Diese Arbeit beschreibt Ergebnisse einer in-vitro Untersuchung der Antipsychotika Chlorpromazin, Haloperidol, Clozapin, N-Desmethylclozapin und Quetiapin bezüglich ihrer Wirkung auf die Zytokinproduktion. Dafür wurde Vollblut von gesunden Probandinnen invitro mit dem Immunmodulator Toxic-Shock-Syndrome-Toxin-1 (TSST-1) stimuliert. Dabei wurden die Konzentrationen der Zytokine Interleukin (IL)-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-17 und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) im unstimulierten Blut und im stimulierten Blut, jeweils mit und ohne Zusatz der Antipsychotika gemessen. Es zeigte sich, dass TSST-1 eine signifikante Stimulation der Produktion aller getesteten Zytokine bewirkte und dass es über diese Stimulation mit TSST-1 hinaus zu einer Erhöhung von IL-17 unter allen getesteten Antipsychotika kam. Aufgrund dieser Ergebnisse ist es denkbar, dass Antipsychotika, in Ergänzung zu ihrer Wirkung an Dopaminrezeptoren, auch über diese immunologische Eigenschaft Wirkungen und Nebenwirkungen entfalten können. Weiterhin könnte die IL-17-Produktion ein Biomarker in der Behandlung mit Antipsychotika sein, der wiederum zur individuellen Vorhersage von Wirkungen und Nebenwirkungen beitragen könnte.

Wir untersuchten Liquor- und Serumproben von 40 an einem shuntversorgten Hydrocephalus erkrankten Kindern auf die Konzentration der Zytokine bFGF, TGF-β1, VEGF, IL-6, IGF-1 und Leptin sowie deren Korrelation mit dem Risiko von Shuntinsuffizienzen. Dabei konnten wir die Hypothese bestätigen, dass erhöhte Konzentration der fibrogenen Zytokine bFGF und TGF-β1 im Serum bzw. Liquor mit einem erhöhten Risiko für operationspflichtige Shuntinsuffizienzen durch Obstruktion des Schlauchsystems einhergehen, und dass diese Komplikationen mit steigenden Zytokinkonzentrationen umso eher eintreten. Außerdem war bFGF im Liquor von Kindern, die zum Abnahmezeitpunkt an einer Shuntdysfunktion durch Obstruktion oder Einwachsen des Shunts litten, signifikant höher als bei Kindern, die zum Zeitpunkt der Abnahme keine Shuntdysfunktion aus eben genannten Gründen hatten. Des Weiteren fanden wir Konzentrationsunterschiede für IL-6 im Liquor zwischen den einzelnen Ursachen der Erkrankung, wobei das Zytokin am höchsten bei Tumorpatienten war, gefolgt von posthämorrhagischem und postmeningitischem Hydrocephalus, und am niedrigsten bei Kindern mit kongenitaler ZNS-Fehlbildung.

Background: The beneficial impact of mesenchymal stem cells (MSC) on both acute and chronic liver diseases has been confirmed, although the molecular mechanisms behind it remain elusive. We aim to identify factors secreted by undifferentiated and hepatocytic differentiated MSC in vitro in order to delineate liver repair pathways potentially targeted by MSC. Methods: Secreted factors were determined by protein arrays and related pathways identified by biomathematical analyses. Results: MSC from adipose tissue and bone marrow expressed a similar pattern of surface markers. After hepatocytic differentiation, CD54 (intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1) increased and CD166 (activated leukocyte cell adhesion molecule, ALCAM) decreased. MSC secreted different factors before and after differentiation. These comprised cytokines involved in innate immunity and growth factors regulating liver regeneration. Pathway analysis revealed cytokine-cytokine receptor interactions, chemokine signalling pathways, the complement and coagulation cascades as well as the Januskinase-signal transducers and activators of transcription (JAK-STAT) and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor (NOD-like receptor) signalling pathways as relevant networks. Relationships to transforming growth factor beta(TGF-beta) and hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1-alpha) signalling seemed also relevant. Conclusion: MSC secreted proteins, which differed depending on cell source and degree of differentiation. The factors might address inflammatory and growth factor pathways as well as chemo-attraction and innate immunity. Since these are prone to dysregulation in most liver diseases, MSC release hepatotropic factors, potentially supporting liver regeneration.

