projeto, denominado Plano Piloto de Peste em Exu, foi executado na Chapada do Araripe-PE de 1966 a 1974. Apesar de toda a sorte de óbices, dificultando o desempenho da equipe, composta basicamente por dois técnicos brasileiros, auxiliares semi-analfabetos e consultores dos Institutos Pasteur de Teerã e de Paris, foi desenvolvido um amplo programa de pesquisas elucidando a maioria das questões propostas. A compilação das atividades jamais foi publicada, mas registros isolados permitem listar os principais resultados obtidos: a) a comprovação da infecção natural de roedores silvestres e de outros pequenos mamíferos e suas pulgas; b) o papel do Bolomys lasiurus (Zygodontomys lasiurus pixuna) na epizootização; c) a capacidade vetora da Polygenis bolhsi jordani e o seu papel na transmissão da infecção ao homem, com um desempenho superior aos de Xenopsylla cheopis e Pulex irritans; d) a participação da P. irritans na epidemização; e) a sensibilidade dos sigmodontinos e equimídeos e a relativa resistência do Ratus rattus; f) a resistência dos cavídeos, decorrente da sua asparaginasemia; g) a resistência da X. cheopis e P. irritans aos inseticidas organoclorados; h) o descarte das pestes endógena e crônica como mecanismos responsáveis pela conservação; i) a redução dos prazos para confirmação diagnóstica; j) o isolamento de 719 cepas, que deram origem à maior coleção brasileira de culturas de Yersinia pestis; k) a definição de um programa de controle baseado na vigilância contínua e sistemática, privilegiando a participação comunitária e contemplando a pesquisa da Y. pestis nos roedores e suas pulgas e pesquisa de anticorpos contra o antígeno F1 em animais-sentinela, o que ensejou a estruturação de uma rede nacional de laboratórios, bem como a intervenção imediata nas ocorrências, com diagnóstico precoce, pronto tratamento, quimioprofilaxia e despulização

Orientador: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Banca: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Banca: Dagmar Ruth Stach-Machado / Banca: Maria Teresinha Serrão Peraçoli / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar a influência da infecção por Y. enterocolitica na modulação de macrófagos M1 e M2 em camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6). Camundongos de ambas as linhagens foram infectados com Y. enterocolitica O:8 WA 2707. Células do lavado peritoneal e células esplênicas foram retiradas no 1º, 3º e 5º dia pós-infecção. Em cultura de macrófagos foi verificada a atividade das enzimas iNOS e arginase, medidas por seus produtos NO/citrulina e ornitina, respectivamente, e a produção de TGFb-1. Em cultura de linfócitos foram verificadas as respostas Th1 e Th2, avaliadas pela produção das citocinas IFN-g e IL-4. No 1º e 3º dia após infecção com Y. enterocolitica, os macrófagos de camundongos C57BL/6 aumentaram a produção de NO/citrulina e não produziram TGFb-1; enquanto que os macrófagos de BALB/c aumentaram a produção de ornitina e de TGFb-1. Os linfócitos de C57BL/6 aumentaram a produção de IFN-g e não produziram IL-4, enquanto que os BALB/c apresentaram um aumento mais discreto nos níveis de IFN-g e produziram IL-4 no 5º dia pós-infecção. / Abstract: The objective of this study was to verify the modulation of Y. enterocolitica infection in M1 and M2 macrophage modulation in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice. Both strains of mice were infected with Y. enterocolitica O:8 WA 2707. Peritoneal macrophages and spleen cells were obtained on days 1, 3 and 5 post-infection. We verified the iNOS and the arginase activities in macrophage cultures, measured by their NO/citruline and ornithine products, respectively. The TGF b-1 production was also measured in supernatants of macrophage cultures. The Th1 and Th2 responses were evaluated in supernatants of lymphocyte cultures, by IFNg and IL-4 production. In the 1st and 3rd day after infection with Y. enterocolitica, macrophages from C57BL/6 mice increased their NO/citruline production and they didn't produce TGF b-1 ; while macrophages from BALB/c mice increased their ornithine and TGF b-1 production. The lymphocytes from C57BL/6 mice increased their IFNg production and didn't produce IL-4, while BALB/c showed a discreet increase in the IFNg levels and produced IL-4 in the 5th day post-infection. / Doutor

