Os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) são fatores de transcrição dependentes da ligação de ligantes e possuem um papel chave no controle do metabolismo dos lipídios e da glicose. Existem três isotipos desse receptor: PPARα, PPARβ e PPARγ. O PPARγ é alvo molecular para os compostos TZDs, os quais são fármacos usados clinicamente no controle da diabetes do tipo 2, aumentando a sensibilidade à insulina. Enquanto que os fibratos são os fármacos que atuam no PPARα e são utilizados para diminuir os níveis de triglicerídeos. A maioria dos pacientes que sofrem com a diabetes do tipo 2 apresentam desordens no metabolismo de lipídios. Mesmo com a existência de fármacos capazes de controlar estas desordens metabólicas, a busca de um agonista dual para os PPARα e PPARγ é um grande desafio no controle da síndrome metabólica, uma vez que este composto pode combinar os dois efeitos terapêuticos em uma única molécula. O GL479 é um agonista dual que foi sintetizado com dois grupos farmacóforos, ligando-se tanto ao PPARα quanto ao PPARγ. Dentro desse contexto, este estudo apresenta as bases estruturais de interação do agonista dual GL479 aos PPARs por meio da determinação estrutural dos complexos PPARα-LBD:GL479 e PPARγ-LBD:GL479. A análise detalhada desses complexos revelou diferentes modos de interação do ligante em cada receptor, porém em ambos os casos o GL479 interage com a Tyr da H12. Na estrutura do PPARα-LBD, o ligante adquiriu a característica de um agonista total e no caso do PPARγ-LBD, o GL479 adotou características de um agonista parcial dependente da interação com a H12. Além das analises do agonista dual, 16 compostos foram identificados por docking como ligantes do PPARγ. Três desses ligantes (8, 10 e 15) foram caracterizados por ThermoFluor e fluorescência de polarização com valores de IC50 menor que 10 µM. Adicionalmente, um dos compostos identificados no docking (16) foi cocristalizado com PPARγ-LBD. A conformação adotada pelo ligante não permitiu que ele interagisse diretamente com a H12, sugerindo que este composto possa atuar como um agonista parcial independente da H12. Todas estas descobertas podem ser exploradas no desenho de novos moduladores dos PPARs com menores efeitos adversos ou até mesmo na busca de agonistas duais PPARα ⁄γ, que combine os efeitos terapêuticos no tratamento da diabetes do tipo 2 e da dislipidemia. / Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are ligand-dependent transcription factors that control various functions in human organism and they play key roles in the control of glucose and lipid metabolism. There are three different PPAR isotypes: PPARα, PPARβ e PPARγ. PPARγ is a molecular target of TZD agonists, which are clinically used drugs in the control of type 2 diabetes by increasing insulin sensitivity. Whereas fibrates are drugs that act on PPARα and are used to lower serum triglyceride levels. The most patients who have type 2 diabetes also display lipid metabolism disorders. Even with the existence of drugs that can control these metabolic disorders, the search of dual agonist for PPARα and PPAR γ is a major challenge in the control of metabolic syndrome, because this compound could combine both therapeutic effects in a single molecule. GL479 is a dual agonist that was synthesized based on a combination of two key pharmacophores, with the ability to bind in the both PPARs, α, and γ. Thus, this study reveals the structural basis for this dual agonist GL479 by structural determination of the complexes PPARα-LBD:GL479 and PPARγ-LBD:GL479. The detailed analysis of these complexes showed different ligand binding modes for each receptor, however, in the both cases the GL479 interacted with the Tyr of H12. In the PPARα-LBD structure the ligand acquired the features of full agonist and in the case of PPARγ-LBD, GL479 adopted features of a partial agonist dependent of H12 interaction. In addition to the dual agonist analysis, sixteen compounds were identified as PPARγ ligand by docking. Three of these ligands were characterized by ThermoFluor and fluorescence polarization, which resulted in IC50 values smaller than 10 µM. Additionally, one of the compounds, identified by docking, was co-crystallized with PPARγ. The ligand conformation adopted would not allow it a direct interaction with the H12. These contacts were mediated by one water molecule, suggesting this compound might also act as a partial agonist, independent of H12 interaction. All these findings may be explored for the design of PPARs novel modulators with lower side effects, as well, in the exploration of dual agonists PPARα ⁄ γ that combines the therapeutic effects in the treatment of type 2 diabetes and dyslipidemia.