Die akute lymphoblastische Leukämie (ALL) ist die häufigste maligne Erkrankung im Kindesalter. Trotz risikoadaptierter Chemotherapie erleiden 25 - 30 % der Kinder mit ALL ein Rezidiv. Im Rezidivfall liegen die Heilungschancen trotz intensivierter Therapie nur bei 35- 40%. In retrospektiven und prospektiven Analysen konnten wir einerseits prognostisch-relevante, genetische Merkmale in den Leukämiezellen von Kindern mit ALL-Rezidiv erstmals identifizieren. Diese leukämiespezifischen Merkmale umfassen sowohl Translokations-assoziierte Fusionsgene (TEL-AML1, BCR-ABL, MLL-Aberrationen, E2A-PBX1), Deletionen von Tumorsuppressorgenen (p15, p16, p18) als auch Mutationen in DNA-Reparaturgenen (NBS1). Zusammen mit der sensitiven molekularen Bestimmung der Kinetik der Leukämiezellreduktion (Reaktion auf die Therapie, (MRD, minimal residual disease)) läßt sich die Prognose der Kinder mit ALL-Rezidiv durch die Verwendung dieser Marker zuverlässiger bewerten. Andererseits zeigen unsere Analysen, dass das Ansprechen auf die Therapie und die Prognose von wirtseigenen Faktoren (medikamenten metabolisierenden Enzyme) und von der Interaktion zwischen Leukämie- und Stromazellen und löslichen Wachstumsfaktoren (Zytokinen) abhängt. Eine adäquatere Behandlung dieser Patientengruppe, die bereits eine intensive Therapie erhalten hat und wesentlich risikoreichere, mit einer hohen Akut- und Spättoxizität behaftete Therapieverfahren einschließt, lässt sich durch die Berücksichtigung dieser Ergebnisse erreichen. Die genetische Typisierung und die sensitive Quantifizierung des molekularen Ansprechens auf die Therapie ergänzen heute die klinischen Determinanten zur Risikostratifizierung der Kinder mit ALL-Rezidiv der derzeitigen Therapieoptimierungsstudie ALL-REZ BFM 2002 (Berlin-Frankfurt-Münster). / Acute lymphoblastic leukemia is the most common malignancy in childhood. Although the prognosis for pediatric ALL with risk-adapted chemotherapy has improved dramatically, 25-30% of the children suffer a relapse. The prognosis for relapsed ALL remains poor (35-40%). In retrospective and prospective studies, we identified prognostic-relevant genetic features in leukemic blasts from children with ALL relapse. These leukemia-specific aberrations include translocation-associated fusion genes (TEL-AML1, BCR-ABL, MLL changes, E2A-PBX1), deletions of tumor suppressor genes (p15, p16, p18) and point mutations in DNA repair genes (NBS1). Together with the sensitive quantitative assessment of the molecular response to therapy (MRD, minimal residual disease), prediction of outcome is now more reliable. Furthermore, response to therapy and, thus, prognosis is significantly dependent on modifying host factors (drug-metabolizing enzymes) and interactions between leukemic and stromal cells as well as soluble growth factors (cytokines). Today, the genetic characterization of leukemic cells as well as the molecular quantification of response to therapy complement prognostic significant clinical determinants allowing a more precise risk stratification of children with ALL relapse in the relapse trial ALL-REZ BFM 2002 of the BFM (Berlin-Frankfurt-Münster) study group.