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-21T22:00:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Érika de Cássia Vieira da Costa.pdf: 3098520 bytes, checksum: 9f66bcd3ae386544e4137fed8bbdcddd (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-24T17:20:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Érika de Cássia Vieira da Costa.pdf: 3098520 bytes, checksum: 9f66bcd3ae386544e4137fed8bbdcddd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T17:20:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Érika de Cássia Vieira da Costa.pdf: 3098520 bytes, checksum: 9f66bcd3ae386544e4137fed8bbdcddd (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / A peste, infecção por Yersinia pestis, é uma zoonose de grande importância epidemiológica mundial e no Brasil. A peste é uma doença principalmente de roedores silvestres e suas pulgas/vetores, mas pode afetar os seres humanos e outros mamíferos. Mais de 200 espécies de roedores são hospedeiros/reservatórios da infecção. No Brasil, a infecção permanece em focos naturais localizados em vários complexos ecológicos da região Nordeste, norte de Minas Gerais e na Serra dos Órgãos, no Rio de Janeiro. Os conhecimentos atuais sobre as populações de roedores e suas pulgas/ectoparasitas nas áreas focais de peste assim como a prevalência da infecção entre roedores e pulgas são insuficientes. O monitoramento das áreas focais da peste exige a disponibilidade de métodos de diagnóstico rápidos, simples e eficientes utilizando técnicas sensíveis e específicas aplicáveis às diversas amostras biológicas de diferentes origens (homem, roedores, carnívoros domésticos e selvagens). Nosso objetivo foi atualizar as informações sobre os roedores e outros pequenos mamíferos nos focos de peste do Nordeste do Brasil, desenvolver e avaliar uma técnica imunoenzimática (ELISAProteinA) para aplicação nas atividades de diagnóstico e vigilância da peste. No período de 2013-2015 foram realizadas nove expedições de uma semana cada, às áreas focais de peste historicamente mais importantes nos estados de Pernambuco, Ceará e Bahia, onde foram coletados 392 roedores e outros pequenos mamíferos (marsupiais). As análises bacteriológicas e moleculares realizadas nas amostras de tecidos dos animais foram negativas para a Y. pestis e apenas um animal se revelou positivo nas análises sorológicas. Apesar da baixa prevalência da infecção encontrada, a densidade e a diversidade de reservatórios/hospedeiros nas áreas focais evidencia a necessidade de incrementar os estudos nesses locais. Conjugados formados pela proteína A do Staphylococcus aureus (ProteinA) ligada a enzimas representam uma alternativa no desenvolvimento de testes sorológicos, já que essa proteína possui afinidade universal com imunoglobulinas de diversas espécies de mamíferos domésticos e selvagens. Visando otimizar a metodologia das atividades de vigilância e controle da peste no Brasil, ensaios foram realizados para avaliar o desempenho da técnica imunoenzimática ELISA proteína-A utilizando um conjugado composto pela proteína A ligada a peroxidase. Os resultados mostraram que pela sensibilidade e especificidade o teste permite descartar as amostras com reações inespecíficas ou falso positivas desde a triagem o que repercute em grande ganho de tempo e economia de material. / The plague, Yersinia pestis infection, is a zoonosis of major epidemiological importance worldwide. Plague is primarily a disease of wild rodents and their flea/vectors, but can affect humans and other mammals. More than 200 species of rodents are hosts/reservoirs of the infection. In Brazil, the infection remains in natural foci located in several ecological complexes of Northeast, north of Minas Gerais and in the Serra dos Órgãos, in Rio de Janeiro. Current