Un des mécanismes d’évasion des cellules tumorales au système immunitaire fait intervenir la famille des molécules de type B7. Ces molécules de costimulation ont aussi un rôle dans les mécanismes de tolérance immunitaire. La molécule B7-H1 (PD-L1 ou CD274) inhibe directement les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et est fortement exprimée à la surface de nombreux types de cellules tumorales. Les mécanismes de régulation de son expression ne sont pas bien connus. Il existe une augmentation d’expression de cette molécule après stimulation par l’IFNγ et récemment les ligands des Toll-Like-Receptor (TLR) 2, 4 et 9 ont été impliqués dans sa régulation au niveau du myélome multiple. L’implication possible des TLR dans l’expression de B7-H1 suggère un rôle possible de pathogènes dans l’échappement des tumeurs au système immunitaireIl n’existe aucune donnée dans la littérature sur l’expression des TLR au niveau des cellules blastiques de patients atteints de leucémies aigues myéloblastique (LAM). Nous avons dans un premier temps étudié l’expression des TLR dans les LAM et l’inductibilité de l’expression de la molécule B7-H1 par les ligands des TLR en cytométrie en flux. Nos résultats montrent que les TLR sont exprimés dans les LAM, avec une grande variabilité suivant les patients. On observe une augmentation significative de l’expression de B7-H1 après stimulation par le LPS (ligand TLR4) alors qu’elle n’est pas significative pour les autres ligands (PGN et ODN). Comme dans les tumeurs solides et le myélome multiple, l’expression de B7-H1 est augmentée par l’IFN γ. Des tests de lyse CTL sont en cours afin de confirmer le rôle fonctionnel de cette expression de B7-H1 via les TLR dans les LAM.Une autre partie de l’étude a été réalisée sur deux lignées murines leucémiques : DA1-3B et WEHI-3B, afin de disposer de modèles expérimentaux d’expression de B7-H1. On retrouve sur ces deux modèles l’augmentation d’expression de B7-H1 après stimulation par l’IFN γ et les ligands des TLR. L’utilisation de différents inhibiteurs chimiques des voies de signalisation suggère le rôle des voies MEK/ERK et de la voie JAK/STAT dans l’expression de cette molécule. La voie PI3kinase/Akt semble au contraire jouer un rôle inhibiteur. Le travail se poursuit avec la transfection de transdominants négatifs des différentes voies et de mutants constitutivement actifs. L’objectif à terme est de tester des stratégies d’immunothérapies des LAM par blocage pharmacologique de l’expression de B7-H1. / B7-H1 (PD-L1) is a B7-related protein that inhibits T-cell responses. B7-H1 participates in the immunoescape of cancer cells and is also involved in the long-term persistence of leukemic cells in a mouse model. B7-H1 can be constitutively expressed by cancer cells but is also induced by various stimuli. We therefore examined the constitutive and inducible expression of B7-H1 and the consequences of expression in human acute myeloid leukemia (AML). We analyzed B7-H1 expression in a cohort of 79 patients with AML. Blast cells were also studied after incubation with interferon-gamma or TLR ligands. Functionality was evaluated by cytotoxic T-cell activity against blast cells. Expression of B7-H1 at diagnosis was high in 18% of patients. Expression of toll-like receptors (TLR) 2, 4, and 9 was detected in one-third of AML samples. Expression of TLR2 and TLR4 ligands or IFN- induced by B7-H1 was found to protect AML cells from CTL-mediated lysis. Spontaneous B7-H1 expression was also found to be enhanced at relapse in some patients. MEK inhibitors including UO126 and AZD6244 reduced B7-H1 expression and restored CTL-mediated lysis of blast cells. In AML, B7-H1 expression by blasts represents a possible immune escape mechanism. The inducibility of B7-H1 expression by IFN- or TLR ligands suggests that various stimuli, either produced during the immune response against leukemia cells or released by infectious microorganisms, could protect leukemic cells from T-cells. The efficacy of MEK inhibitors against B7-H1-mediated inhibition of CTLs suggests a possible cancer immunotherapy strategy using targeted drugs.