In der Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) wird autoantigenspezifischen proinflammatorischen T-Helferzellen eine entscheidende Rolle zugeschrieben. Das am meisten untersuchte Autoantigen ist das Myelin Basic Protein (MBP). Bisher waren zum Nachweis autoantigenspezifischer T-Zellen deren Kultur über Tage bis Monate unumgänglich. In dieser Arbeit wurden Methoden zum direkten ex vivo-Nachweis autoreaktiver T-Helferzellen etabliert, die die reaktive Sekretion der proinflammatorischen Zytokine Interferon gamma und Tumor Nekrose Faktor alpha nach sechsstündiger Stimulation nachweisen. Die durchflusszytometrische Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen wies eine Sensitivität von 1/10.000 in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) auf. Es konnten damit bei 34 untersuchten MS-Patienten und 25 gesunden Kontrollpersonen keine MBP-reaktiven T-Helferzellen detektiert werden, während sich die Reaktion auf die beiden Kontrollantigene Tetanus Toxoid und Cytomegalie Virus-Antigen in den beiden Gruppen nicht relevant unterschied. Deshalb wurde in einer anderen Methode reaktiv sezerniertes Zytokin extrazellulär auf lebenden Zellen gebunden und durch einen anschließenden magnetischen Anreicherungsschritt die Sensitivität auf 2/100.000 erhöht. Bei einem von acht MS-Patienten wurde so eine Population MBP-spezifischer Zellen mit einer Ausgangsfrequenz von 2,15/100.000 nachgewiesen. Im Liquor von drei MS-Patienten ließen sich keine MBP-reaktiven proinflammatorischen T-Helferzellen detektieren. Diese Ergebnisse implizieren, dass die Frequenz MBP-spezifischer T-Helferzellen im peripheren Blut und im Liquor der meisten MS-Patienten und Kontrollpersonen geringer ist als die Sensitivität der etablierten Methoden, diese Zellen jedoch bei einigen Patienten in höheren Frequenzen nachgewiesen werden können. / Autoantigen-specific proinflammatory T-helper cells are assumed to play an important role in the pathogenesis of Multiple Sclerosis (MS). The most extensively studied autoantigen is Myelin Basic Protein (MBP). To detect autoantigen-specific T-cells, so far these had to be cultured for several days or months. In this work methods for the direct ex vivo detection of autoreactive T-helper cells have been established by detecting the reactive secretion of the proinflammatory cytokines Interferon gamma and Tumor Necrosis Factor alpha after six hour stimulation. The flow cytometric analysis of antigen-reactive cytokine expression in fixed cells showed a sensitivity of 1/10.000 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). With this method there could not be detected any MBP-reactive T-helper cells in 34 MS-patients and 25 healthy controls, whereas the reaction after stimulation with the two control antigens Tetanus Toxoid and Cytomegalovirus antigen did not differ relevantly between the two groups. Therefore in another method the reactively secreted cytokine was bound on the surface of living cells and the sensitivity was then increased to 2/100.000 by following magnetic enrichment. With that, there could be detected a population of MBP-specific cells in one of eight MS-patients with a frequency of 2,15/100.000 in PBMC. There could not be found any MBP-reactive proinflammatory T-helper cells in the cerebrospinal fluid of three MS-patients. Our results suggest that the frequency of MBP-specific T-helper cells in peripheral blood and cerebrospinal fluid is below the employed methods' detection limit in most MS-patients, but seldom these cells can be detected in higher frequencies.

Streptococcus pneumoniae ist ein gram-positives Bakterium und ein Krankheitserreger des Menschen. Ein Charakteristikum des Bakteriums ist, dass es Cholin-Reste in seine dicke Zellwand einbaut. Das Ziel meiner Doktorarbeit war herauszufinden, inwiefern diese Cholin-Reste zur Virulenz des Bakteriums während experimenteller Sepsis und Meningitis beitragen. Dabei konnte ich feststellen, das cholinierte Wildtyp-Bakterien hoch virulent waren, ungestört im Wirt wachsen konnten und letztendlich zu einer massiven Überaktivierung des Wirts-Immunsystems (gemessen anhand der Zytokine IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) sowie zum Tode der Versuchtiere führten. Im Gegensatz dazu waren cholin-freie Bakterien nicht in der Lage eine permanente Infektion im Wirt zu etablieren. So wuchsen sie nur anfangs und wurden vom Wirts-Immunsystem kontrolliert und beseitigt, sodass alle Tiere überlebten. Die Injektion von cholin-freien und cholinierten, hoch aufgereinigten Zellwänden, führte zu der Schlussfolgerung, dass Cholin in der Zellwand ein Immunevasionsmechanismus der Bakterien sein muss. Ausserdem waren cholin-freie Bakterien in der Lage einen protektiven, serotyp-spezifischen Immunschutz im Wirt zu induzieren. / Streptococcus pneumonia is a major human pathogen. Since it is a gram positive bacterium it is characterized by the production of a thick cell wall. Being auxotrophic for choline, the pneumococcus attaches this aminoalcohol to its teichoic acids thus decorating its surface with choline-residues. The aim of this work was to investigate the role that these choline residues play in the virulence of the bacterium. By using an isogenic choline-containing and choline-free pair of S. pneumoniae I was able to demonstrate that surface bound choline is essential for the virulence of the bacterium in animal models of experimental sepsis and meningitis. In either model choline-containing bacteria were able to persistently grow within the host system, continuously stimulate the production of proinflammatory cytokines (IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) and eventually led to the death of all infected animals within 24h. In contrast, choline-free bacteria showed only transient growth within the host and induced only moderate and limited expression of cytokines. Consequently, the bacterium was virtually avirulent and all animals survived. Intracisternal application of highly purified cholinated and choline-free cell wall preparations, induced a comparable activation of the immune system. These findings led to the conclusion that choline residues contribute to an immunevasion strategy that allows the bacteria to grow despite an ongoing immune response. Although being avirulent choline-free bacteria were able to induce serotype specific immunity in the animals.

