Die vorliegende publikationsbasierte Dissertationsschrift erörtert auf der Basis experimenteller Untersuchungen im Tiermodell die Auswirkungen von Stress auf die Zytokinproduktion und depressionsähnliches Verhalten. Außerdem wird getestet, ob die Blockade des Zytokins Tumornekrosefaktor-α (TNF‑α) eine Möglichkeit zur antidepressiven Intervention darstellt. Einleitend werden die Zusammenhänge von Stress, Zytokinen und Depression referiert sowie das hypothetische Modell erläutert, das den publizierten Untersuchungen zugrunde liegt. Es wird hypothetisiert, dass Stress zur Erhöhung der Produktion proinflammatorischer Zytokine führt und dass die vermehrte Zytokinproduktion depressive Verhaltensweisen hervorruft. Aus dieser Annahme leitet sich die Möglichkeit ab, durch Blockade der Wirkung des proinflammatorischen Zytokins TNF‑α antidepressive Effekte zu erzielen. In den beiden Arbeiten „The impact of social isolation on immunological parameters in rats“ (Archives of Toxicology) und „Stress-induced cytokine changes in rats“ (European Cytokine Network) wurde der Einfluss von sozialer Isolation, chronischem, milden und akutem Stress auf die Zytokinproduktion untersucht. In diesen Untersuchungen führten die verschiedenen Stressarten zu einer Modulation der Produktion proinflammatorischer Zytokine. Die dritte Publikation „Antidepressant effects of TNF‑α blockade in an animal model of depression“ (Journal of Psychiatric Research) berichtet von einem Experiment, in dem untersucht wurde, ob der TNF‑α-Inhibitor Etanercept antidepressive Effekte aufweist. Tatsächlich zeigte sich unter Etanercept ein Rückgang des depressionsähnlichen Verhaltens im forced swim test (FST) analog zu Verhaltensänderungen durch das in Tierversuchen als Standard-Antidepressivum geltende Imipramin. Die Autoren schlussfolgern, dass das Zytokinsystem durch Stress moduliert wird und so in die pathophysiologische Entwicklung einer Depression involviert sein könnte. Zytokininhibitoren könnten eine neue Klasse der Antidepressiva bei Therapieresistenz werden, wenn sich die Ergebnisse dieser Tierversuche in Studien an Probanden und an Patienten replizieren lassen.

Autoantikörper gegen Proteinase 3 (cANCA) stellen einen hochsensitiven und spezifischen Seromarker für das Krankheitsbild der Wegenersche Granulomatose dar. Während die Ätiologie dieser systemischen Vaskulitis unbekannt ist, weisen zahlreiche klinische und experimentelle Daten darauf hin, daß cANCA an der Entstehung und Chronifizierung dieser Erkrankung beteiligt sind. Insbesondere die Konsequenzen einer cANCA-Ligation an Proteinase 3 (PR3)-exprimierende Neutrophile wurden intensiv untersucht und man geht davon aus, daß Anti-PR3-Antikörper über die Aktivierung inflammatorischer, neutrophiler Zellfunktionen die Vaskulitis fördern. Über die Auswirkungen von cANCA auf Monozyten, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Immunantwort spielen und weitere Zielzellen dieser Antikörper darstellen, ist hingegen bisher wenig bekannt. Aktivierte Monozyten sind nicht nur ein wesentlicher Bestandteil der Granulome, sondern sind auch entscheidend an den vaskulären Entzündungsinfiltraten beteiligt. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Effekte von cANCA auf inflammatorische Zellfunktionen PR3-exprimierender Monozyten zu charakterisieren. Dabei war insbesondere ihr Einfluß auf die transendotheliale Migration und die Sekretion proinflammatorischer Mediatoren von Interesse. Die Isolation humaner Monozyten erfolgte mittels Gegenstromzentrifugation. Die monozytäre Transmigration wurde in mit humanen Endothelzellen bewachsenen Filtereinsätzen untersucht und mittels eines chemotaktischen Gradienten und/oder TNF-Stimulation der Endothelzellen gefördert. Die transendotheliale Migration von mit murinen, monoklonalen Anti-PR3-Antikörpern vorinkubierten Monozyten war, unabhängig vom Aktivierungszustand der Endothelzellen, deutlich vermindert. Dieser Effekt konnte sowohl durch vier von fünf cANCA-IgG-Fraktionen von Patienten mit aktiver WG als auch durch F(ab´)2-Fragmente der Autoantikörper reproduziert werden. Da bekannt ist, daß cANCA die proteolytische Aktivität von PR3 inhibieren und membrangebundenen Formen der leukozytären Serinproteasen PR3, humaner leukozytärer Elastase (HLE) und Cathepsin G (CathG) eine Rolle bei der Extravasion von Leukozyten zugesprochen wird, wurde daraufhin überprüft, ob PR3 für die monozytäre Transmigration von Bedeutung ist. Der physiologische Inhibitor dieser Serinproteasen, 1-Antitrypsin, und ein synthetischer Inhibitor von PR3 und HLE, CE-2072, verminderten die Anzahl migrierender Monozyten in gleichem Maße wie der vollständige Anti-PR3-Antikörper bzw. dessen F(ab´)2-Fragmente. Dahingegen hatte SLPI, ein Serpin, das lediglich CathG und HLE inhibiert, keinen Effekt auf die Anzahl migrierender Zellen. Dabei waren die Effekte von Anti-PR3-Antikörpern und 1-Antitrypsin nicht additiv, wodurch die Annahme, daß die Anti-PR3-mediierte Reduktion der monozytären Transmigration auf einer funktionellen Inhibition von PR3 beruht, untermauert wird. Die Reduktion der monozytären Transmigration ging nicht mit einer modifizierten endothelialen Adhäsion der Monozyten einher, wie unter dynamischen und statischen Bedingungen gezeigt werden konnte. Weder die rollende noch die feste Adhäsion der Monozyten wurde durch Anti-PR3-Antikörper oder Serinproteaseinhibitoren beeinträchtigt. Auch die durchflußzytometrisch quantifizierte Expression monozytärer ß1- und ß2-Integrine wurde durch die Autoantikörper nicht beeinflußt. Diese Ergebnisse zeigen erstmals, daß PR3 an der transendothelialen Migration, nicht aber der Adhäsion von Monozyten teilhat. Ein weiteres, wesentliches Ergebnis der vorliegenden Studie ist die, im Vergleich zu entsprechenden IgG-Kontrollen, massive Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren aus Monozyten in Gegenwart muriner Anti-PR3-Antikörper bzw. humaner cANCA, die mittels ELISA ermittelt wurde. Die Sekretion war zeitabhängig, wobei die Sekretion von TNF- und IL-1ß der von Thromboxan A2, IL-6 und IL-8 vorausging. Im Gegensatz zu den Auswirkungen von cANCA auf die monozytäre Transmigration, konnten diese Effekte nicht durch die alleinige Ligation des Antikörpers an das Antigen PR3 reproduziert werden, sondern waren von einer simultanen Ligation der Autoantikörper an PR3 und FcR auf der monozytären Oberfläche abhängig. Eine cANCA-mediierte Retention adhärenter Monozyten im Gefäßbett bei gleichzeitiger Aktivierung der monozytären Freisetzung inflammatorischer Zytokine und Prostanoide durch cANCA, könnte nicht nur die Entstehung der extra- und perivaskulären, granulomatösen Entzündung, sondern auch die Aufrechterhaltung der nekrotisierenden Vaskulitis fördern. Insgesamt weisen die Ergebnisse dieser Studie erstmals auf eine funktionelle Rolle von PR3 bei der transendothelialen Migration von Monozyten hin. Außerdem liefern sie weitere wesentliche Hinweise darauf, wie die Interaktion von cANCA mit Monozyten an der Pathogenese der Wegenerschen Granulomatose beteiligt sein könnten.