Els virus JC i BK pertanyen a la família Polyomaviridae i fan infeccions al ronyó d'un 60-80% d'individus adults arreu del món sense causar en principi cap simptomatologia. En condicions d'immunosupressió JC pot ocasionar una malaltia letal del cervell anomenada leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML) que afecta un 4% de pacients de SIDA, BK pot ocasionar nefropatia en pacients trasplantats de ronyó. Ambdós virus s'han relacionat recentment amb tumors de cervell i JC amb tumors colorectals. La ruta de transmissió d'aquests virus roman desconeguda.Entre els anys 1955-1961, SV40, un poliomavirus que infecta micos rhesus, va ser administrat a la població en ser un contaminant de les cèl·lules utilitzades per produir les vacunes de la polio. Recentment, SV40 ha estat detectat en tumors humans i la possibilitat de que infecti la població està sent considerada.L'objectiu d'aquesta tesi doctoral va ser el d'estudiar l'excreció d'aquest virus per part de la població de diverses zones geogràfiques. En la primera part de l'estudi es va dissenyar un mètode per detectar els poliomavirus BK, JC i SV40 en mostres d'aigua residual urbana i altres mostres ambientals. La detecció de virus en aquestes mostres permet estudiar els virus excretats per comunitats senceres en un moment i en un indret determinat. El mètode desenvolupat va permetre concentrar i detectar per PCR niada les partícules víriques (PV) de JC, BK i SV40 presents en un total de 52 mostres d'aigua residual urbana de Barcelona, Umeå (Suècia), Nancy (França), Pretoria (Sudàfrica), Cairo (Egipte), Patras (Grècia) i Washington DC (EUA). També es va estudiar la presència de poliomavirus humans i SV40 en 10 mostres de mol·luscs bivalves (Tarragona) i en 23 mostres ambientals del Nord de la Índia.Es van detectar elevades concentracions de JC i BK (10 elevat a 3 i 10 elevat a 2 PV/ml respectivament) i absència de resultats positius per SV40. Es va estudiar l'estabilitat a 20ºC dels JC i BK presents en aquest tipus de mostres. En una segona part de l'estudi, els virus detectats van ser tipificats, analitzats filogenèticament i l'estructura de la seva regió reguladora (RR) va ser caracteritzada. L'estudi de la regió intergènica (RI) de JC va permetre construir un arbre filogenetic que relacionava les soques detectades amb l'origen ètnic de les poblacions estudiades. L'estudi de la RR de JC va permetre concloure que la majoria dels JC presents en aigües residuals presenten una configuració arquetípica d'aquesta regió (al igual que passa amb BK) tot i que es va detectar un petit percentatge de soques amb RR reorganitzades en l'aigua residual de Washington DC. En la tercera part d'aquest estudi, es descriu per primera vegada com PV dels JC i BK arquetípics presents en una mostra d'orina d'una dona embarassada van infectar cèl·lules SVG. JC Mad-4 (soca control) tractat amb tripsina va infectar cèl·lules SVG al igual que Mad-4 sense tractar. Mad-4 tractat amb pH 3 durant 1 hora va infectar les cèl·lules produint però un descens en el títol de la progènie.Aquests resultats ens van fer suggerir una ruta de transmissió de JC a partir d'aigües o aliments contaminats a través del tracte gastrointestinal.Es va estudiar l'excreció de les PV de SV40 excretades per una població de micos Cynomolgus naturalment infectats amb el virus. Es van detectar soques arquetípiques de SV40 en la meitat de les gàbies analitzades confirmant que el mètode desenvolupat permet detectar SV40 en mostres ambientals. L'absència de SV40 en les mostres estudiades indica que el virus no està sent excretat per la població estudiada que està present en molt baixes concentracions (<5PV/ml d'aigua residual).