knowledge on the rodent and flea/ectoparasite populations from plague focal areas, as well as, the prevalence of infection among rodents and fleas are wanting. The monitoring of the plague focal areas requires the availability of quick, simple and efficient diagnosis methods using sensitive and specific techniques suited to various biological samples of different origins (human, rodents, domestic and wild carnivores). Our aim was to update the information on rodents and other small mammals from plague foci in the Northeast of Brazil, to develop and evaluate an enzyme immunoassay (ELISA protein-A) for use in plague diagnostic and surveillance activities. In the period of 2013-2015 nine one week each expeditions were held to the historically most important plague areas in the states of Pernambuco, Ceará and Bahia, where 392 rodents and other small mammals (marsupials) were collected. Bacteriological and molecular analyzes of animal tissue samples were negative for Y. pestis and only one animal proved positive in serological tests. Despite this low infection prevalence, the density and diversity of reservoir/hosts in the focal areas highlights the need for strengthen research in these areas. Conjugates of Staphylococcus aureus protein A linked to enzymes represent an alternative in the development of serological tests, since this protein has universal affinity with immunoglobulins from various species of domestic and wild mammals. To optimize the methodology of plague monitoring and control activities in Brazil essays were conducted to evaluate the performance of an enzyme immunoassay (ELISA protein A) using a conjugate composed of protein A linked to peroxidase. By the sensitivity and specificity observed the test allows discarding non-specific or false positive samples since from the screening, which constitutes time and material savings.

Determina la patogenicidad de una cepa de Yersinia ruckeri proveniente de un brote en la localidad de Puno, para esto se registraron los signos clínicos, morbilidad, mortalidad, lesiones macroscópicas (internas y externas) y caracterización de las lesiones histopatológicas de truchas infectadas experimentalmente con este patógeno. Se utilizaron 100 alevinos de truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) de peso promedio de 7,5 g y longitud promedio de 8,6 cm distribuidos en 5 grupos experimentales de 20 peces cada uno (un grupo control y cuatro desafiados), mantenidos en acuarios individuales con capacidad de 70 l. Se inocularon vía intraperitoneal (IP), con 0,1 ml de cepa de Yersinia ruckeri a concentraciones sucesivas de 1x105 UFC/ml (T1), 1x106 UFC/ml (T2), 1x107 UFC/ml (T3), 1x108 UFC/ml (T4) y el grupo control fue inyectado con PBS. Posteriormente se observaron signos clínicos, lesiones macroscópicas (internas y externas) y mortalidad durante 20 días. Los peces con mortandad reciente y sobrevivientes del estudio fueron necropsiados según la técnica recomendada por Espinosa de los Monteros y Labarta (1988), previa sedación con eugenol y eutanasia con sección medular. Posteriormente se aisló la bacteria a partir de riñón y bazo en agar tripticasa de soya incubada a 24 ° C por 48 horas, evidenciando colonias características de Yersinia ruckeri confirmadas mediante tinción Gram, pruebas bioquímicas y PCR convencional. También se colectaron muestras de riñón anterior, bazo, hígado, branquias, músculo e intestino posterior para el estudio histopatológico. Los grupos desafiados presentaron signos y lesiones característicos de yersiniosis; registrándose melanosis (73.5 %) y letargia (60 %) en mayor frecuencia, además de otros. Los signos clínicos se evidenciaron al 3° día post-infección en el grupo T4, y al 6°, 8°, 11° día post-infección para los grupos T3,T2 y TI respectivamente. Las lesiones macroscópicas (internas y externas) más evidentes fueron hemorragia en la base de las aletas (78.75%), esplenomegalia (75%), hemorragia en intestino posterior (48,75%) y hemorragia en la cavidad oral (26,25%). Además, se registró mortalidad del 