A moderna suinocultura vem nos últimos anos avançando no desenvolvimento e no emprego de tecnologias que visam o aumento da performance produtiva e econômica do segmento. As inovações associadas aos métodos de castração e modificadores metabólicos têm sido avaliadas, em particular o uso da imunocastração e dos repartidores de energia (ractopamina). Embora os ganhos zootécnicos e industriais destas tecnologias já estejam bem discutidos, o real impacto do emprego juntas ou isoladas sobre a qualidade tecnológica da carne pelo seu efeito na matriz bioquímica, necessita de estudos mais aprofundados. Desta forma, esta pesquisa científica foi direcionada para avaliar os efeitos, focando nas alterações dos perfis eletroforéticos da carne, advinda de animais produzidos comercialmente, utilizando concomitantemente ractopamina e imunocastração. Foram utilizados 48 suínos, criados comercialmente, sendo 8 suínos por tratamento (machos castrados cirurgicamente - CC, machos imunocastrados - IM, e fêmeas - F) recebendo dietas suplementadas com (CR) ou sem (SR) ractopamina na fase final da terminação. Avaliaram-se as características qualitativas da carne, tais como o pH, a cor objetiva, a capacidade de retenção de água (perda de água por gotejamento - drip loss, perda por cocção - PCOC, e perda por descongelamento - PDESC), maciez objetiva (força de cisalhamento) e perfil eletroforético. A utilização conjunta da imunocastração com a ractopamina influenciou o pH 24 horas do lombo suíno, a luminosidade (L*) e a força de cisalhamento, sendo que o pH e a força de cisalhamento foram maiores e a luminosidade menor em IC-CR na dieta. Porém, essa influência não foi verificada na análise eletroforética unidimensional. O perfil proteico foi significativamente influenciado pelo fornecimento do β-agonista adrenérgico. Diferenças na abundância de peptídeos foram verificadas para as variáveis qualitativas da carne maciez, capacidade de retenção de água (drip loss e descongelamento) e luminosidade. Aumento nos volumes normalizados dos peptídeos reduziu a PDESC e melhorou a maciez objetiva, enquanto que o drip loss aumentou quando não houve a suplementação com ractopamina na dieta. Os resultados demonstraram que somente o β-agonista adrenérgico foi o responsável pelas diferenças verificadas no perfil proteico. O efeito simultâneo imunocastração com a inclusão da ractopamina na dieta não propociou impactos na qualidade tecnológica da carne. / The modern swine industry has in recent years to advance the development and use of technologies aimed at increasing production and economic performance of the segment. Innovations associated methods of castration and metabolic modifiers have been evaluated, in special the use of immunocastration and feed additive (ractopamine). Although the production growth and industrial gains of these technologies are already well discussed, the real impact of employment together or isolated on the technological quality of meat by its effect on the biochemical matrix, requires further study. Therefore, this scientific research was directed to evaluate the effects, concentrating on changes in electrophoretic profiles of meat, resulting animals commercially produced concurrently using ractopamine and immunocastration. 48 animals were used commercially created, 8 per treatment (castrates - CC, immunocastrated - IM, and female - F) fed diets supplemented with (CR) or without (SR) ractopamine at the final stage of finishing. We evaluated the qualitative characteristics of meat, such as pH, color, water-holding capacity (drip loss, cooking loss - PCOC, and loss defrosting - PDESC) objective tenderness (shear force) and electrophoretic profile. The combined use of immunocastration with ractopamine influence pH 24h swine loin, the lightness (L*) and shear force, and pH, and shear force were higher and lower luminosity in IC-CR in the diet. However, this effect wasn\'t seen in the one-dimensional electrophoretic analysis. The protein profile was significantly influenced by the supply of β-adrenergic agonist. Differences in the abundance of peptides were checked for qualitative variables of meat tenderness, water retention capacity (drip loss and defrosting) and luminosity. The increase in the volume of standard peptides pDesc reduced and improved objective tenderness, while the drip loss increased when no supplementation with dietary ractopamine. The results demonstrate that only the β-adrenergic agonist was responsible for the observed differences in the protein profile. The effect simultaneously immunocastration with the addition of ractopamine in the diet not influence impacts on technological meat quality.

Estudos anteriores de nosso laboratório demonstraram que a estimulação aguda dos receptores 2-adrenérgicos (2-AR) atenua a perda de massa muscular induzida pela desnervação motora (DEN) por meio de uma via dependente de AMPc/PKA. No entanto os mecanismos moleculares envolvidos na ativação crônica destes receptores ainda são pouco conhecidos. Por outro lado, a ativação desta via de sinalização também está envolvida no controle da estabilidade dos receptores nicotínicos (AChR) na junção neuromuscular (JNM), sugerindo que a densidade dos AChR possa estar sob controle neuro-humoral. Desta forma, aventou-se a possibilidade de que além dos efeitos protetores na massa muscular, a ativação dos receptores 2-AR pudesse mediar a estabilização dos AChR na placa motora. Para testar essa hipótese, camundongos foram submetidos à DEN através da secção do nervo ciático, um protocolo clássico de indução de atrofia muscular e desestabilização dos AChR, e tratados com salina ou clembuterol (CB), um 2-agonista seletivo, por até 14 dias. Após 3 dias de DEN, observou-se redução da massa muscular e aumento do conteúdo proteico e expressão do RNAm de genes relacionados à ativação do sistema Ubiquitina-Proteassoma (atrogina-1 e MuRF1) e do sistema autofágico/lisossomal (catepsina L e LC3). A DEN também promoveu aumento no turnover dos AChR, no número de vesículas endocíticas e na expressão do RNAm para a subunidade 1 dos AChR. Após 7 dias, a DEN reduziu a expressão dos genes relacionados à atrofia e aumentou a atividade da via do AMPc/PKA independentemente do tratamento