Salmonella enterica is a common foodborne, facultative intracellular enteropathogen. The ty-phoidal S. enterica serovars Paratyphi A (SPA) and Typhi (STY) are human-restricted, and cause severe systemic diseases, while many S. enterica serovars like Typhimurium (STM) have a broad host range and in human hosts usually lead to self-limiting gastroenteritis. There are key differences between typhoidal (TS) and non-typhoidal (NTS) Salmonella in pathogenesis, but research on TS is challenging due to host restriction. Since STM causes a typhoid-like disease in mice, it was widely used as model organism to mimic human TS infection. Although results gained by research on STM could provide major insights in Salmonella virulence in general, the specific virulence mechanisms of TS are far from being understood. Both TS and NTS are able to invade mammalian cells and to replicate within host cells, including epithelial cells and macrophages. After invasion or phagocytic uptake, Salmonella resides in a membrane-bound compartment, the Salmonella-containing vacuole (SCV). The subsequent in-tracellular lifestyle is dependent on the translocation of effector proteins via a type 3 secretion system (T3SS) which is encoded by genes on Salmonella pathogenicity island 2 (SPI2). During the intracellular lifestyle, vesicular compartments of host cells are manipulated by effector pro-teins of the SPI2-T3SS and Salmonella-induced filaments (SIF) are formed. It is currently un-known if observations regarding the molecular pathogenesis made for STM are applicable to TS serovars SPA and STY. In this work, the intracellular lifestyles of TS were investigated on single cell level. Analyses of intracellular activities of STY and SPA in various host cells showed that STY and SPA deploy SPI2-T3SS to actively manipulate their host cells, but with far lower frequency than STM. A role of SPI2-T3SS for proliferation of STY and SPA in epithelial cells was observed, but not for sur-vival or proliferation in phagocytic host cells. Reduced intracellular activities and pronounced SCV integrity of STY and SPA might contribute to the stealth strategy of STY and SPA, facilitat-ing systemic spread and persistence. Furthermore, by analyses of intracellular transcriptomic architecture during human epithelial cell infection of SPA and STM, different gene expression patterns in key virulence and metabolic pathways were identified. Elevated expression of SPI1 and flagella-chemotaxis genes by intracellular SPA results in cytosolic, flagella-mediated motility and increased invasiveness of SPA. Distinct gene expression patterns of carbon utilization path-ways, flagella-chemotaxis and SPI1 genes might contribute to the invasive and systemic disease developed following SPA infection in humans. Live cell imaging revealed that SPA invades host cells in a cooperative manner with multiple bacteria per invasion site, leading to error-prone macropinocytosis with increased membrane damage of the early SCV. After release into the cytosol, motile bacteria showed reduced autophagosomal capture. The results provide new insights into the virulence profile of STY and SPA by unravelling pre-viously unknown intracellular phenotypes and virulence traits. The established 3D and 2D intes-tinal organoid models offer new tools for analyses of human-restricted pathogens in a more in vivo relevant context.

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Eukaryotic cells are populated by membrane-enclosed organelles possessing discrete molecular and biochemical properties. Communication between organelles is established by shuttling vesicles that transport proteins and other molecules. Vesicles bud from a donor organelle, travel in the cytosol, and are delivered to a target organelle. All these steps are regulated to ensure that cargoes are transported in a specific and directed manner. The focus of this thesis is on the last part of the journey of a vesicle: the process of vesicle targeting. Two phases can be distinguished in this process: vesicle tethering, defined as the first interaction between the shuttling vesicle and the target membrane, and membrane fusion, which is the mixing of the lipid bilayers and of lumen content. Both phases are mediated by a minimal set of molecular components that include one member of the family of Rab GTPases, a vesicle tethering factor, a phosphoinositide lipid, and four SNAREs together with their regulatory proteins. While many studies have investigated the molecular details of how SNAREs mediate membrane fusion, the process of vesicle tethering is less well understood. The overall scope of my study is to describe the molecular details of vesicle tethering and how they can contribute to the general process of vesicle targeting. To address this question I developed an in vitro assay where I reconstitute in vitro the process of vesicle tethering. This bottom-up approach allows the molecular dissection of cellular processes outside of the complex context of the cell. With this assay I have characterized the vesicle tethering abilities of individual proteins involved in vesicle tethering on early endosomes. I show that a minimal vesicle tethering machinery can be formed by the concomitant interaction between one vesicle tethering factor and a phosphoinositide on the membrane of one vesicle, and by a vesicle tethering factor and a Rab GTPase on the membrane of another vesicle. These results provide an explanation for how vesicle tethering contributes to the specificity of vesicle targeting and to the directionality of cargo transport. In particular, specificity of vesicle targeting can arise from the specific interaction between a Rab and a vesicle tethering factor that is an effector of the Rab. I show that the asymmetric distribution of binding sites in the structure of a vesicle tethering factor can generate a heterotypic vesicle tethering reaction that can account for the directionality of cargo transport. The outcome of this thesis emphasizes the role that vesicle tethering factors have in the self-organized system of vesicle trafficking of eukaryotic cells. To identify novel Rab5 effectors implicated in vesicle tethering, I carried out a Rab5-chromatography on mouse liver. Amongst other novel Rab5 effectors, I identify a multi-subunit vesicle tethering complex that was not previously characterized in mammalian cells. The complex, named CORVET, is conserved from yeast to humans and plays a major role in cell physiology since its removal causes embryonic death in mice. I define its subunits composition, determine its subcellular localization, and elucidate its role in cargo transport. This finding reconciles a disharmony between findings in mammals and yeast regarding the molecular machinery responsible for the conversion from early to late endosomes. I also show that the newly identified subunit of the mammalian CORVET complex is the only Rab5 effector to localize to autophagosomes. I hypothesise that it is through the CORVET complex that Rab5 is involved in the formation and maturation of autophagosomes.