Die Bedeutung des Immunsystems in der Pathophysiologie von bipolaren Erkrankungen und Epilepsie ist ein aktueller Gegenstand der neuropsychoimmunologischen Forschung. Eine erhöhte Produktion von Zytokinen aufgrund von oxidativem Stress wurde dabei wiederholt als für die Pathophysiologie von Epilepsie und Bipolarer Störung relevant angesehen. In Hinblick auf Veränderungen der Zytokine Interleukin (IL)-1ß, IL-2, IL-4, IL-6 und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) wurden z. T. überlappende Ergebnisse bei beiden Erkrankungen beschrieben. Inwiefern diese Zytokine durch Stimmungsstabilisierer und Antiepileptika beeinflusst werden, wurde bisher jedoch nicht systematisch untersucht. In dieser Studie wurden systematisch in-vitro die Konzentrationen von IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-17, IL-22 und TNF-α im stimulierten Blut 14 gesunder Frauen mittels Vollblutverfahren (whole blood assay) nach Zugabe von Stimmungsstabilisierern bzw. Antiepileptika gemessen. Es wurden dabei die Stimmungsstabilisierer bzw. Antiepileptika Primidon, Carbamazepin, Levetiracetam, Lamotrigin, Valproat, Oxcarbazepin, Topiramat, Phenobarbital und Lithium untersucht. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der Mechanismus von erwünschter und unerwünschter anderer Wirkung von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika mit der Regulation von IL-1ß, IL-2, IL-22 und TNF-α in Zusammenhang stehen könnte. Getrennt nach den im Vollblutverfahren verwendeten Stimulanzien – Toxic-Shock-Syndrome-Toxin-1 (TSST-1) vs. monoklonaler Antikörper gegen das CD3-Oberflächenantigen (OKT3) in Kombination mit dem 5C3-Antikörper gegen CD40 (OKT3/CD40) – wurden die Ergebnisse in zwei unterschiedlichen Publikationen berichtet, die dieser Promotion zugrunde liegen.

Abstract OBJECTIVES: The objective of the present study is to compare the effect of systemic adjunctive use of azithromycin with amoxicillin/metronidazole to scaling and root planing (SRP) in a clinical study. MATERIALS AND METHODS: Data from 60 individuals with chronic periodontitis were evaluated after full-mouth SRP. Antibiotics were given from the first day of SRP, in the test group (n = 29), azithromycin for 3 days and, in the control group (n = 31), amoxicillin/metronidazole for7 days. Probing depth (PD), attachment level (AL), and bleeding on probing (BOP) were recorded at baseline and after 3 and 12 months. Gingival crevicular fluid was analyzed for matrix metalloprotease (MMP)-8 and interleukin (IL)-1beta levels. Subgingival plaque was taken for assessment of the major bacteria associated with periodontitis. RESULTS: In both groups, PD, AL, and BOP were significantly reduced (p < 0.001). A few significant differences between the groups were found; AL and BOP were significantly better in the test than in the control group at the end of the study (p = 0.020 and 0.009). Periodontopathogens were reduced most in the test group. CONCLUSIONS: A noninferiority of the treatment with azithromycin in comparison with amoxicillin/metronidazole can be stated. The administration of azithromycin could be an alternative to the use of amoxicillin/metronidazole adjunctive to SRP in patients with moderate or severe chronic periodontitis; however, a randomized placebo-controlled multicenter study is needed. CLINICAL RELEVANCE: Application of azithromycin as a single antibiotic for 3 days might be considered as an additional adjunctive antibiotic to SRP in selected patients.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 7 1.1 Klassifikation der Parodontitiden 7 1.2 Prävalenz der Parodontitis 8 1.3 Parodontales Erregerspektrum 9 2 Aufgabenstellung 12 3 Material und Methode 13 3.1 Erhobene Variablen 15 3.2 Therapie und Nachbehandlung 20 3.3 Biochemische und mikrobiologische Analyse 21 3.3.1 Probenentnahme 21 3.3.2 Analyse 22 3.4 Statistische Auswertung 23 4 Ergebnisse 25 5 Diskussion 33 6 Zusammenfassung 40 7 Literaturverzeichnis 44 8 Anhang 61 9 Publikation 65 10 Lebenslauf 66 11 Danksagung 67 12 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 68