com CB. Na tentativa de elucidar os sinais extracelulares que produziam esta resposta adaptativa, foi demonstrado que neurônios catecolaminérgicos trafegam ao longo do nervo ciático e sua ablação pela DEN reduziu o conteúdo de noradrenalina muscular. Baseados nestes resultados, foi postulado a existência de uma hipersenbilidade às catecolaminas em músculos desnervados cronicamente. O tratamento com CB por 3 dias aboliu o aumento da expressão dos atrogenes induzido pela DEN e este efeito foi associado ao maior conteúdo de AMPc e de substratos fosforilados pela PKA. Além disso, o CB diminuiu a hiperexpressão do RNAm para catepsina L e LC3 induzida pela DEN de 7 dias. Embora o CB não tenha alterado a meia-vida dos AChR em músculos inervados e desnervados, houve um total bloqueio do aumento do número de vesículas endocíticas contendo o AChR em músculos desnervados e tratados com CB. Corroborando estes dados, o CB aumentou a incorporação de AChR novos nas JNM e este efeito foi também associado à maior expressão do RNAm para a subunidade 1-AChR em músculos desnervados. Esta ação do CB no turnover dos AChR parece ser direta uma vez que neuroniôs catecolaminérgicos presentes no nervo ciático ativam receptores 2-ARe a produção de AMPc especificamente na JNM. Em estudos in vitro, foi demonstrado que a estimulação colinérgica produzida pelo carbacol (10-4M) diminuiu a velocidade de síntese de proteínas, aumentou a proteólise total e a atividade do sistema proteolítico Ca2+-dependente em músculos soleus de ratos por meio da ativação dos receptores nicotínicos. Este efeito catabólico do carbacol foi completamente bloqueado pela adição de CB (10-4M) ao meio de incubação. Os dados obtidos no presente estudo permitem sugerir que a estimulação crônica dos 2-AR no músculo esquelético induz um efeito anti-catabólico pela supressão dos sistemas proteolíticos proteassomal e lisossomal, provavelmente através da via de sinalização do AMPc/PKA. A inibição destes sistemas pode estar relacionada ao aumento do turnover dos AChR, uma vez que a velocidade de incorporação destes receptores na JNM foi aumentada pelo CB. Além disso, os achados que mostram a associação entre neurônios noradrenérgicos e colinérgicos no nervo ciático, que conjuntamente inervam as JNM, e a co-localização de receptores 2-AR e AChR na sinapse permitem sugerir a existência de uma interação funcional entre o sistema colinérgico e adrenérgico na manutenção da massa muscular e da placa motora. / Previous studies from our laboratory have shown that the acute stimulation of 2-adrenergic receptor (2-AR) attenuates the muscle loss induced by motor denervation (DEN) through a cAMP/PKA dependent pathway. However, the molecular mechanisms involved in the chronic activation of these receptors are poorly understood. Furthermore, the activation of this signaling pathway is also involved in controlling the stability of nicotinic receptors (AChR) at the neuromuscular junction (NMJ), suggesting that the density of AChR may be under neurohumoral control. Thus, we postulated that besides the protective effects on muscle mass the activation of 2-AR receptors could mediate the stabilization of AChR in the motor plate. To test this hypothesis, mice were submitted to DEN through of the sciatic nerve section, a classical protocol of induction muscle atrophy and destabilization of AChR, and were treated with saline or clenbuterol (CB), a selective 2-agonist for 14 days. DEN decreased the muscle mass and increased the protein content and mRNA expression of genes related to the activation of the ubiquitin-proteasome system (atrogin-1 and MuRF1) and autophagic/lysosomal system (cathepsin L and LC3). DEN also promoted an increase in the turnover of AChR, number of endocytic vesicles and the expression of mRNA for the 1 subunit of AChR. Interestingly, chronic DEN induced down-regulation of atrophy related-genes, and increased the activity of cAMP/PKA pathway independently of CB treatment. In an attempt to elucidate the extracellular signals that produced this adaptive response, it was demonstrated that catecholaminergic neurons travels along the sciatic nerve and its ablation by DEN reduces muscle norepinephrine content. Based on these results, it was postulated the existence of a muscle adrenergic hypersensitivity to circulating catecholamines induced by chronic DEN. CB treatment for 3 days completely abolished the higher expression of atrogenes and this effect was associated with increased Camp content and PKA phosphorylated substrates. Furthermore, CB decreased the DEN-induced hyperexpression of cathepsin L and LC3 mRNA at 7 days. Although CB has not altered the half-life of AChR in innervated and denervated muscles, it produced a total blockage of the increased number of endocytic vesicles containing the AChR in denervated muscles. Consistently, CB increased the incorporation of new AChR and this effect was associated with an increased expression of the 1-subunit AChR mRNA in denervated muscles. This action of CB on AChR turnover appears to be direct, since catecholaminergic neurons are present in the sciatic nerve stimulating 2-AR and cAMP production specifically in the NMJ. Furthermore, in vitro studies demonstrated that cholinergic stimulation produced by carbachol (10-4M) decreased the rate of protein synthesis and increased the proteolytic activity of Ca2+-dependent system in rat soleus muscle through activation of nicotinic receptors. This catabolic effect of carbachol was completely blocked by the addition of CB (10-4M) to the incubation medium. These data suggest that chronic stimulation of 2-AR in skeletal muscle induces an anti-catabolic effect by suppressing proteasomal and lysosomal proteolytic systems, probably through the cAMP/PKA signaling. The inhibition of these systems seems to be related to the increased AChR incorporation into NMJ induced by CB treatment. Moreover, the association between noradrenergic and cholinergic neurons in the sciatic nerve, both of which innervate the motor endplates, and the co-localization of AChR and 2-ARat the synapse suggest the existence of a functional interaction between cholinergic and adrenergic systems in the maintenance of muscle mass and motor endplate.