Humane NK Zellen können in CD56br und CD56dim NK Zellen unterteilt werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, in welchem Zusammenhang die verschiedenen NK Zell Populationen stehen und wie funktional kompetente NK Zellen generiert werden. Des Weiteren wurde die Heterogenität der CD56dim NK Zell Population in Bezug auf Funktionalität und Differenzierungsstadien analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass CD56br NK Zellen in CD56dim NK Zellen differenzieren. Währenddessen werden u.a. MHC-I spezifische inhibierende Rezeptoren (KIR) erworben. Diese sind essentiell für die Unterscheidung zwischen “Selbst” und “Nicht-Selbst”, wobei nur NK Zellen, die Selbst-MHC-spezifische KIRs tragen, funktional kompetent sind. In der vor-liegenden Arbeit konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass zuvor anerge NK Zellen nach Zytokin-induzierter Expression eines Selbst-MHC-spezifischen KIRs kompetent werden. Ex vivo Analysen humaner Gewebe lassen vermuten, dass diese Prozesse während einer Entzündung in sekundären lymphatischen Organen (SLO) stattfinden könnten. Auch CD56dim NK Zellen selbst sind nicht homogen, hingegen können anhand der Expression von KIRs oder CD62L, welches für die Migration in SLO wichtig ist, weitere Subpopulationen unterschieden werden. Eine umfassende Analyse bezüglich KIR und CD62L Expression führte zur Identifizierung einer zuvor nicht charakterisierten CD56dimCD62L+ NK Zell Population, welche die Fähigkeiten von CD56br, Zytokine zu produzieren und zu proliferieren, mit einem hohen zytotoxischen Potenzial, vereinigt. Weitere ex vivo Untersuchungen des Phänotyps, der Telomerlängen und der Verteilung in Relation zum Alter lassen vermuten, dass die Differenzierung humaner NK Zellen von CD56br über CD56dimCD62L+ zu CD56dimCD62L- verläuft, wobei die Zellen mit fortschreitender Dif-ferenzierung ihre Fähigkeit auf Zytokine zu antworten verlieren und dafür die Fähigkeit er-langen, über aktivierende Rezeptoren stimuliert zu werden. / Human NK cells comprise two main subsets, CD56br and CD56dim cells. In this study, an extensive analysis of human NK cell phenotype and functional characteristics has been performed in order to investigate the developmental relation between NK cell subsets, to elucidate how NK cell competence is acquired and to further dissect the heterogeneity of the CD56dim subset with regard to functions and differentiation history of human NK cells. It could be shown that upon cytokine activation, CD56br differentiate into CD56dim NK cells and that this process might take place in inflamed secondary lymphoid organs (SLO). One of the crucial markers acquired during this process is KIR, the main MHC-specific inhibitory receptors responsible for self versus non self recognition. Previously, it has been shown that only cells expressing self-MHC specific KIRs are responsive to activating stimuli. In this study, it was demonstrated that induction of self-MHC specific KIR by cytokines leads to acquisition of functional competence. Ex vivo analysis of human tissues suggests that acquisition of KIR and consequently of cytotoxic competence may occur in inflamed SLO. Finally, it was demonstrated that CD56dim NK cells do not represent a homogenous population. When dissected for CD62L and KIR expression, a new subset of NK cells could be identified, namely CD56dimCD62L+, which uniquely combines properties of CD56br NK cells, particularly high IFN-g production upon cytokine stimulation, proliferation and potential to migrate into SLO, with the capacity of CD56dim to kill, produce cytokines upon activating receptor stimulation and to migrate into inflamed tissues. Ex vivo analysis of the function, phenotype, telomere length and frequencies during ageing of CD56br, CD56dimCD62L+ and CD56dimCD62L- NK cells suggest that CD56dimCD62L+ cells represent an intermediate stage of NK cell maturation between the more immature CD56br and the terminally differentiated CD56dim CD62L- NK cells.

