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Interação de Paracoccidiodes brasiliensis com células epiteliais. Caracterização de prováveis fatores de virulênciaAndreotti, Patrícia Ferrari [UNESP] 19 June 2006 (has links) (PDF)
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andreotti_pf_dr_arafcf.pdf: 3700497 bytes, checksum: 44fed3a7c2ab7db1a4fba80fbe6c2c51 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Os mecanismos de virulência de Paracoccidioides brasiliensis não estão completamente esclarecidos. Há consenso que subcultivos sucessivos deste fungo acarretam a perda de sua patogenicidade que pode ser revertida pelo reisolamento do agente após passagem em animal, recuperando assim alguns fatores de virulência. No presente estudo, tivemos como objetivo clonar e sequenciar uma banda polimórfica de 300pb do DNA genômico do isolado de P. brasiliensis com alta virulência (após reisolamento de animal), e assim caracterizar um provável fator de virulência deste fungo. Os resultados mostraram que as adesinas são capazes de induzir apoptose nas células estudadas por diferentes mecanismos. Assim podemos concluir que P. brasiliensis dispõe, como outros patógenos, de adesinas que participam, não só da adesão deste fungo às células do hospedeiro, mas também de outros importantes mecanismos que possa estar contribuindo para a sua patogênese. / The Paracoccidioides brasiliensis virulence mechanisms are not completely clarified. There is a consensus that successive subculturing of this fungus causes the loss of its pathogenicity, which can be reversed by passage in animals, with recovery of some factors of virulence. In the present study, we cloned and sequenced a polymorphic band of 300bp from P. brasiliensis genomic DNA of the one isolate with high virulence (after reisolation of animal). Thus, we can conclude that P. brasiliensis use, as many other pathogens, the adhesins as virulence factors to participate, not only of the adhesion of this fungus to the host cells, but in other important mechanisms to its pathogenesis.
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Interação de Paracoccidiodes brasiliensis com células epiteliais. Caracterização de prováveis fatores de virulência /Andreotti, Patrícia Ferrari. January 2006 (has links)
Orientador: Maria José Soares Mendes-Giannini / Banca: Christiane Pienna Soares / Banca: Maria Célia Jamur / Banca: Rosely Maria Zancopé Oliviera / Banca: Sônia Rozental / Resumo: Os mecanismos de virulência de Paracoccidioides brasiliensis não estão completamente esclarecidos. Há consenso que subcultivos sucessivos deste fungo acarretam a perda de sua patogenicidade que pode ser revertida pelo reisolamento do agente após passagem em animal, recuperando assim alguns fatores de virulência. No presente estudo, tivemos como objetivo clonar e sequenciar uma banda polimórfica de 300pb do DNA genômico do isolado de P. brasiliensis com alta virulência (após reisolamento de animal), e assim caracterizar um provável fator de virulência deste fungo. Os resultados mostraram que as adesinas são capazes de induzir apoptose nas células estudadas por diferentes mecanismos. Assim podemos concluir que P. brasiliensis dispõe, como outros patógenos, de adesinas que participam, não só da adesão deste fungo às células do hospedeiro, mas também de outros importantes mecanismos que possa estar contribuindo para a sua patogênese. / Abstract: The Paracoccidioides brasiliensis virulence mechanisms are not completely clarified. There is a consensus that successive subculturing of this fungus causes the loss of its pathogenicity, which can be reversed by passage in animals, with recovery of some factors of virulence. In the present study, we cloned and sequenced a polymorphic band of 300bp from P. brasiliensis genomic DNA of the one isolate with high virulence (after reisolation of animal). Thus, we can conclude that P. brasiliensis use, as many other pathogens, the adhesins as virulence factors to participate, not only of the adhesion of this fungus to the host cells, but in other important mechanisms to its pathogenesis. / Doutor
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Synaptic vesicles dynamics in σ1B adaptin -/- mouse modelCandiello, Ermes 08 June 2015 (has links)
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σ1-adaptin - the Small Subunit of the Clathrin Adaptor Complex AP-1 / σ1-Adaptin - die kleine Untereinheit des Clathrin-Adaptorkomplexes AP-1Riel, Constanze 25 June 2004 (has links)
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Identificação dos Genes, Expressão e Localização Celular do Complexo Adaptador 1 em Trypanosoma cruziNascimento Moreira, Claudia Maria do January 2013 (has links)
Submitted by Renata Fontoura (comunicaicc@fiocruz.br) on 2014-11-26T15:13:12Z
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Dissertação Claudia Maria do Nascimento Moreira - 01.pdf: 4994656 bytes, checksum: c9acb588dbfcaa318394a1f54b594a32 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T15:15:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2
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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / O complexo adaptador 1 (AP-1) atua na formação do revestimento de vesículas com
clatrina na rede trans-Golgi em células eucariontes. O conhecimento sobre o complexo AP-1
em tripanosomatídeos é escasso, mas já foi demonstrada sua importância na infectividade de
Leishmania mexicana em macrófagos, assim como na viabilidade de Trypanosoma brucei. O
Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado pertencente à família Trypanosomatidae,
sendo o agente etiológico da doença de Chagas, a qual afeta milhões de pessoas no mundo.