INTRODUÇÃO: Aventa-se a hipótese de quepacientes com endometriose poderiam apresentar risco elevado para doenças cardiovasculares. Existe, porém, controvérsia quanto ao perfil lipídico observado nessas pacientes. OBJETIVOS: avaliar os marcadores de risco cardiovascular associados à endometriose, comparando-se o efeito sobre eles de dois diferentes tratamentos para esta doença: Sistema Intra-uterino liberador de levonorgestrel (SIU-LNG) e o análogo do GnRH na forma de depósito (aGnRH). Marcadores inflamatórios, parâmetros clínicos e avaliação lipídica foram utilizados como marcadores de risco cardiovascular. MATERIAL E MÉTODOS: Quarenta pacientes entre 18 e 40 anos, com diagnóstico laparoscópico de endometriose, foram randomizadas para receber tratamento com SIU-LNG (n=22) e com o aGnRH (n=18), durante 6 meses. Foram avaliados o índice de massa corporal, a freqüência cardíaca, as pressões arteriais sistólica e diastólica, além dos seguintes parâmetros laboratoriais: lipidograma (colesterol total (CT), HDL-colesterol (HDL-C), LDL-colesterol (LDL-C), triglicérides (TGL)), interleucina-6 (IL-6), proteína C reativa (PCR), homocisteína, molécula de adesão decélula vascular (VCAM), fator de necrose tumoral ?(TNF-?) e contagem de leucócitos (LCT), sendo realizados no início e após seis meses de tratamento. RESULTADOS: no grupo do SIU-LNG, houve redução dos níveis do VCAM (92,8 ± 4,2ng/mL para 91,2 ± 2,7ng/mL, p=0,04), PCR (0,38 ± 0,30mg/dL para 0,28 ± 0,21mg/dL, p=0,03), CT (247,0 ± 85,0 mg/dL para 180,0 ± 31,0 mg/dL, p=0,0002), TGL (118,0 ± 76,0 mg/dL para 86,5 ± 41,5 mg/dL,p=0,003), LDL-C (160,5 + 66,0mg/dL para 114,5 + 25,5mg/dL, p=0,0005) e HDL-C (63,0 + 20,5mg/dL para 48,5 + 10,5mg/Dl, p=0,002). No grupo do aGnRH, houve aumento da homocisteína (11,5 + 2,9 µmol/L para 13,0 + 2,7µmol/L, p=0,04) e diminuição dos níveis de IL-6 (4,3 + 3,9pg/mL para 2,3 + 0,8pg/mL, p=0,005), VCAM (94,0 + 3,8ng/mL para 92,0 + 1,6ng/mL, p=0,03) e LCT (7330 + 2554 para 6350 + 1778, p=0,01). Esse estudo mostra que alguns marcadores de risco cardiovascular são influenciados por ambos aGnRH e SIU-LNG, mas esse último reduz mais os níveis lipídicos e pode ter efeitos mais favoráveis em longo prazo. / The aim of this prospective and controlled study was to evaluate the cardiovascular risk markers associated with endometriosis and the influence of the levonorgestrel intra-uterine system (LNG-IUS) compared with the GnRH analogue (GnRHa) leuprolide acetate on these risks after six monthsof treatment. Methods: This was a randomized, prospective, open clinical study, with44 patients with laparoscopically and histologically confirmed endometriosis. Patients were randomized into two groups: LNG-IUS group, 22 patients submittedto LNG-IUS insertion, and GnRHa group, 22 patients who received a monthly GnRHa injection for six months. Body mass index, systolic and diastolic arterial blood pressure, heart rate and laboratory cardiovascular risk markers such as interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), C-reactive protein (CRP), homocysteine (HMC), lipid profile, total leucocytes, and vascular cell adhesion molecule (VCAM) were measured before and six months after treatment. Results: in the LNG-IUS group, there was reduction of the levels of VCAM(92.8 +4.2 to 91.2+2.7 ng/mL, p = 0.04), CRP (0.38+0.30 to 0.28+0.21 mg/dL, p = 0.03), total cholesterol (247.0+85.0 to 180.0+31.0 mg/dL, p = 0.0002), triglycerides (118.0+ 76.0 to 86.5+41.5 mg/dL, p = 0.003), LDL (160.5+66.0 to 114.5+25.5 mg/dL, p = 0.0005) and HDL (63.0+20.5 to 48.5+10.5 mg/dL, p = 0.002). The GnRHa group showed an increase of HMC levels (11.5+2.9 to 13.0+2.7 µmol/L, p = 0.04) and a reduction of IL-6 levels (4.3+3.9 to 2.3+0.8 pg/mL, p = 0.005), VCAM (94.0+3.8 to 92.0+1.6 ng/mL, p = 0.03) and total leucocytes (7330+2554 to 6350+1778, p = 0.01). Conclusions: This study shows that some cardiovascular risk markers are influenced by both GnRHa and LNG-IUS,but the latter had a greater positive impact on the lipid profile, which could lead to a favorable effect during long-term treatment.

Os receptores medeiam a maioria das respostas fisiológicas em resposta a diversidade de estímulos. A ativação da sinalização mediada pelo receptor de angiotensina II tipo 1 é o principal responsável pelos efeitos do hormônio angiotensina II (Ang II) nos tecidos alvo. No rim concentrações fisiológicas de Ang II aumentam a atividade no túbulo proximal da isoforma 3 do trocador de Na+/H+ (NHE3). Este efeito é crucial para a manutenção do volume extracelular e pressão arterial. Evidências recentes mostraram que a ativação seletiva da sinalização enviesada da beta-arrestina/ receptor AT1 induz diurese e natriurese independentemente da sinalização via proteína G. Neste estudo testamos a hipótese de que a sinalização enviesada do receptor AT1/ beta-arrestina inibe a atividade do NHE3 no túbulo proximal, bem como investigar os possíveis mecanismos moleculares que medeio este efeito. Para tal, nós determinamos os efeitos do composto TRV120023, que se liga ao receptor AT1, bloqueando o acoplamento da proteína G e estimulando a sinalização da beta-arrestina, na função do NHE3 in vivo e in vitro. A atividade do NHE3 foi medida quer em túbulo proximal nativo, por meio de microperfusão estacionária, bem como em uma linha celular de túbulo proximal de gamba (OKP), por meio de recuperação de pH intracelular dependente de Na+. Os nossos resultados mostram que o TRV120023 na concentração de 10-7 M inibe marcadamente a atividade do NHE3 em túbulo proximal quer in vivo quer in vitro, sendo que este efeito é completamente abolido nas células silenciadas para a beta-arrestina 1 e 2 através de RNA de interferência. Adicionalmente, a estimulação do NHE3 pela Ang II é completamente suprimida pelo TRV120023 quer in vivo quer in vitro. A inibição do NHE3 pelo TRV120023 foi associada com a diminuição do NHE3 expresso na superfície da membrana plasmática em células OKP e com a redistribuição entre o corpo e a base das microvilosidades em túbulo proximal de rato. A diminuição do NHE3 na superfície