The pathogenesis of inflammatory liver diseases and development of liver fibrosis involves hepatocytes as well as non-parenchymal liver cells like resident liver macrophages (Kupffer cells (KC)), Stellate cells and endothelial cells. Kupffer cells play a critical role in liver (patho)physiology and in the defense of the liver during inflammation. They constitute about 50% of non-parenchymal cells and are the largest population of tissues macrophages in the body. Infections, toxins (lipopolysacharide (LPS)), parenchymal damage and stresses stimulate the inflammatory response of Kupffer cells with the following secretion of bioactive factors, cytotoxicity, antigen processing, etc. Resident liver macrophages are the main producers of inflammatory mediators in the liver. Among them there are prostanoids (prostaglandin (PG) E2 and thromboxane (Tx) A2), cytokines (e.g. interleukin (IL)-1,-6, -10, tumor necrosis factor (TNF) α) and inorganic mediators like nitric oxide (NO). Macrophages-derived products play opposing roles in the development of liver fibrogenesis: IL-1β, TNFα, IL-6, transforming growth factor (TGF)-β and TxA2 (pro-fibrogenic mediators) promote whereas PGE2, IL-10 and nitric oxide (anti-fibrogenic mediators) suppress liver fibrogenesis. The present study shows the production of PGE2 and TxA2 by resident liver macrophages upon prolonged activation by LPS and the characterization of biosynthesis pathways. The production of PGE2 and TxA2 is followed during 24 h after stimulation of macrophages with LPS. The involvement of enzymes is measured on the RNA level (RT-PCR), protein level (Western blot analysis) and activity (activity assays), respectively. The amounts of released prostanoids are measured at time points 2, 4, 8 and 24 h after LPS stimulation. The production of PGE2 is very low without stimulation, shows a delay within the first few hours after stimulation with LPS, and thereafter linearly increases up to 24 h. TxA2 production is very low without stimulation, and increases without a time-delay after the addition of LPS. Prostanoid biosynthesis is inhibited by dexamethasone. The present study shows the involvement and regulation of the AA cascade by the following enzymes: cPLA2: is expressed in resting Kupffer cells; cPLA2 expression and phosphorylation is increased by LPS, dexamethasone suppresses the LPS effect, localization in membrane fraction. COX-1: is expressed in resting Kupffer cells; COX-1 expression is not influenced by LPS and dexamethasone. The COX-1 inhibitor SC560 suppresses the LPS-induced production of PGE2 and TxA2 (8h and 24h), localization predominantly in membrane fraction. COX-2: is almost not expressed in resting Kupffer cells; COX-2 expression is highly increased by LPS, dexamethasone suppresses the LPS effect. The COX-2 inhibitor SC236 inhibits the production of PGE2 and TxA2 at 8h by about 77% and 20%, and at 24h by about 42% and 34%, respectively, localization predominantly in membrane fraction. mPGES-1: is almost not expressed in resting cells; mPGES-1 expression is highly increased by LPS, dexamethasone suppresses the LPS effect, localization in membrane fraction. mPGES-2: is expressed in resting Kupffer cells; mPGES-2 expression is slightly increased by LPS, localization predominantly in membrane fraction. cPGES: is expressed in resting Kupffer cells; LPS has no effect, localization predominantly in soluble fraction. TxA2 synthase: is expressed in resting Kupffer cells; LPS and dexamethasone have no effect, localization predominantly in membrane fraction. Treatment of Kupffer cells with IL-1ß and TNF-α leads to an enhanced release of PGE2 and TxA2 and upregulate the expression of cPLA2, COX-2 and mPGES-1. IL-6 has no effect on prostanoid production. In contrast, IL-10 suppresses the LPS-induced production of PGE2 and TxA2 and expression of cPLA2, COX-2 and mPGES-1. Resting Kupffer cells release very low amounts of NO and do not express iNOS, nNOS and eNOS. LPS, TNF-α and IL-1ß upregulate NO release and the expression of iNOS whereas dexamethasone and IL-10 downregulate NO release and the expression of iNOS. PGE2 suppresses the LPS-induced release of NO but enhances the cytokine-induced release of NO. NO induces a release of PGE2. Thus, the study demonstrates a crosstalk between prostanoids, nitric oxide and cytokines in Kupffer cells under inflammatory conditions and demonstrates a possible anti-fibrogenic effect of PGE2 in the process of liver fibrogenesis.

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