100% solo para el grupo T4 al 10° día, y 30%, 20%, 10% para los grupos T3, T2 y T1 respectivamente. Histopatológicamente, se evidencio mayor afección en bazo con presencia de melanomacrófagos, congestión e hiperplasia leucocitaria, riñón anterior con gotas hialinas en epitelio tubular, aumento de tejido linfoide, hígado con degeneración grasa, necrosis, separación de hepatocitos, intestino posterior con hiperplasia de células caliciformes, necrosis y epitelio disgregado. Se concluyó que la cepa de Y. ruckeri procedente de Puno, incluso en concentraciones bajas, tiene un nivel de patogenicidad elevada causando mortalidad y lesiones características de yersiniosis. / Tesis

Spreading drug resistances among Gram-negative pathogens and the paucity of new agents on the antibacterial drug market against these tenacious bacteria create a pressing need for the development of new antibiotics. The bacterial fatty acid biosynthesis pathway FAS-II, especially the enoyl-ACP reductase catalyzing the last step of the elongation cycle, is an established drug target against tuberculosis but has not been extensively exploited for drug design against other bacterial pathogens. In this thesis the enoyl-ACP reductases of the Gram-negative biothreat organisms Burkholderia pseudomallei and Yersinia pestis were targeted in a structure-based drug design approach. The structure of the most recently identified enoyl-ACP isoenzyme FabV was characterized by X-ray crystallography and could be determined in three different states. FabV from B. pseudomallei was obtained in the apo-form of the enzyme, whereas FabV from Y. pestis was characterized in a binary complex with the cofactor NADH as well as in a ternary complex with NADH and the triclosan-based 2-pyridone inhibitors PT172 and PT173. Analysis of the FabV structure revealed the typical fold of the short chain dehydrogenase/reductase superfamily with the NADH-binding Rossmann fold and a substrate-binding pocket with a conserved active site geometry compared to the related isoenzyme FabI. Additional structural elements of FabV are located around the active site. The monomeric form of the enzyme is thereby stabilized and the substrate-binding loop is kept in a closed, helical conformation. The ternary complexes of FabV exhibited a similar inhibitor-binding mode as observed for triclosan inhibition in FabI and point to a potential substrate-binding mechanism. B. pseudomallei possesses FabI as an additional enoyl-ACP reductase isoenzyme, which was structurally characterized in the apo form and in ternary complexes with NAD+ and the diphenyl ether inhibitors triclosan, PT02, PT12 or PT404 as well as the 4-pyridone inhibitor PT155. The structural data of the ternary enoyl-ACP reductases complexes of B. pseudomallei and Y. pestis hold the promise for the possibility to develop antibacterials targeting FabV or even both isoenzymes, FabI and FabV, based on the triclosan scaffold. / Die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen in Gram-negativen Pathogenen sowie der Mangel neuer Medikamente auf dem Arzneimittelmarkt gegen diese hartnäckigen Bakterien weist einen dringenden Bedarf an neuen Antibiotika auf. Die bakterielle Fettsäurebiosynthese (FAS-II), speziell die Enoyl-ACP-Reduktase, welche den finalen Schritt des Elongationszyklus katalysiert, ist ein etablierter Angriffspunkt in der Tuberkulosetherapie. Sie wurde jedoch bisher noch nicht für die gezielte Wirkstoffentwicklung gegen andere bakterielle Krankheitserreger genutzt. In dieser Dissertation waren die Enoyl-ACP Reduktasen aus Burkholderia pseudomallei und Yersinia pestis Gegenstand des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Struktur des zuletzt gefundenen Isoenzyms der Enoyl-ACP-Reduktase, FabV, wurde röntgenstrukturanalytisch charakterisiert und konnte in drei verschiedenen Zuständen bestimmt werden. Die Struktur des FabV Proteins aus B. pseudomallei wurde in der Apo-Form gelöst, während FabV aus Y. pestis in binären und ternären Komplexen mit NADH bzw. NADH und einem Triclosan-basierten 