Zu den Eigenschaften eukaryotischer Zellen gehört ihre Kompartimentierung, welche durch die Abtrennung verschiedener Reaktionsräume durch Lipiddoppelschichten erreicht wird. Verschiedene Vesikel-Transportwege verbinden diese Kompartimente miteinander, einer dieser Wege in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist der sogenannte ALP-Weg. Dieser gehört zu den biosynthetischen Wegen, über die neue Proteine an ihren Bestimmungsort gebracht werden, in diesem Falle die Vakuole. Ausgehend vom Golgi-Apparat werden die Vesikel dieses Weges mit Hilfe des Adaptorproteinkomplexes-3 (AP-3) gebildet. Ein weiteres Protein, das eine spezifische Funktion in diesem Weg übernimmt, ist Vps41. Ein aktuelles Modell beschreibt seine Funktion in der Aufnahme der Vesikel an der Vakuole. Es konnte gezeigt werden, das Vps41 mit der sogenannten ear-Domäne von Apl5, einer Untereinheit des AP-3- Komplexes, interagiert. In dieser Arbeit konnte ich nachweisen, dass die Interaktionsstelle im Vps41 innerhalb einer konservierten PEST-Domäne liegt. Eine Deletion dieser Domäne beeinflußte die Funktion des Proteins im ALP-Weg jedoch nicht die in der homotypischen Vakuolenfusion und im CPY-Weg. Eine weitere Eingrenzung des deletierten Bereiches zeigte, dass die PEST-Domäne eine Sequenz enthält, die einem Di-Leucin- Sortierungssignal ähnlich ist. Dieses konnte ich als minimal notwendigen Bereich für die Wechselwirkung mit der Apl5-ear-Domäne bestimmen. Meine Daten zeigen, dass dieser Bereich des Proteins notwendig ist für das Docking der AP-3-Vesikel an der Vakuole. Weiterhin konnte ich eine kompetitive Bindung von Liposomen und Apl5 an die N-terminale Hälfte von Vps41 zeigen. Zusammengefasst und mit aktuellen Veröffentlichungen in Zusammhang gebracht, ergänzen meine Daten das Modell der Funktion von Vps41 in der Vesikelaufnahme an der Vakuole: Vps41 wird durch die Rab-GTPase Ypt7, als deren Effektorprotein, an späte Endosomen gebunden. An dieser stark gekrümmten Membran taucht ein kürzlich identifiziertes ALPS (amphipathic lipid packing sensor)-Motiv im Vps41 in die Membran des Organells ein und zieht so den N-terminalen Bereich mit der Bindestelle für die AP-3-Vesikel an die Oberfläche des Organells wodurch eine verfrühte Fusion der AP-3-Vesikel mit dem Endosom verhindert wird. Erst nach der Reifung zur Vakuole wird die PEST-Domäne für die Bindung an Apl5 verfügbar, da sich die Membrankrümmung ändert. Zusätzlich wird das ALPS-Motiv phosphoryliert, so dass dieses nicht mehr in die Membran eintauchen kann. Erst jetzt ist eine Interaktion zwischen Apl5 und Vps41 und damit eine Fusion der AP-3-Vesikel mit der Vakuole möglich. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Protonentranslokation durch den Fo-Teil der ATP-Synthase aus Escherichia coli. Durch Mutagenese wurden ATP-Synthasen hergestellt, in denen die beiden für den Protonentransport essentiellen Aminosäurereste D61 in der Untereinheit c und R210 in der Untereinheit a in der α-Helix in der sie liegen, entweder einzeln oder beide zusammen, um je eine Helixwindung nach oben oder unten verschoben wurden. Dies führt zu einer Verlängerung bzw. Verkürzung der Protonenzu- und austrittskanäle. Durch die Untersuchung der Funktionalität dieser ATPasen auf sowohl aktives und passives Protonenpumpen, als auch ATP-Synthese konnte ich zeigen, daß die Position der beiden essentiellen Aminosäurereste cD61 und aR210 zueinander nicht entscheidend ist. Werden beide Reste in die gleiche Richtung verschoben, so daß ihre Position zueinander gleich bleibt, kommt es unabhängig von der Richtung immer zu einem kompletten Funktionsverlust. Weiterhin läßt sich aus meinen Daten folgern, daß die Position des Restes aR210 in der Mitte der Membran wichtig ist. Beim Verschieben des Restes auf die Position 206 (a-up) geht die gesamte Funktion des Fo-Teiles verloren, während das Verschieben auf die Position 214 (a-down) zu einem passiven Ausströmen der Protonen durch den Fo-Teil führt. Die Position des Restes cD61 in der Membran ist flexibler. Obwohl die Repositionierung des Aspartats auf die Position 57 (c-up) jegliche Funktionalität des Fo-Teiles beeinträchtigt, ermöglicht ein Verschieben auf die Position 65 (c-down) aktives und passives Protonenpumpen, sowie die Synthese von ATP.