Ce travail sur l'étude des paléoenvironnements holocènes de la partie occidentale du delta rhodanien se devait d'atteindre plusieurs objectifs majeurs.<br />* Identifier un ancien axe fluvial holocène entre les Costières et le cordon des Sables, cerner la période d'activité principale des paléochenaux holocènes développés dans le golfe d'Aigues-Mortes ainsi que leur modalité d'évolution hydro-sédimentaire, <br />* mettre en relation l'activité hydrologique des chenaux et les morphologies d'embouchure, caractériser et dater les formes littorales, et à l'aide de modèles actuels approcher les conditions hydro-dynamiques fluviales et marines qui ont prévalu à leur édification, et enfin, discuter de la présence d'une cellule hydro-sédimentaire au sein du golfe d'Aigues-Mortes,<br />* cerner et discuter de l'influence des contrôles internes et externes dans la construction de la plaine deltaïque occidentale,<br />* mettre en relation les témoins archéologiques et les nouvelles données paléoenvironnementales.<br /><br />La démarche adoptée est une approche intégrée de différentes disciplines et méthodes de terrain. La sédimentologie sur carottage et le travail sur coupes et à la surface ainsi que l'utilisation de référentiels actuels permettent d'appréhender les dynamiques de mise en place et la reconstitution des milieux de dépôts. Cette démarche est appuyée par l'étude des formes de surface ou à partir des reconstitutions 3D réalisées à partir des sondages.<br />L'étude des archives sédimentaires sur site et hors site (coupes et/ou sondages carottés) et pour les périodes récentes manuscrites et cartographiques permettent alors de 1) dégager les grandes phases et les facteurs de la transformation des paléomilieux au cours de l'Holocène, 2) préciser les contextes paléogéographiques contemporains des lieux de peuplement et 3) décrire les réponses apportées par les communautés riveraines en particulier dans les zones à sédimentation active aux échelles locales (sites) et régionales. <br /><br />Les résultats acquis dans la plaine deltaïque de Petite Camargue permettent d'affiner les étapes de formation du delta du Rhône à l'Holocène. Jusqu'à l'Antiquité, la plaine deltaïque de Petite Camargue est isolée en arrière d'un vaste cordon sableux. Les fleuves débouchent et meurent alors dans un vaste bassin lagunaire qui, par ailleurs, a constitué un environnement de plus en plus favorable à la formation de crevasses fluviales. La dynamique hydro-sédimentaire entre le Petit Rhône et le Vidourle se limite dans un espace exigu ce qui par analogie au delta du Danube, pourrait constituer le Stade Bloqué de la partie occidentale du delta rhodanien. Cet épisode se termine lorsque les chenaux percent le vaste cordon littoral sableux. A partir de ce moment, les chenaux progradent vers la mer Méditerranée pour construire des lobes deltaïques. Les morphologies distinctes des lobes apparaissent clairement à la surface de la plaine. Elles expriment l'évolution des processus fluviatiles et marins et leur degré de dominance de l'antiquité romaine à la fin du Moyen Age. La variabilité des processus s'exprime alors par des lobes deltaïques ayant des caractères morphologiques et sédimentologiques qui leur sont propres. <br />Les apports fluviatiles et la dynamique marine contrôlent le remplissage sédimentaire du golfe d'Aigues-Mortes. Ni les variations eustatiques, ni la paléogéographie pléistocène ne semblent avoir influencé la vitesse d'avancée des lobes deltaïques fossiles. Le colmatage du paléogolfe est aussi sous l'influence de facteurs autocycliques et allocycliques. Ceux-ci sont régis par des processus hydro-sédimentaires et climatiques difficiles à appréhender. Pourtant de multiples indicateurs environnementaux et humains montrent l'existence de forçages comme celui du Petit Age Glaciaire.<br /><br />Pour affiner les reconstitutions paléogéographiques (transitions entre les faciès lagunaires et fluviatiles, délimitation géométrique des sections transversales des bras morts fluviaux, modalités de remplissage sédimentaire des chenaux...), il apparaît essentiel de multiplier les sondages carottés dans la plaine deltaïque de Petite Camargue et de dater par le radiocarbone 14 les milieux de sédimentation fossiles.<br />L'absence d'une plus haute résolution de l'information, les effets de sites ainsi que la régulation cyclique des lobes deltaïques masquent des tendances hydro-sédimentaires reconnues sur d'autres espaces. Seule une résolution plus fine avec une comparaison multi-sites permettra d'affiner la lecture climatique des sources textuelles et des données sédimentaires et géomorphologiques.