2-Pyridon-Inhibitor, PT172 bzw. PT173 charakterisiert wurde. FabV weist die typische Struktur eines Mitglieds der Short-Chain-Dehydrogenase/Reduktase Superfamilie mit einer NADH-bindenden Rossmann-Faltung und einer Substratbindetasche auf mit einer, im Vergleich zu dem verwandten Isoenzym FabI, konservierte Geometrie des aktiven Zentrums. Zusätzliche strukturelle Elemente sind um das aktive Zentrum gefaltet und stabilisieren damit das Enzym in seiner monomeren Form. Darüber hinaus halten sie den Substratbindeloop in einer geschlossenen helikalen Gestalt. Die ternären FabV Komplexe zeigen Übereinstimmungen mit dem bekannten Bindungsmechanismus des Inhibitors Triclosan in FabI und deuten auf einen möglichen Substratbindungsmechanismus hin. B. pseudomallei besitzt FabI als zusätzliches Isoenzym der Enoyl-ACP-Reduktasen. Dieses Isoenzym wurde in der Apo-Form und in ternären Komplexen mit NAD+ und den Diphenylether-Inhibitoren Triclosan, PT02, PT12 und PT404 sowie dem 4-Pyridon-Inhibitor PT155 strukturell charakterisiert. Die strukturellen Daten der ternären Enoyl-ACP-Reduktase Komplexe von B. pseudomallei und Y. pestis stellen die Möglichkeit in Aussicht Antibiotika zu entwickeln, welche FabV oder auch beide Isoenzyme, FabI und FabV, inhibieren.

There are three human pathogenic species of the genus Yersiniae: Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pseudotuberculosis. To cause disease, these strains inhibit several key innate defense mechanisms, including phagocytosis, the critical process for bacterial clearance. The ability of Yersinia to evade the immune defense is dependent on delivery of virulence effectors, Yersinia outer proteins (Yops), into the interacting cell by a mechanism involving the type III secretion machinery. We have shown that the virulence protein YopK plays an important role in the control of Yop effector translocation via a feedback mechanism involving another virulence protein, YopE. We also found that YopK participated in regulation of Yop effector translocation by modulating level and ratio of the pore-forming proteins YopB and YopD in the target cell membrane. Further, using a yeast two-hybrid screen with YopK as a bait, the eukaryotic protein RACK1 was identified as a target for this virulence protein. We found that RACK1 was engaged upon Y. pseudotuberculosis-mediated β1-integrin activation, where it was recruited to phagocytic cups. Downregulation of RACK1 by RNAi resulted in a reduced ability of Y. pseudotuberculosis to block phagocytosis, indicating that RACK1 is required for efficient Yersinia-mediated antiphagocytosis. Based on our data, we suggest a model where Yersinia, via YopK, targets RACK1 to ensure a directed delivery of the Yop effectors to the “right place” where they bind to and inactivate their targets, resulting in efficient inhibition of phagocytosis.   A yopK mutant strain over-delivers Yop effectors, but is still avirulent in mice, indicating that YopK is important for the fine-tuning of effector protein delivery during infection. To analyse this, we investigated the importance of YopK during in vivo infection. We found that a yopK mutant colonized Peyer’s patches and the mesenteric lymph node more rapidly compared to wild-type Y. pseudotuberculosis, but was unable to spread systemically to liver and spleen and cause full disease in mice. Further, we showed that a yopK mutant was able to colonize liver and spleen and cause full disease in mice lacking the main phagocytes, polymorphonuclear leukocytes (PMNs). We also showed that YopK was important for Yersinia-mediated silencing of the PMN response. To summarize, we suggest that YopK is important for Yersinia to evade the PMN defense and thereby spread systemically and cause disease. YopK is proposed to do this by allowing a controlled, directed Yop effector delivery that is just sufficient to inhibit host immune defense mechanisms. The controlled and precise delivery of virulence effectors avoids inappropriate triggering of PMNs and thereby an enhanced immune response favoring the host.