The different strategies of tissue engineering for functional reconstruction of critical-size bone defects require a thorough knowledge of physiological mechanisms of bone repair. Bone healing is a complex process affected by various mediators. Several investigations have studied the gene expression 1 to 3 days after an acute or experimental fracture. Little is known about the humoral and cellular in vivo reaction in the early stages of bone healing. In contrast to other methods of molecule sampling and detection, which usually lead to the inhibition of the biological activity following complex sample preparation and quantification, microdialysis is a real-time monitoring technique which can be applied in living tissues providing a strong link between analytical methodology and biochemistry. In this study, the optimal conditions for microdialysis in a critical size rat long bone defect model for both in vivo and in vitro analyses were developed. Mediators and components of the extracellular matrix occurring in the first 24 to 48 hours of bone healing locally and systemically were monitored via microdialysis and blood sampling, respectively. Furthermore, novel proteins and their modulation were explored during this time frame. In vitro microdialysis was used to optimize the condition for protein recovery. Addition of bovine serum albumin (BSA) resulted in an enhanced recovery of interleukin (IL)-6. The maximal relative recovery (RR) was from 15.0% without BSA and 23.6% with BSA, while the maximal RR of transforming growth factor (TGF)-β1 was 11.2% with BSA and the concentration of TGF-β1 was below the detection limit of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) without BSA. Using in vivo microdialysis, total protein concentrations varied between 0.20±0.12 mg/mL and 0.44±0.18 mg/mL. Among the mediators produced in the fracture hematoma within 24 h after the injury, IL-6 was secreted with the highest concentration of 309.1 pg/mL between 12 and 15 h after creation of the critical size bone defect. Meanwhile, the detectable concentrations of TGF-β1 in microdialysates ranged from 3.6 to 44.0 pg/mL and in blood plasma TGF-β1 was constantly producted ranging from 656.3 to 8398.2 pg/mL for 24 h after bone defct. Moreover, another constant producted growth factor in blood plasma was PDGF-BB and the concentration ranged from 222.1 to 589.4 pg/mL for 8 h after bone defect. Using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS), 36 proteins were identified in the microdialysates over 8 h, and 884 proteins were identified on probes which were implanted into the bone defect over 24 h. Among the proteins identified in the hematoma, only a minority originated from the extracellular space. Protein analysis indicated five pathways associated with bone healing that were overrepresented after creating soft tissue and bone defects, of which FGF signaling was specific for bone defects. Furthermore, C-X-C motif ligands CXCL-1, CXCL-2, CXCL-3, CXCL-4, CXCL-5, CXCL-7, rodent bone protein (RoBo-1), insulin-like growth factor (IGF)-I, and chitinase-3-like protein 1 were detected in the fracture hematoma. These proteins are potentially associated to early bone healing. As seen by histological analysis, polymorphonuclear leukocytes (PMNs) and lymphocytes penetrated into the fracture hematoma immediately after surgery and peaked at 24 h. This study for the first time presents data from both the local and systemic acute response to bone and soft tissue injury in a small animal model. The results of mcrodialysis sampling may serve as a baseline for future investigations on different models and time frames. Several proteins and pathways have been identifeid as potentially important for early bone regeneration warranting in depth analysis in further studies.:I. Table of content II. List of abbreviations 1 Summary 2 Introduction 2.1 The process of bone healing 2.1.1 Stages of fracture healing 2.1.2 Early stage of inflammation 2.2 Clinical challenges 2.3 Microdialysis 2.3.1 The principle of Microdialysis 2.3.2 Parameters influencing the recovery 2.4 Aim of this study 3 Materials 3.1 Materials, devices and animals 3.2 Chemicals 3.3 Buffers and solutions 4 Methods 4.1 Background 4.2 In vitro microdialysis 4.2.1 Preparation of the protein solution 4.2.2 Microdialysis sampling procedure 4.3 In vivo microdialysis 4.3.1 Surgical procedure 4.3.2 Sample collection 4.4 Plasma samples 4.5 Determination of the fluid recovery 4.6 Determination of the relative recovery 4.7 Total protein measurement 4.8 Cytokine and growth factor analysis 4.8.1 IL-1β, IL-6, TNF-α and PDGF-BB ELISA 4.8.2 VEGF ELISA 4.8.3 TGF-β1 ELISA 4.8.4 BMP-2 ELISA 4.8.5 Proteome profilerTM array 4.9 Proteomic analysis 4.10 Histological analysis 4.11 