Les virus du Chikungunya (CHIKV) et de la dengue (DENV) sont deux virus émergents qui sévissent dans les régions tropicales et subtropicales du monde entier et qui sont transmis par les moustiques du genre Aedes. Ces dernières années, leur transmission a surtout progressé dans les zones urbaines et périurbaines touchant des millions d’individus et faisant de ces deux pathogènes des sujets majeurs de préoccupation pour la santé publique. Le Chikungunya et la Dengue sont des infections dites aiguës entrainant une mise en place rapide de la réponse immunitaire innée qui joue un rôle majeur dans le contrôle et l’évolution de la maladie. Les cellules Natural Killer (NK) représentent une population cellulaire clé de la réponse innée et jouent un rôle crucial dans les mécanismes de défense mis en place. A travers une étude ex vivo et in vitro, nous nous sommes intéressées à la caractérisation des cellules NK à travers (i) une étude phénotypique et fonctionnelle des cellules NK chez des patients infectés en phase aiguë par le CHIKV, DENV-2 ou par les deux virus et (ii) à la caractérisation des interactions entre les cellules NK et les cellules cibles infectées par le virus. L’ensemble de ces données contribue à mieux identifier l’implication des cellules NK dans le contrôle des infections par le CHIKV et DENV-2 permettant ainsi de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des dérèglements de la réponse immunitaire. Au cours des dernières épidémies, plusieurs cas de patients coinfectés par les deux virus ont été répertoriés. De plus, l’expansion géographique des moustiques Aedes pourrait amener à une augmentation du nombre de cas de coinfections sans que les mécanismes sous jacents aux coinfections ne soient étudiés. Afin de pouvoir réponse à certaines questions concernant ce phénomène, nous avons mis en place un modèle expérimental de coinfection par CHIKV et DENV-2 chez le macaque Rhésus. / Chikungunya (CHIKV) and Dengue (DENV) virus are both re-emerging viruses transmitted by Aedes mosquitoes and responsible of widespread outbreaks in tropical and subtropical country. Recently, transmission of both viruses had emerged in urban and peri-urban area infecting millions of persons. Chikungunya and Dengue are both acute infections where innate immunity rapidly takes place and play a crucial role in the control and in the evolution of the disease. Natural Killer cells (NK) represent one of the major cellular population of innate immunity and play a crucial role in defense mechanism. By way of ex vivo and in vitro studies, we characterized NK cells by (i) a phenotypic and functional study of NK cells in CHIKV, DENV-2 infected patients or CHIKV/DENV-2 co-infected patients and (ii) characterization of NK cells interactions with infected target cells. During last outbreaks, several cases of co-infected patients were reported. Moreover, geographic spread of Aedes mosquitoes could increase number of coinfection cases without underlying mechanisms being explored. In order to respond to certain questions regarding coinfections, we realized a co-infected CHIKV and DENV-2 experimental model in Rhesus macaques.Together, these data will contribute to better identify NK cells implication in the control of CHIKV and DENV-2 infections allowing a better comprehension of mechanisms that causes immune system disorder.

Les virus du Chikungunya (CHIKV) et de la dengue (DENV) sont deux virus émergents qui sévissent dans les régions tropicales et subtropicales du monde entier et qui sont transmis par les moustiques du genre Aedes. Ces dernières années, leur transmission a surtout progressé dans les zones urbaines et périurbaines touchant des millions d'individus et faisant de ces deux pathogènes des sujets majeurs de préoccupation pour la santé publique. Le Chikungunya et la Dengue sont des infections dites aiguës entrainant une mise en place rapide de la réponse immunitaire innée qui joue un rôle majeur dans le contrôle et l'évolution de la maladie. Les cellules Natural Killer (NK) représentent une population cellulaire clé de la réponse innée et jouent un rôle crucial dans les mécanismes de défense mis en place. A travers une étude ex vivo et in vitro, nous nous sommes intéressées à la caractérisation des cellules NK à travers (i) une étude phénotypique et fonctionnelle des cellules NK chez des patients infectés en phase aiguë par le CHIKV, DENV-2 ou par les deux virus et (ii) à la caractérisation des interactions entre les cellules NK et les cellules cibles infectées par le virus. L'ensemble de ces données contribue à mieux identifier l'implication des cellules NK dans le contrôle des infections par le CHIKV et DENV-2 permettant ainsi de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des dérèglements de la réponse immunitaire. Au cours des dernières épidémies, plusieurs cas de patients coinfectés par les deux virus ont été répertoriés. De plus, l'expansion géographique des moustiques Aedes pourrait amener à une augmentation du nombre de cas de coinfections sans que les mécanismes sous jacents aux coinfections ne soient étudiés. Afin de pouvoir réponse à certaines questions concernant ce phénomène, nous avons mis en place un modèle expérimental de coinfection par CHIKV et DENV-2 chez le macaque Rhésus.