Neste contexto, esta dissertação teve como objetivo identificar os genes que codificam as
quatro subunidades do complexo AP-1 no genoma de T. cruzi, analisar sua expressão e
localização subcelular nesse parasita. Busca em banco de dados genômicos permitiu
identificar as sequências codificantes para todas as subunidades do complexo AP-1, sendo
obtidos os seguintes números de acesso gênicos: AP1-γ: XP_818958.1; AP1-β: XP_820334.1;
AP1-µ:XP_818899.1; AP1-σ: XP_804127.1. Foram produzidos anticorpos em camundongos
contra as proteínas recombinantes de todas as subunidades do complexo AP-1. Análise da
especificidade dos anticorpos foi realizada por western blot e a localização subcelular das
proteínas foi feita por imunofluorescência em microscopia de epifluorescência e microscopia
confocal a laser. Resultados negativos foram obtidos com o antisoro contra a subunidade
AP1-σ. Anticorpos obtidos contra as subunidades AP1-µ (policlonal) e AP1-β (monoclonal)
reconheceram polipetídeos de tamanho compatível ao peso molecular da proteína endógena
em extratos de formas epimastigotas, porém não reconheceram as proteínas por
imunofluorescência. O antisoro policlonal obtido contra a subunidade AP1-γ reconheceu em
extratos de diferentes formas evolutivas de T. cruzi (epimastigotas, tripomastigotas e
amastigotas) um polipeptídeo de peso molecular compatível com o predito em banco de dados
(~90 kDa). Imunolocalização demonstrou reação positiva pontual em região compatível com
a do complexo de Golgi deste protozoário: entre núcleo e cinetoplasto de formas
tripomastigotas e entre cinetoplasto e bolsa flagelar de epimastigotas e amastigotas.
Colocalização da AP1-γ com a GTPase Rab7 (marcador de complexo de Golgi em T. cruzi)
confirmou a localização desta subunidade no complexo de Golgi desse parasita. Nossos
resultados demonstram que as subunidades do complexo AP-1 são conservadas e expressas
em T. cruzi e que pelo menos a subunidade AP1-γ possui localização celular em complexo de
Golgi, similar ao que é descrito em outras células eucariontes. / The adaptor complex 1 (AP-1) acts in the formation of clathrin-coated vesicles at the transGolgi
network of eukaryotic cells. Knowledge about the AP-1 complex in trypanosomatids is
scarce, but it has been already demonstrated its importance in the infectivity of Leishmania
mexicana in macrophages, as well as the viability of Trypanosoma brucei. Trypanosoma cruzi
is a protozoan flagellate that belongs to the family Trypanosomatidae, being the etiologic
agent of Chagas disease, which affects millions of people worldwide. In this context, this
study aimed to identify the genes encoding the four subunits of the AP-1 complex in the
genome of T. cruzi and analyze their expression and subcellular localization in this parasite.
Search in genomic database identified gene sequences coding for all subunits of the AP-1
complex, the following accession numbers being obtained: AP1-γ: XP_818958.1; AP1-β:
XP_820334.1; AP1-µ: XP_818899 .1; AP1-σ: XP_804127.1. Antibodies were produced in
mice against recombinant proteins of all subunits of the AP-1 complex. Analysis of the
specificity of the antibodies was performed by western blot and subcellular localization of the
proteins by immunofluorescence was done by epifluorescence microscopy and confocal laser
microscopy. Negative results were obtained with the antiserum against subunit AP1-σ.
Antibodies raised against the AP1-µ (polyclonal) and AP1-β (monoclonal) subunits
recognized polypeptides with size compatible to the molecular weight of the endogenous
protein in extracts from epimastigotes, but no proteins could be localized by fluorescence
microscopy. The antiserum polyclonal obtained against the AP1-γ subunit recognized a
polypeptide in extracts of different evolutionary forms of T. cruzi (epimastigotes,
trypomastigotes and amastigotes) of molecular weight consistent with that predicted in
database (~90 kDa). Immunolocalization showed punctual positive reaction in the region
compatible with the Golgi complex of this protozoan: between nucleus and kinetoplast of
trypomastigotes and between kinetoplast and flagellar pocket of epimastigotes and
amastigotes. Colocalization of AP1-γ with the GTPase Rab7 (a marker of the Golgi complex
in T. cruzi) confirmed the location of this subunit in the Golgi apparatus of this parasite. Our
results demonstrate that the subunits of the AP-1 complex are conserved and expressed in T.
cruzi and that at least the AP1-γ subunit has cellular localization in the Golgi apparatus,
similar to that described in other eukaryotic cells.
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Signalbindung und Membraninteraktion von heterotetrameren Adaptorprotein-Komplexen / Signal binding and membrane interaction of heterotetrameric adaptor protein complexesSpäte, Kira Luise 05 July 2007 (has links)
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Etablierung und Analyse von 'knock-out' Mausmodellen der σ1 Untereinheiten des AP 1 Komplexes / Generation and analysis of murine knock-out models for σ1 adaptinsBaltes, Jennifer 22 January 2009 (has links)
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O envolvimento da proteína adaptadora 1 (AP-1) no mecanismo de regulação negativa do receptor CD4 por Nef de HIV-1 / The involvement of Adaptor Protein 1 (AP-1) on the Mechanism of CD4 Down-regulation by Nef from HIV-1Tavares, Lucas Alves 05 August 2016 (has links)
O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.
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O envolvimento da proteína adaptadora 1 (AP-1) no mecanismo de regulação negativa do receptor CD4 por Nef de HIV-1 / The involvement of Adaptor Protein 1 (AP-1) on the Mechanism of CD4 Down-regulation by Nef from HIV-1Lucas Alves Tavares 05 August 2016 (has links)
O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.
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