Statistical analysis 5 Results 5.1 Protein selection 5.2 Determination of fluid recovery in vitro and in vivo 5.3 Determination of relative recovery (RR) in vitro 5.4 Determination of total protein concentration in vivo 5.5 Determination of cytokine and growth factor concentration in the microdialysate in vivo 5.5.1 IL-6 concentration 5.5.2 TGF-β1 concentration 5.5.3 IL-1β concentration 5.5.4 TNF-α concentration 5.5.5 PDGF-BB, BMP-2 and VEGF concentration 5.6 Determination of further cytokines and chemokines in the microdialysate in vivo 5.7 Protein determination using HPLC-MS/MS analysis 5.7.1 Proteins in the microdialysate 5.7.2 Proteins on the surface of the probe 5.8 Protein annotation 5.9 Determination of cytokines and growth factors in the blood plasma 5.9.1 Determination of IL-6 in the blood plasma 5.9.2 Determination of TGF-β1 in the blood plasma 5.9.3 Determination of PDGF-BB in the blood plasma 5.10 Histological analysis of the hematoma 6 Discussion 6.1 Fluid recovery 6.2 Influence of the crystalloid perfusate on relative recovery 6.3 Relative recovery of cytokines and growth factors in vitro 6.4 In vivo microdialysis 6.4.1 Total protein concentration 6.4.2 Annotation of proteins in hematoma identified by HPLC-MS/MS 6.4.3 Identification of cytokines and bone related proteins 6.5 The humoral inflammatory response 6.6 Cellular response 7 Conclusions 8 References 9 Appendix 9.1 Figure index 9.2 Table index III. Eidesstattliche Erklärung IV. Selbständigkeitserklärung V. Acknowledgements / Zur Entwicklung neuer Strategien der Geweberegenerierung in kritischen Knochendefekten, die sich durch Selbstheilungsprozesse nicht schließen, ist das Verständnis der beteiligten physiologischen Prozesse essentiell. Der Wiederaufbau von Gewebe, wie etwa während Knochenheilungsprozesse ist komplex reguliert und erfordert das koordinierte Zusammenspiel einer Vielzahl von Zellen und Mediatoren. Obwohl bereits in zahlreichen Studien die Veränderungen in der Genexpression in den ersten 3 Tagen nach einer akuten oder experimentell induzierten Fraktur untersucht wurden, ist noch immer wenig über die zellulären und humoralen Vorgänge in den frühen Phasen der Knochenheilung in vivo bekannt. Gebräuchliche Analysemethoden erfordern komplexe Verfahren zur Probenentnahme und Nachweisreaktionen währenddessen die biologische Aktivität der untersuchten Mediatoren häufig graduell verloren geht. Die Mikrodialyse hingegen kann in Echtzeit am lebenden Objekt und am Ort der Verletzung durchgeführt werden und bildet somit eine erfolgsversprechende Plattform um die Probengewinnung noch enger mit der anschließenden biochemischen Nachweistechnik zu verbinden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die optimalen Konditionen zur Mikrodialyse erstmals an einem kritischen Defektmodell eines Ratten-Röhrenknochens zur in vivo und in vitro Applikation ermittelt. Dazu wurde das Vorkommen verschiedener Komponenten der extrazellulären Matrix und ausgewählter Mediatoren während der ersten 24 bis 48 Stunden der Knochenheilung überwacht. Neben der durch Mikrodialyse gewonnenen Proben wurden auch Blutproben verarbeitet um sowohl die lokale, als auch systemische Konzentration der untersuchten Proteine zu erfassen. Durch eine Proteomanalyse konnten zudem bislang in diesem Prozess unbekannte Moleküle identifiziert und verfolgt werden. Zur Optimierung der Mikrodialyse wurden zunächst die Bedingungen hinsichtlich der Proteinrückgewinnung verbessert. Durch den Zusatz von Rinderserumalbumin (BSA) konnte die Rückgewinnung von Interleukin (IL)-6 erhöht werden. Die maximale relative Rückgewinnung (RR) konnte von 15.0% ohne BSA auf 23.6% mit BSA gesteigert werden. Noch dramatischer war dieser Effekt für den transforming growth factor (TGF)-β1 von dessen eingesetzter Menge in vitro 11.2% detektiert werden konnte, während in der BSA-freien Dialyselösung kein TGF-β1 nachgewiesen wurde. Die RR blieb stets unter der Detektionsgrenze des verwendeten enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In vivo-Dialysate enthielten totale Proteinkonzentrationen zwischen 0,20±0,12 mg/mL und 0,44±0,18 mg/mL. Von den innerhalb von 24 h nach Verletzung im Frakturhämatom produzierten Mediatoren wurde IL-6 am stärksten exprimiert. Die höchsten Konzentrationen (309,1pg/mL) konnten hierfür nach 12 bis 15 Stunden nach Einführung des Defekts gemessen werden. Die Konzentrationslevel von TGF-β1 hingegegen betrug nur 3,6 