Dans le monde, 350 000 leucémies sont diagnostiquées chaque année. La rechute reste un problème majeur des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) et le métabolisme oxydatif pourrait jouer un rôle essentiel dans la réponse au traitement. Un faible niveau des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est associé à des propriétés des cellules souches leucémiques et la quiescence alors qu’un niveau plus élevé caractérise les leucoblastes proliférants. L’homéostasie des ROS repose sur un équilibre entre les systèmes oxydants et antioxydants. Les antioxydants sont bien documentés dans les LAM alors que les connaissances sur l’activité oxydante sont encore limitées. Dans ce travail nous avons choisi d’étudier les sept complexes NADPH oxydases (NOX) dans 25 lignées issues de LAM humaines et des LAM primaires. L’analyse des ARNm et des protéines montre des profils d’expression variables entre les lignées avec une expression plus forte des sous-unités du complexe NOX2 dans les lignées correspondant à des stades de différenciation myéloïde plus avancés. L’activité enzymatique des NOX est cependant équivalente entre les lignées. Deux inhibiteurs, DPI et VAS3947, ont été utilisés pour connaître la contribution des NOX à la production des ROS cellulaires. Alors qu’ils ont inhibé l’activité, ils ont aussi généré un stress oxydatif majeur conduisant à une diminution de la prolifération cellulaire et une forte apoptose, le DPI en augmentant les ROS mitochondriaux et VAS3047 les ROS cytoplasmiques. Afin de connaitre les sous-unités impliquées et de mieux comprendre les mécanismes, les sous-unités NOX2 et p22phox ont été inhibée par ARN interférence. Celle-ci n’ont pas affecté la prolifération mais ont montré des effets compensatoires. Nos data montrent qu’inhiber les NOX pourrait s’avérer une stratégie thérapeutique en augmentant le stress oxydatif dans les cellules leucémiques. / 350,000 leukaemia are diagnosed each year worldwide. In acute myeloid leukaemia (AML), relapse remains a major problem and the oxidative metabolism might play a crucial role in the therapeutic response. Low level of reactive oxygen species (ROS) is associated with properties of leukemic stem cells and quiescence whereas higher level promotes leukoblasts proliferation. ROS homeostasis relies on a tightly regulated balance between the oxidant and antioxidant systems. Although the antioxidant system is extensively studied in AML, the oxidant system remains poorly documented. In this work we aimed to study the seven NADPH oxidases (NOX) complexes in 25 AML human cell lines and primary samples. NOX transcriptional and protein profiles are variable with a higher expression of NOX2 in cell lines belonging to mature differentiation stages. An equivalent level of enzymatic activity was observed across all the cell lines. To reveal the contribution of NOX to global ROS production in the cells, two NOX inhibitors, DPI and VAS3947, were then used. Although both inhibitors efficiently blocked NOX activity they unexpectedly triggered strong oxidative stress leading to reduced cell proliferation and strong apoptosis, DPI by increasing mitochondrial ROS while VAS3947 by increasing cytoplasmic ROS production. To highlight which of the subunits were involved and to understand the mechanisms, NOX2 and p22phox subunits were inhibited using shRNA strategy. These did not affect cell proliferation but revealed a compensation effect. Our data suggest that NOX inhibition might be potential therapeutic strategy by increasing oxidative stress in leukemic cells.