Die Anpassung des Zellwachstums eukaryotischer und prokaryotischer Zellen an sich ändernde intra- und extrazelluläre Signale wie Nährstoffverfügbarkeit, Wachstumsfaktoren und dem zellulären Energielevel bedarf eines effektiven Regulationssystems. In Säugern übernimmt der TSC-Komplex als negativer Regulator des TOR-Signalweges eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellwachstums. In S. pombe ist der TSC-Komplex konserviert. Zudem existieren Homologe der Untereinheiten der AMPK, welche in Säugern den TSC-Komplex positiv regulieren. In der vorliegenden Arbeit konnte die Existenz von zwei funktionell getrennten AMPK-Komplexen nachgewiesen werden: AMPK I, bestehend aus Ssp2, SPCC1919.03c und Cbs2 und AMPK II, bestehend aus Ppk9, SPCC1919.03c und Cbs2. Genetische Daten lassen eine Beteiligung von AMPK I an der Regulation der sexuellen Differenzierung, der Adaption an osmotischen Stress und der Verwertung nicht-fermentierbarer Kohlenstoffquellen vermuten. AMPK II scheint für die Adaption an Cadmiumstress wichtig zu sein.In der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin die Beteiligung der beiden AMPK alpha-Isoformen am TSC/Rhb1/TOR-Signalweg in S. pombe näher untersucht. Dabei deutete sich an, dass Ppk9 und der TSC-Komplex weder synergistische noch antagonistische Funktionen in der Zelle ausüben. Im Gegensatz dazu scheinen Ssp2 und die TSC-Proteine antagonistische Funktionen auszuüben. Einige Wachstumsdefekte der ssp2 -Deletionsmutanten können durch eine Hyperaktivierung des TSC/Rhb1/TOR-Signalweges supprimiert werden. Die Deletion von ssp2 führt zu einer Suppression des Wachstumsdefektes von Leucin-auxotrophen tsc-Mutanten. Diese Beobachtung erlaubt die Einordnung von Ssp2 in einem zum TSC/Rhb1/TOR-Weg parallelen Signalweg. Im Gegensatz zu Säugern scheinen in S. pombe TSC/Rhb1/TORC1 und Ssp2 einen gemeinsamen Effektor unabhängig voneinander zu regulieren, um verschiedene Wachstumsbedingungen miteinander zu integrieren und das Zellwachstum entsprechend anzupassen.

Hedgehog (Hh) proteins control animal development and tissue homeostasis. They activate gene expression by regulating processing, stability, and activation of Gli/Cubitus interruptus (Ci) transcription factors. Hh proteins are secreted and spread through tissue, despite becoming covalently linked to sterol during processing. Multiple mechanisms have been proposed to release Hh proteins in distinct forms; in Drosophila, lipoproteins facilitate long-range Hh mobilization but also contain lipids that repress the pathway. Here, we show that mammalian lipoproteins have conserved roles in Sonic Hedgehog (Shh) release and pathway repression. We demonstrate that lipoprotein-associated forms of Hh and Shh specifically block lipoprotein-mediated pathway inhibition. We also identify a second conserved release form that is not sterol-modified and can be released independently of lipoproteins (Hh-N*/Shh-N*). Lipoprotein-associated Hh/Shh and Hh-N*/Shh-N* have complementary and synergistic functions. In Drosophila wing imaginal discs, lipoprotein-associated Hh increases the amount of full-length Ci, but is insufficient for target gene activation. However, small amounts of non-sterol-modified Hh synergize with lipoprotein-associated Hh to fully activate the pathway and allow target gene expression. The existence of Hh secretion forms with distinct signaling activities suggests a novel mechanism for generating a diversity of Hh responses.

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