bis 44,0 pg/mL.Mittels high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS), konnten 36 Proteine in den über 8 Stunden gewonnenen Mikrodialysaten, und 884 Proteine von Explantaten, die 24 h im Knochendefekt integriert waren, identifiziert werden. Von den im Frakturhämatom identifizierten Proteinen war nur eine Minderheit extrazellulären Ursprungs. Durch die Proteomanalyse konnten fünf Signalwegskaskaden identifiziert werden. Von diesen trat „FGF (fibroblast growth factor) signaling“ ausschließlich in Knochendefekten, nicht jedoch in den zur Kontrolle mitgeführten reinen Weichgewebedefekten auf. Im Frakturhämatom konnten die, C-X-C motif-Liganden CXCL-1, CXCL-2,CXCL-3, CXCL-4, CXCL-5, CXCL-7, rodent bone protein (RoBo-1), insulin-like growth factor (IGF)-I, und das chitinase-3-like protein 1 nachgewiesen werden. Die identifizierten Proteine könnten von Bedeutung für die Steuerung früher Knochenheilungsprozesse sein. Histologische Untersuchungen zeigten, dass polymorphkernige Leukozyten (PMNs) und Lymphozyten sofort nach der Operation in das Frakturhämatom einwandern und ihre Anzahl nach etwa 24 h ihr Maximum erreicht. Diese Studie präsentiert erstmals Daten der lokal und systemisch ablaufenden zellulären und humoralen Vorgänge als Antwort auf einen Weichgewebs-bzw. Knochendefekt in einem Nagetier-Kleintiermodell. Die Mikrodialyse-Resultate stellen eine vielversprechende Grundlage für zukünftige Untersuchungen in anderen Modellen dar. Außerdem bilden die hier identifizierten Proteine und Signalwege eine Gruppe potenter Kandidaten für weiterführende Untersuchungen zur Knochenregeration.:I. Table of content II. List of abbreviations 1 Summary 2 Introduction 2.1 The process of bone healing 2.1.1 Stages of fracture healing 2.1.2 Early stage of inflammation 2.2 Clinical challenges 2.3 Microdialysis 2.3.1 The principle of Microdialysis 2.3.2 Parameters influencing the recovery 2.4 Aim of this study 3 Materials 3.1 Materials, devices and animals 3.2 Chemicals 3.3 Buffers and solutions 4 Methods 4.1 Background 4.2 In vitro microdialysis 4.2.1 Preparation of the protein solution 4.2.2 Microdialysis sampling procedure 4.3 In vivo microdialysis 4.3.1 Surgical procedure 4.3.2 Sample collection 4.4 Plasma samples 4.5 Determination of the fluid recovery 4.6 Determination of the relative recovery 4.7 Total protein measurement 4.8 Cytokine and growth factor analysis 4.8.1 IL-1β, IL-6, TNF-α and PDGF-BB ELISA 4.8.2 VEGF ELISA 4.8.3 TGF-β1 ELISA 4.8.4 BMP-2 ELISA 4.8.5 Proteome profilerTM array 4.9 Proteomic analysis 4.10 Histological analysis 4.11 Statistical analysis 5 Results 5.1 Protein selection 5.2 Determination of fluid recovery in vitro and in vivo 5.3 Determination of relative recovery (RR) in vitro 5.4 Determination of total protein concentration in vivo 5.5 Determination of cytokine and growth factor concentration in the microdialysate in vivo 5.5.1 IL-6 concentration 5.5.2 TGF-β1 concentration 5.5.3 IL-1β concentration 5.5.4 TNF-α concentration 5.5.5 PDGF-BB, BMP-2 and VEGF concentration 5.6 Determination of further cytokines and chemokines in the microdialysate in vivo 5.7 Protein determination using HPLC-MS/MS analysis 5.7.1 Proteins in the microdialysate 5.7.2 Proteins on the surface of the probe 5.8 Protein annotation 5.9 Determination of cytokines and growth factors in the blood plasma 5.9.1 Determination of IL-6 in the blood plasma 5.9.2 Determination of TGF-β1 in the blood plasma 5.9.3 Determination of PDGF-BB in the blood plasma 5.10 Histological analysis of the hematoma 6 Discussion 6.1 Fluid recovery 6.2 Influence of the crystalloid perfusate on relative recovery 6.3 Relative recovery of cytokines and growth factors in vitro 6.4 In vivo microdialysis 6.4.1 Total protein concentration 6.4.2 Annotation of proteins in hematoma identified by HPLC-MS/MS 6.4.3 Identification of cytokines and bone related proteins 6.5 The humoral inflammatory response 6.6 Cellular response 7 Conclusions 8 References 9 Appendix 9.1 Figure index 9.2 Table index III. Eidesstattliche Erklärung IV. Selbständigkeitserklärung V. Acknowledgements