da membrana plasmática em células OKP estava associado com um aumento na internalização do NHE via endocitose mediada por clatrina. A inibição do NHE3 mediada pela beta-arrestina não envolve a sinalização do receptor AT2, cAMP/ PKA, Akt e ERK1/2. Estes achados indicam que a sinalização enviesada do receptor AT1/beta-arretina inibe a atividade do NHE3 em túbulo proximal, pelo menos em parte, devido a alterações na localização subcelular do NHE3 / Cell surface receptors mediate most of our physiological responses to an array of stimulus. The triggering of the angiotensin II type I (AT1) receptor signaling is the major control point in the regulation of the ultimate effects of the peptide hormone angiotensin II (Ang II) on its target tissue. In the kidney physiological concentrations of Ang II upregulate the activity of proximal tubule Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3). This effect is crucial for maintenance of extracellular fluid volume homeostasis and blood pressure. Recent findings have shown that selective activation of the betaarrestin-biased AT1 receptor signalingpathway induces diuresis and natriuresis independent of G-protein mediated signaling. This study tested the hypothesis that activation of this AT1 receptor/beta-arrestin signaling inhibits NHE3 activity in proximal tubule as well as investigate the underlying molecular mechanisms mediating this effect. To this end, we determined the effects of the compound TRV120023, which binds to the AT1R, blocks G protein coupling, and stimulates beta-arrestin signaling, on NHE3 function in vivo and in vitro. NHE3 activity was measured in both native proximal tubules, by stationary microperfusion, and in opossum proximal tubule (OKP) cells, by Na+-dependent intracellular pH recovery. Our results showed that 10-7 MTRV120023 remarkably inhibited proximal tubule NHE3 activity both in vivo and in vitro, and the effect was completely abolished in OKP cells silenced for beta-arrestin 1 and 2 by small interference RNA. Additionally, stimulation of NHE3 by Ang II was completely suppressed by TRV120023 both in vivo as well as in vitro. Inhibition of NHE3 activity by TRV120023 was associated with a decrease in NHE3 surface expression in OKP cells and with a redistribution from the body to the base of the microvilli in the rat proximal tubule. The decreased surface NHE3 in OKP cells was associated with an increase in NHE3 internalization via clathrin mediated endocytic. Beta-arrestin mediated NHE3 inhibition did not involve AT2 receptor, cAMP/ PKA, Akt and ERK1/2 signaling. These findings indicate that biased signaling of the AT1 receptor/beta-arrestin pathway inhibits NHE3 activity in the proximal tubule at least in part due to changes in NHE3 subcellular localization

A disfunção endotelial, comumente observada em doenças cardiovasculares como hipertensão, é caracterizada por um prejuízo na liberação de fatores vasodilatadores e/ou aumento de fatores vasoconstritores provenientes do endotélio. O desequilíbrio na produção de fatores relaxantes, como o óxido nítrico (NO) e prostaciclina (PGI2), e fatores contráteis, como tromboxano (TXA2), é geralmente associada à excessiva produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Dada a importância do sistema nervoso autonômico simpático para o controle do tônus vascular, esse estudo teve o objetivo de investigar os mecanismos celulares envolvidos na disfunção endotelial na hipertensão renovascular. Avaliamos o papel do endotélio e da produção das EROs, ânion superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2), para a resposta contrátil estimulada com agonista 1-adrenérgico fenilefrina e resposta vasodilatadora induzida pelo doador de NO AuNPs-{Ru-4PySH}n em aorta de ratos normotensos (2R) e hipertensos renais (2R-1C). Curvas concentração-efeito para a fenilefrina (PE) e para AuNPs-{Ru-4PySH}n foram construídas em aortas de ratos 2R e 2R-1C com endotélio intacto (E+) e sem endotélio (E-), na ausência (Controle) ou após incubação com o sequestrador de O2- tiron (0,1 ou 1 mmol/L) ou catalase (30, 90, 150 ou 300 U/mL). Curvas concentração-efeito para PE foram construídas na presença de inibidores seletivos e não seletivos para NO-Sintase e ciclooxigenase (COX). A expressão das enzimas eNOS e COX foi avaliada por Western Blot. A produção de GMPc, TXA2 e PGI2 estimulada com PE foi quantificada por Kit imunoenzimático. A produção de NO e EROs em células endoteliais isoladas foi avaliada por citometria de fluxo utilizando as sondas fluorescentes DAF-2DA e DHE, respectivamente. A produção de H2O2 foi avaliada utilizando o Kit Amplex Red. Nossos resultados indicam que a resposta contrátil induzida pela PE sob tensão de repouso de 1,5 g foi reduzida em aorta de ratos 2R-1C E+ comparada a 2R E+. Essa menor resposta contrátil se deve à maior produção de H2O2 e hiperatividade da eNOS em 2R-1C E+. Embora a COX também esteja hiperativa, o efeito do NO prevalece sobre o efeito do TXA2 em aorta de 2R-1C E+ sob 1,5 g de tensão de repouso, mas não sob 3,0 g de tensão. A produção de H2O2 potencializou a resposta vasodilatadora do doador de NO AuNPs-{Ru-4PySH}n em aorta de 2R-1C E- e a hiperatividade da eNOS reduziu seu efeito em 2R-1C E+. / The endothelial dysfunction present in cardiovascular diseases, such as hypertension, is characterized by reduced endothelium-dependent vasodilator response and/or increased contractile response. The imbalance in the production of endothelium-derived relaxing factors, such as nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI2), and contractile factors, such as thromboxane A2 (TXA2) can contribute to endothelial dysfunction. Endothelial dysfunction has also been associated to increased generation of reactive oxygen species (ROS). Since the sympathetic nervous system plays an important role on vascular tone control, the aim of this study was to evaluate the role of endothelium and ROS, superoxide anion (O2-) and hydrogen peroxide (H2O2), involved in the 1-adrenergic agonist phenylephrine induced contractile response on endothelial dysfunction