Malgré l'amélioration des traitements, environ 20% des patients atteints de leucémie aigue lymphoblastiques (LAL) rechutent dans la moelle osseuse ou dans des sites extra-médullaires tels que les ovaires et les testicules, ce qui est particulièrement fréquent dans les rechutes tardives de LAL-B présentant un remaniement ETV6/RUNX1. Les travaux réalisés par Virginie Gandemer en 2007, ont montré que l'expression de CD9 permettait de distinguer les leucémies ETV6/RUNX1 des autres types de leucémie. Le gène CD9 code pour une protéine de la famille des tétraspanines dont l'expression a été corrélée avec le risque métastatique et la survie des patients. Par ailleurs il a été démontré que la protéine CD9 était impliquée dans le homing et la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques et leucémiques. Nous avons donc émis l'hypothèse qu'à travers ses propriétés fonctionnelles sur la migration et le homing, CD9 pourrait être un acteur clé des rechutes de LAL-B. Le but de ce travail de thèse était donc premièrement de déterminer le mode de régulation de CD9 dans les LAL-B ETV6/RUNX1 et deuxièmement de déterminer les effets de l'expression de CD9 sur la motilité et la prise de greffe des LAL-B. Les analyses préalablement réalisées au laboratoire avaient suggéré que CD9 pouvait être régulé par des miARNs. Nous avons identifié un cluster de 3 miARNs potentiellement impliqués dans la régulation de CD9 dans les LAL-B ETV6/RUNX1. Ces résultats doivent cependant être complétés par d'autres analyses fonctionnellles afin d'être confirmés. Nous avons étudié le rôle de la protéine CD9 dans la dissémination des cellules de LAL-B. Nous avons démontré que CD9 était un régulateur potentiel de l'adhésion et un nouveau facteur impliqué dans la migration et le homing dépendants de CXCR4 en favorisant l'activation de RAC1 et les réarrangements de l'actine en réponse au CXCL12. Enfin, nous avons décrit pour la première fois l'influence de CD9 sur la migration et le homing dans les testicules via RAC1. Nos résultats montrent donc que CD9 favorise la dissémination des cellules de LAL-B dans les testicules et suggèrent que cette protéine pourrait constituer un acteur majeur des rechutes tardives de LAL-B dont les mécanismes d'apparitions sont peu connus. / Despite improvements in survival rates, approximately 20% of children suffering from acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) present relapses from bone marrow or from B-extramedullary sites, such as the testes or ovaries, particularly in cases of late relapse of ETV6/RUNX1-ALL. Virgine Gandemer showed in 2007, that the expression of CD9, a protein from the tetraspanin superfamily, can be used to distinguish ETV6/RUNX1 lymphoblastic leukemia from other types of ALL. CD9 expression has been correlated with the risk of metastasis and is associated with a poor clinical outcome in various types of cancer. Moreover CD9 has been implicated in hematopoietic and leukemic stem cell homing. We hypothesized, that CD9 protein, through its functional properties on migration and homing, could be a key actor of B-ALL relapses. The purpose of our study was then to investigate, first the transcriptional regulation of CD9 in ETV6/RUNX1 B-ALL and secondly, the effect of CD9 expression on motility and engrafment of B lymphoblasts. The analysis of CD9 transcriptional regulation previously made in the team, suggested that it could be regulated by miRNAs. We identified a cluster of 3 miRNAs potentially implicated in the regulation of CD9 expression in ETV6/RUNX1 B-ALL. This result has to be confirmd by more functional analysis. We investigated the role of CD9 in the dissemination of B-ALL. We identified CD9 as a potential regulator of B-ALL cell adhesion and a new factor involved in CXCR4-mediated migration and homing, through the promotion of actin rearrangement in response to CXCL12. We also characterized the effect of CD9 protein expression on RAC1 activation, which had an impact on blast migration and engraftment. Finally, we described, for the first time, the influence of CD9, mediated by RAC1 signaling, on B-cell chemotactic migration and homing in the testis. Our work provides evidence for an impact of CD9 on the ability of pre-B leukemic cells to disseminate to testes, through its effects on migration and homing, and suggests that CD9 may be a key player in late relapses of B-ALL, which are currently poorly understood.