T-Helfer(Th)-Lymphozyten spielen aufgrund ihrer Expression von Zytokinen eine zentrale Rolle in der Regulation von Immunantworten. Durch die Zytokine fördern die Th-Zellen die Rekrutierung und Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems, den Immunglobulin-Klassenwechsel von B-Zellen und ihre Differenzierung zu antikörper-sezernierenden Plasmazellen. Welche Zytokine eine aktivierte Th-Zelle exprimiert hängt von instruktiven Signalen ab, die sie in der Regel von antigen-präsentierenden Signalen bekommt. Mit den instruktiven Signalen wird ein ganzes Differenzierungsprogramm in den Th-Zellen initiiert, welches am Ende zu einer epigenetischen Prägung des Effektorprogramms führt, sodass die Th-Zelle auch bei nachfolgenden Aktivierungen die gleichen Funktionen ausführt. In dieser Arbeit wurde untersucht wie diese Differenzierungsprogramme zur Pathogenese von chronischen Entzündungen beitragen und wie eine chronische Entzündung wiederum die Differenzierung der Th-Zellen beeinflusst. Des Weiteren haben wir molekulare Adaptationen identifiziert, die selektiv in chronisch aktivierten entzündungsfördernden Th Typ 1 (Th1)-Zellen hochgeregelt werden. Diese Adaptationen, wie die Expression von Twist1 und Hopx, fördern das Überleben der Th1-Zellen am Ort der Entzündung und könnten zur Perpetuation der Entzündung entscheidend beitragen. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass Th-Zellen durch ihre pro-inflammatorische Prägung zwar gut gerüstet sind uns gegen Pathogene zu schützen, im Falle einer Autoreaktivität aber auch Immunpathologie und chronische Entzündungen auslösen können. Allerdings weisen unsere Arbeiten auch daraufhin, dass selektive Anpassungen der Th-Zellen an eine chronische Entzündung auch gleichzeitig Ansatzpunkte für ein therapeutisches Eingreifen bei chronisch-entzündlichen Krankheiten darstellen. / T helper (Th) lymhocytes play a central role in the regulation of immune responses. Through the expression of cytokines, Th cells orchestrate the recruitment and activation of cells of the innate immune system, and induce antibody class switch recombination in B lymphocytes and their differentiation into antibody-secreting plasma cells. Which cytokines an activated Th cell expresses is dependent on instructive signals, the Th cells receives from antigen-presenting cells. Such instructive signals initiate a differentiation program, which in the end leads to the epigenetic imprinting of the effector program, ensuring that the Th cell execute the same functions in subsequent activations. In this thesis, we investigated how such differentiation programs contribute to the pathogenesis of chronic inflammation and how chronic inflammation, in turn, affects the differentiation of the Th cells. Furthermore, we have identified molecular adaptations, which are selectively upregulated in chronically activated pro-inflammatory Th type 1 (Th1) cells. Such adaptations, like the upregulation of Twist1 and Hopx, promote the survival of Th1 cells in the inflamed tissue and could thereby contribute to the perpetuation of the inflammation. Taken together, our data show that Th cells with a pro-inflammatory imprint are well equipped to protect us against pathogens, in case of autoimmunity, however, cause immune pathology and chronic inflammation. At the same time, our work also shows that the selective adaptations of Th cells to chronic inflammation could also be promising targets for novel therapies for the treatment of chronic inflammatory diseases.

Diese Arbeit beschreibt Ergebnisse einer in-vitro Untersuchung der Antipsychotika Chlorpromazin, Haloperidol, Clozapin, N-Desmethylclozapin und Quetiapin bezüglich ihrer Wirkung auf die Zytokinproduktion. Dafür wurde Vollblut von gesunden Probandinnen invitro mit dem Immunmodulator Toxic-Shock-Syndrome-Toxin-1 (TSST-1) stimuliert. Dabei wurden die Konzentrationen der Zytokine Interleukin (IL)-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-17 und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) im unstimulierten Blut und im stimulierten Blut, jeweils mit und ohne Zusatz der Antipsychotika gemessen. Es zeigte sich, dass TSST-1 eine signifikante Stimulation der Produktion aller getesteten Zytokine bewirkte und dass es über diese Stimulation mit TSST-1 hinaus zu einer Erhöhung von IL-17 unter allen getesteten Antipsychotika kam. Aufgrund dieser Ergebnisse ist es denkbar, dass Antipsychotika, in Ergänzung zu ihrer Wirkung an Dopaminrezeptoren, auch über diese immunologische Eigenschaft Wirkungen und Nebenwirkungen entfalten können. Weiterhin könnte die IL-17-Produktion ein Biomarker in der Behandlung mit Antipsychotika sein, der wiederum zur individuellen Vorhersage von Wirkungen und Nebenwirkungen beitragen könnte.