in renovascular hypertension. Furthermore, we evaluated the endothelium and ROS role on the vasodilator effect induced by the NO donor AuNPs-{Ru-4PySH}n in normotensive (2K) and hypertensive (2K-1C) rat aortas, contracted by phenylephrine (PE). Accordingly, concentration-effect curves to PE and AuNPs-{Ru-4PySH}n were performed in endothelium-intact (E+) and endothelium-denuded aorta (E-) from 2K and 2K-1C rat in the absence (Control) or after incubation with the O2- scavenger Tiron (0.1 and 1 mmol/L) or Catalase (30, 90, 150 and 300 U/mL). Concentrationeffect curves to PE were performed in the presence of inhibitors of endothelial Nitric Oxide Synthase (NOS) and Cyclooxygenase (COX). Protein expression of endothelial NOS (eNOS) and COX was evaluated by Western blot. The production of cyclic GMP, TXA2 and PGI2 was quantified by Elisa Kit Imuno enzyme Assay. NO and EROs production was evaluated by flow citometry using the fluorescence probes DAF-2DA and DHE, respectively. The H2O2 production was evaluated by Kit Amplex Red Assay. Our results indicate that the contractile response induced by PE is reduced in 2K-1C E+ aorta as compared to 2K E+ on 1.5 g of rest tension. This reduced response was due to the high production of H2O2 and hyperactivity of eNOS in 2K-1C E+. Although COX activity is increased in 2K-1C rat aorta, the vasodilator effect to NO attenuates the contractile response induced by TXA2 in 2K-1C E+ on 1.5 g but not 3.0 g of rest tension. The H2O2 production potentiated the vasodilator effect induced by AuNPs-{Ru-4PySH}n in 2K-1C E- aorta and the hyperactivity of eNOS reduced its effect in 2K-1C E+ aorta.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O objetivo deste trabalho foi estudar a ação do fenofibrato, um agonista do receptor ativador da proliferação peroxissomal alfa, no remodelamento cardíaco e na expressão de componentes do sistema renina-angiotensina (SRA) em um modelo de obesidade induzida por dieta. Camundongos machos C57Bl/6 com três meses de idade foram alimentados durante 11 semanas com dieta controle (grupo C, 3,57 kcal/g de dieta) ou dieta hiperlipídica (grupo HL, 5,40 kcal/g de dieta), em seguida foram separados em quatro grupos e estudados durante cinco semanas: C; HL; C-L (C mais fenofibrato) e HL-F (HL mais fenofibrato). Os animais HL foram mais pesados e apresentaram maior pressão arterial (PA) comparados aos animais C, mas HL-F foram mais leves e tiveram PA menor que HL. A resistência insulínica vista nos camundongos HL foi melhorada com fenofibrato nos camundongos HL-F. Fenofibrato reduziu colesterol total, triglicerídeos e aumentou HDL-c. Os animais HL apresentou um ventrículo esquerdo (VE) mais pesado e com espessura da parede maior, como também cardiomiócitos maiores e uma menor razão cardiomiócito/capilares que os animais C. Fenofibrato foi eficiente em melhorar estas alterações. As expressões cardíacas de Angiotensina II (ANG II) e de seu receptor tipo 1 (AT1R) foram maiores, enquanto que a expressão de seu receptor tipo 2 (AT2R) foi menor nos animais HL que nos animais C, e fenofibrato foi eficiente em atenuar estas diferenças. Como conclusão, a dieta HL lidera para a obesidade, elevação da PA, hipertrofia cardíaca, alterações metabólicas e expressão proteica alterada do SRA em camundongos, sugerindo a participação do SRA nestas alterações. Fenofibrato é eficiente em diminuir a PA e controlar a expressão proteica do SRA, assim como no tratamento da resistência insulínica e do remodelamento cardíaco adverso, diminuindo a hipertrofia dos cardiomiócitos e melhorando a vascularização do miocárdio, desta maneira, diminuindo importantes fatores de risco para doenças cardiovasculares / The aim was to study the action of fenofibrate, a peroxisome proliferator-activated receptor alpha agonist, in cardiac remodeling and protein expressions of RAS components in a model of obesity induced by diet. 3-mo-old C57BL/6 male were fed for 11 weeks with standard chow (SC group, 3.57 kcal/g of chow) or high-fat chow (HF group, 5.40 kcal/g of chow), then they were separated into four groups and studied for five weeks: SC; HF; SC-F (SC plus fenofibrate) and HF-F (HF plus fenofibrate). HF was heavier and had higher blood pressure (BP) than SC, but HF-F was lighter and had lower BP than HF. The insulin resistance seen in HF mice was corrected by fenofibrate in HF-F mice. Fenofibrate reduced total cholesterol, triglycerides and raised the HDL-c. HF had thicker and heavier left ventricle (LV) with bigger LV cardiomyocyte and smaller cardiomyocyte-to-capillaries ratio than SC, and fenofibrate was efficient in treating these alterations. Cardiac expressions of angiotensin II (ANG II) and ANG II receptor 1 were higher, and ANG II receptor 2 was lower in HF than in SC, and fenofibrate was efficient in attenuating these differences. In conclusion, HF diet leads to obesity, BP elevation, cardiac hypertrophy, metabolic changes and altered RAS protein expression in mice, suggesting that RAS is involved. Fenofibrate is efficient in decreasing BP and in controlling RAS protein expressions, and treats the insulin resistance and the adverse cardiac remodeling decreasing the cardiomyocyte hypertrophy and improving the myocardial vascularization, therefore, decreasing important cardiovascular risk factors

Os receptores medeiam a maioria das respostas fisiológicas em resposta a diversidade de estímulos. A ativação da sinalização mediada pelo receptor de angiotensina II tipo 1 é o principal responsável pelos efeitos do hormônio angiotensina II (Ang II) nos tecidos alvo. No rim concentrações fisiológicas de Ang II aumentam a atividade no túbulo proximal da isoforma 3 do trocador de Na+/H+ (NHE3). Este efeito é crucial para a manutenção do volume extracelular e pressão arterial. Evidências recentes mostraram que a ativação seletiva da sinalização enviesada da beta-arrestina/ receptor AT1 induz diurese e natriurese independentemente da sinalização via proteína G. Neste estudo testamos a hipótese de que a sinalização enviesada do receptor AT1/ beta-arrestina inibe a atividade do NHE3 no túbulo proximal, bem como investigar os possíveis mecanismos moleculares que medeio este efeito. Para tal, nós determinamos os efeitos do composto TRV120023, que se liga ao receptor AT1, bloqueando o acoplamento da proteína G e estimulando a sinalização da beta-arrestina, na função do NHE3 in vivo e in vitro. A atividade do NHE3 foi medida quer em túbulo proximal nativo, por meio de microperfusão estacionária, bem como em uma linha celular de túbulo proximal de gamba (OKP), por meio de recuperação de pH intracelular dependente de Na+. Os nossos resultados mostram que o TRV120023 na concentração de 10-7 M inibe marcadamente a atividade do NHE3 em túbulo proximal quer in vivo quer in vitro, sendo que este efeito é completamente abolido nas células silenciadas para a beta-arrestina 1 e 2 através de RNA de interferência. Adicionalmente, a estimulação do NHE3 pela Ang II é completamente suprimida pelo TRV120023 quer in vivo quer in vitro. A inibição do NHE3 pelo TRV120023 foi associada com a diminuição do NHE3 expresso na superfície da membrana plasmática em células OKP e com a redistribuição entre o corpo e a base das microvilosidades em túbulo proximal de rato. A diminuição do NHE3 na superfície da membrana plasmática em células OKP estava associado com um aumento na internalização do NHE via endocitose mediada por clatrina. A inibição do NHE3 mediada pela beta-arrestina não envolve a sinalização do receptor AT2, cAMP/ PKA, Akt e ERK1/2. Estes achados indicam que a sinalização enviesada do receptor AT1/beta-arretina inibe a atividade do NHE3 em túbulo proximal, pelo menos em parte, devido a alterações na localização subcelular do NHE3 / Cell surface receptors mediate most of our physiological responses to an array of stimulus. The triggering of the angiotensin II type I (AT1) receptor signaling is the major control point in the regulation of the ultimate effects of the peptide hormone angiotensin II (Ang II) on its target tissue. In the kidney physiological concentrations of Ang II upregulate the activity of proximal tubule Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3). This effect is crucial for maintenance of extracellular fluid volume homeostasis and blood pressure. Recent findings have shown that selective activation of the betaarrestin-biased AT1 receptor signalingpathway induces diuresis and natriuresis independent of G-protein mediated signaling. This study tested the hypothesis that activation of this AT1 receptor/beta-arrestin signaling inhibits NHE3 activity in proximal tubule as well as investigate the underlying molecular mechanisms mediating this effect. To this end, we determined the effects of the compound TRV120023, which binds to the AT1R, blocks G protein coupling, and stimulates beta-arrestin signaling, on NHE3 function in vivo and in vitro. NHE3 activity was measured in both native proximal tubules, by stationary microperfusion, and in opossum proximal tubule (OKP) cells, by Na+-dependent intracellular pH recovery. Our results showed that 10-7 MTRV120023 remarkably inhibited proximal tubule NHE3 activity both in vivo and in vitro, and the effect was completely abolished in OKP cells silenced for beta-arrestin 1 and 2 by small interference RNA. Additionally, stimulation of NHE3 by Ang II was completely suppressed by TRV120023 both in vivo as well as in vitro. Inhibition of NHE3 activity by TRV120023 was associated with a decrease in NHE3 surface expression in OKP cells and with a redistribution from the body to the base of the microvilli in the rat proximal tubule. The decreased surface NHE3 in OKP cells was associated with an increase in NHE3 internalization via clathrin mediated endocytic. Beta-arrestin mediated NHE3 inhibition did not involve AT2 receptor, cAMP/ PKA, Akt and ERK1/2 signaling. These findings indicate that biased signaling of the AT1 receptor/beta-arrestin pathway inhibits NHE3 activity in the proximal tubule at least in part due to changes in NHE3 subcellular localization

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O objetivo deste trabalho foi estudar a ação do fenofibrato, um agonista do receptor ativador da proliferação peroxissomal alfa, no remodelamento cardíaco e na expressão de componentes do sistema renina-angiotensina (SRA) em um modelo de obesidade induzida por dieta. Camundongos machos C57Bl/6 com três meses de idade foram alimentados durante 11 semanas com dieta controle (grupo C, 3,57 kcal/g de dieta) ou dieta hiperlipídica (grupo HL, 5,40 kcal/g de dieta), em seguida foram separados em quatro grupos e estudados durante cinco semanas: C; HL; C-L (C mais fenofibrato) e HL-F (HL mais fenofibrato). Os animais HL foram mais pesados e apresentaram maior pressão arterial (PA) comparados aos animais C, mas HL-F foram mais leves e tiveram PA menor que HL. A resistência insulínica vista nos camundongos HL foi melhorada com fenofibrato nos camundongos HL-F. Fenofibrato reduziu colesterol total, triglicerídeos e aumentou HDL-c. Os animais HL apresentou um ventrículo esquerdo (VE) mais pesado e com espessura da parede maior, como também cardiomiócitos maiores e uma menor razão cardiomiócito/capilares que os animais C. Fenofibrato foi eficiente em melhorar estas alterações. As expressões cardíacas de Angiotensina II (ANG II) e de seu receptor tipo 1 (AT1R) foram maiores, enquanto que a expressão de seu receptor tipo 2 (AT2R) foi menor nos animais HL que nos animais C, e fenofibrato foi eficiente em atenuar estas diferenças. Como conclusão, a dieta HL lidera para a obesidade, elevação da PA, hipertrofia cardíaca, alterações metabólicas e expressão proteica alterada do SRA em camundongos, sugerindo a participação do SRA nestas alterações. Fenofibrato é eficiente em diminuir a PA e controlar a expressão proteica do SRA, assim como no tratamento da resistência insulínica e do remodelamento cardíaco adverso, diminuindo a hipertrofia dos cardiomiócitos e melhorando a vascularização do miocárdio, desta maneira, diminuindo importantes fatores de risco para doenças cardiovasculares / The aim was to study the action of