! BACKGROUND: Exposure to Environmental Tobacco Smoke (ETS) is elevating blood levels of inflammatory mediators and chemoattractants which seem to play an important role in the development of several diseases (e.g. Chronic Obstructive Pulmonary Disease). First evidences showed that men and women might differ in their proneness for these diseases. The aim of this study was to investigate whether there are effects of ETS during pregnancy on inflammatory cytokines in cord blood and in mother’s blood and if there are any differences between male and female newborns. METHODS: Within the LiNA (Lifestyle and environmental factors and their influence on Newborn Allergy Risk) study, whole blood samples of 460 mother-child pairs were analyzed for the concentrations of IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-4, IL-5, INF-gamma, TNF-alpha and MCP-1 using cytrometic bead asseys. The association between ETS exposure and cytokines was calculated using the Mann-Whitney-U-test and adjusted with a multiple regression model for parental atopy, parental education status and cat ownership. The exposure assessment is based on questionnaire data on smoking behaviour of the parents and measurement of indoor benzene concentration. RESULTS: Female newborn, being exposed in utero to 10 cigarettes a day or more, had significantly higher blood concentrations of IL-8, IL-6 and MCP-1 whereas there have been no elevations in male newborn being exposed to the same amount of cigarettes. Furthermore a significantly decreased amount of INF-gamma was found in cord blood of male newborns but not in female newborns. General increasing levels of TNF-alpha in cord blood where found for daily smoke exposure without relating it to the exact number of cigarettes. CONCLUSION: The data of this study refer to gender-specific differences in the susceptibility to ETS exposure. The induction of inflammatory signals in cord blood in response to cigarette smoke exposure is stronger in female than in male newborn. / Die vorliegende Arbeit ist Teil einer umweltepidemiologischen Kohortenstudie (LiNA), in der der Einfluss von Umwelt- und Lebensbedingungen auf die Entwicklung von Immunsystem und Allergien bei Neugeborenen unter Einbezug der vorgeburtlichen Zeit untersucht wird. In welchem Maße sich eine Rauchbelastung während der Schwangerschaft auf die Zytokinmuster der Neugeborenen im Nabelschnurblut auswirkt und inwiefern dies mit dem Zytokinmuster der Mutter korreliert, sollte das Ziel dieser Dissertation sein. Dafür wurden Daten von insgesamt 629 Mutter-Kind-Paaren erhoben, Zytokin- und Chemokinbestimmungen, sowie die des Gesamt-IgE aus den Blutproben der 34. SSW und denen der Nabelschnur vorgenommen. Interessanterweise konnten geschlechterspezifische Unterschiede im Zytokinspektrum der Neugeborenen gefunden werden. Bei den weiblichen Neugeborenen zeigte sich eine deutliche Erhöhung proinflammatorischer Marker, wenn deren Mütter dem Rauch von mehr als 10 Zigaretten pro Tag ausgesetzt waren. Dieser Anstieg war weder im Blut der männlichen Neugeborenen noch im Blut der Schwangeren in der 34. SSW zu beobachten. Zusätzlich konnte beobachtet werden, dass auch einzig die männlichen Neugeborenen stark negativ mit ihrer IFN-gamma-Produktion auf die passive Rauchbelastung reagieren. Die mit dieser Arbeit ermittelten Daten, dass das Immunsystem beim Neugeborenen geschlechterspezifisch unterschiedlich auf Tabakrauch zu reagieren scheint, sind erstmals in der Literatur zu finden. Die Erforschung des Immunsystems und dessen Beteiligung an zahlreichen Erkrankungen, besonders den chronisch Inflammatorischen, ist durchaus relevant im medizinischen Alltag. Diese Arbeit trägt einen weiteren Baustein dazu bei und gibt Anstoß für weitere Studien.

No description available.

No description available.