fenofibrate, a peroxisome proliferator-activated receptor alpha agonist, in cardiac remodeling and protein expressions of RAS components in a model of obesity induced by diet. 3-mo-old C57BL/6 male were fed for 11 weeks with standard chow (SC group, 3.57 kcal/g of chow) or high-fat chow (HF group, 5.40 kcal/g of chow), then they were separated into four groups and studied for five weeks: SC; HF; SC-F (SC plus fenofibrate) and HF-F (HF plus fenofibrate). HF was heavier and had higher blood pressure (BP) than SC, but HF-F was lighter and had lower BP than HF. The insulin resistance seen in HF mice was corrected by fenofibrate in HF-F mice. Fenofibrate reduced total cholesterol, triglycerides and raised the HDL-c. HF had thicker and heavier left ventricle (LV) with bigger LV cardiomyocyte and smaller cardiomyocyte-to-capillaries ratio than SC, and fenofibrate was efficient in treating these alterations. Cardiac expressions of angiotensin II (ANG II) and ANG II receptor 1 were higher, and ANG II receptor 2 was lower in HF than in SC, and fenofibrate was efficient in attenuating these differences. In conclusion, HF diet leads to obesity, BP elevation, cardiac hypertrophy, metabolic changes and altered RAS protein expression in mice, suggesting that RAS is involved. Fenofibrate is efficient in decreasing BP and in controlling RAS protein expressions, and treats the insulin resistance and the adverse cardiac remodeling decreasing the cardiomyocyte hypertrophy and improving the myocardial vascularization, therefore, decreasing important cardiovascular risk factors

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-12-19T18:38:39Z No. of bitstreams: 2 Tese - Jalsi Tacon Arruda - 2013.pdf: 4216712 bytes, checksum: ec49a9884c1f4b73b53a9b224c7c4aa1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-12-22T11:01:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Jalsi Tacon Arruda - 2013.pdf: 4216712 bytes, checksum: ec49a9884c1f4b73b53a9b224c7c4aa1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-22T11:01:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Jalsi Tacon Arruda - 2013.pdf: 4216712 bytes, checksum: ec49a9884c1f4b73b53a9b224c7c4aa1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-07-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Infertility affects more couples and assisted reproduction techniques offer a possibility of treatment and the chance of having a child. Thus, the first attempt to ovulation induction is critical to the success of the cycle or even for future attempts is successful. Objective: To compare the protocols using GnRH agonist or antagonist for ovarian stimulation in normo-responders undergoing the first cycle of IVF/ICSI. Methods: we conducted a literature review on the history of ovulation induction controlled by medications. From the data available in the database of electronic medical records SISFERT used in the Laboratory of Human Reproduction (LabRep-HC-FM-UFG) a comparative retrospective observational study was conducted with 50 patients divided into two groups according to protocol: GnRH-agonist (leuprolide acetate 1 mg/day short protocol) or GnRHantagonist (Cetrorelix 0.25 mg/day), which received 150 IU/day of rFSH (follitropin alpha) and 250 µg of rhCG (alpha-coriogonadotrofina) in both groups. Results: Statistically significant differences were observed in the days of stimulation with rFSH, total dose of gonadotropin, days of use of GnRH, GnRH dose and total number of follicles (≥ 16 mm) on the day of the group rhCG GnRH agonist. There was no significant difference in other parameters, however, the number of oocytes retrieved was slightly higher in the GnRH agonist, but fertilization rate was higher in the GnRH-antagonist. Pregnancy rates and clinical chemistry were similar in both groups. Conclusions: although no significant differences in the results analyzed, the use of flexible antagonist protocol facilitates the handling and enables the patient using much lower doses of gonadotropins itself as the antagonist, reducing the cost of treatment when compared to the protocol with GnRH agonist. / A infertilidade afeta cada vez mais casais e as técnicas de reprodução assistida oferecem uma possibilidade de tratamento e a chance de ter um filho. Assim, a primeira tentativa de indução da ovulação é fundamental para o sucesso do ciclo ou, até mesmo, para que tentativas futuras sejam bem sucedidas. Objetivo: comparar os protocolos utilizando agonista ou antagonista do GnRH para estimulação ovariana em pacientes normo-respondedoras submetidas ao primeiro ciclo de FIV/ICSI. Métodos: foi realizada uma revisão da literatura sobre a história da indução da ovulação controlada por medicamentos. A partir dos dados disponíveis no banco de prontuários eletrônicos SISFERT utilizado pelo Laboratório de Reprodução Humana (LabRep–HC–FM–UFG), um estudo observacional retrospectivo comparativo foi conduzido com 50 pacientes distribuídas em dois grupos de acordo com o protocolo: GnRH-agonista (acetato de leuprolide 1 mg/dia protocolo curto) ou GnRH-antagonista (cetrorelix 0,25 mg/dia); e que receberam 150 UI/dia de rFSH (alfa-folitropina) e 250 µg de rhCG (alfa-coriogonadotrofina) em ambos os grupos. Resultados: foram observadas diferenças estatisticamente significativas nos dias de estimulação com rFSH, dose total de gonadotrofina, dias de uso do GnRH, dose total de GnRH e o número de folículos (≥ 16 mm) no dia do rhCG no grupo GnRH-agonista. Não houve diferença significativa nos outros parâmetros, no entanto, o número de oócitos recuperados foi ligeiramente maior no grupo GnRH-agonista, mas a taxa de fertilização foi maior no grupo GnRH-antagonista. As taxas de gravidez química e clínica foram similares nos dois grupos. Conclusões: embora não tenha havido diferenças significativas nos resultados analisados, o uso do protocolo flexível com antagonista facilita a manipulação pela paciente usuária e possibilita doses menores tanto de gonadotrofinas quanto do próprio antagonista, reduzindo o custo do tratamento quando comparado ao protocolo com agonista do GnRH