Le rejet d’allogreffe dépend de la reconnaissance d’antigènes d’histocompatibilité étrangers par le système immunitaire du receveur. En l'absence de thérapies immunosuppressives, la réaction inflammatoire éventuelle conduit à la destruction rapide du tissu transplanté. Le rôle critique joué par les lymphocytes T CD4+ dans le rejet aigu d'allogreffe est bien établi. Cependant, les contributions respectives des lymphocytes CD4+ Th1 et Th2 dans la réaction de rejet sont controversées. Alors que le rôle des cellules Th1 dans la pathogénèse du rejet est bien établi, l'hypothèse que les cellules Th2 favorisent l'acceptation de la greffe est invalide puisque ces cellules sont capables de déclencher des voies alternatives de rejet. En effet, la fonction effectrice des lymphocytes Th2 a été démontrée dans beaucoup de modèles de rejet de greffe ou de tumeur, et dans la maladie du greffon contre l'hôte. Les caractéristiques principales du rejet de type Th2 sont sa dépendance envers la production d'IL-4 et d'IL-5, le recrutement d'éosinophiles au site du rejet, et son inhibition par les lymphocytes T CD8+ alloréactifs. Les éosinophiles activés exercent leur activité cytotoxique par la libération de plusieurs molécules cytotoxiques comme l’EDN, l’ECP, la MBP et l’EPO. Ces molécules sont probablement responsables de la capacité des éosinophies à affecter la perméabilité vasculaire et à induire des dégâts tissulaires dans les organes rejetés. L'interleukine 9 (IL-9) est une cytokine produite par les lymphocytes T qui joue un rôle important dans les voies effectrices Th2. Dans la littérature, l’IL-9 est fortement associée au développement de l’éosinophilie tissulaire. Dans notre première étude, nous avons analysé le rôle joué par l'IL-9 dans le rejet d'allogreffe bm12 par des souris B6 (pour C57BL/6), un modèle dans le lequel une simple disparité au niveau de la molécule du CMH de classe II favorise une réaction inflammatoire de type Th2. Dans ce modèle, de faible alloantigénicité, les greffes cardiaques bm12 survivent presque indéfiniment dans les receveurs B6 (>60 jours). Nos expériences ont été conçues afin de savoir si l’expression de l’IL-9 au niveau de la greffe pouvait modifier la survie de greffes cardiaques exprimant les alloantigènes bm12. Nous avons ainsi montré que la production locale d’IL-9 induit le rejet des allogreffes cardiaques exprimant l’alloantigène I-Abm12 (survie <30jours). Aucun des organes transgéniques pour l’IL-9 n’a survécu plus de 30 jours alors que des greffes non transgéniques ne furent pas rejetées (>50 jours). L’analyse histologique des allogreffes cardiaques transgéniques pour l’IL-9 montre une infiltration cellulaire dense du myocarde. La composante principale de cet infiltrat est la présence de nombreux éosinophiles. Pour étudier la contribution des cytokines de type Th2, comme l’IL-4 et l’IL-5, dans le rejet des cœurs transgéniques pour l’IL-9, nous avons sélectivement bloqué ces cytokines lors du processus de rejet. Le traitement avec des anticorps neutralisant l’IL-4 bloque complètement le rejet induit par l’IL-9 et permet la survie à long terme des allogreffes cardiaques. Au point de vue de l’histologie ces greffes ne montrent ni infiltration leucocytaire ni artériopathie. Afin de déterminer si l’infiltration éosinophilique induite par l’IL-9 provient de l’activité directe de l’IL-9 ou est le résultat de la sécrétion d’IL-5, un traitement avec un anticorps anti-IL-5 a été appliqué aux receveurs d'allogreffe cardiaque. Ce traitement augmente la survie de la majorité des allogreffes et modifie de manière marquée la composition de l’infiltrat cellulaire en prévenant le recrutement des éosinophiles. De manière intéressante, les cœurs transgéniques pour l’IL-9 qui survivent indéfiniment après le traitement anti-IL-5 arborent une importante fibrose. A la différence du cœur bm12, la peau bm12 greffée sur un receveur B6 subit un rejet rapide et l'histologie des greffes rejetées révèle la présence d'infiltrats denses à éosinophiles. Notre laboratoire a montré que ce processus de rejet est dirigé par les lymphocytes T CD4+ alloréactifs et que les souris B6 déficientes pour l'IL-5 et la voie de cytotoxicité Fas/Fas-L sont incapables de rejeter des peaux bm12. Nos premiers résultats laissaient supposer un rôle pour l'IL-9 dans notre modèle de rejet de greffes en disparité des molécules du CMH de classe II: premièrement, nous avions observé la production d'IL-9 par les lymphocytes T de type Th2 alloréactifs et deuxièmement, l'ARNm d'IL-9 était fortement exprimé au niveau des allogreffes de peaux rejetées. C’est pourquoi, la survie de peaux bm12, déficientes pour la molécule Fas, greffées sur des receveurs B6 déficients pour l'IL-9 (B6.IL-9-/-) a été comparée avec celle de peaux transplantées sur des receveurs B6. Nous avons montré que, comme les souris B6 normales, les animaux B6.IL-9-/- rejettent leur greffe dans les 15 jours. Donc, contrairement à l'IL-5, l'IL-9 n'est pas essentielle pour le rejet de peau dirigé par les cellules T CD4+ de type Th2 dans notre modèle de disparité des molécules du CMH de classe II. Néanmoins, les allogreffes de peaux, dans notre modèle de disparité des molécules du CMH de classe II, contiennent moins d’éosinophiles lorsqu’elles sont rejetées par des receveurs déficients pour la synthèse d’IL-9 (IL-9-/-). En plus du modèle bm12, nous avons également observé un rôle de l’IL-9 dans un autre modèle de rejet Th2. Il a été montré par notre laboratoire que le rejet d’allogreffes cardiaques Balb/c complètement incompatibles par des souris receveuses B6.CD8-/- est caractérisé par le recrutement d’éosinophiles dans l’organe rejeté (106). Dans celui-ci, l’ARNm de l’IL-9 est présent pendant le rejet, de même que l’IL-4 et l’IL-5 et les greffes rejetées par des receveurs IL-9-/- contiennent moins d’éosinophiles par rapport à des receveurs contrôles. Les mécanismes par lesquels l’IL-9 induit le recrutement des éosinophiles ne sont pas complètement connus. L’IL-5 est considérée comme la cytokine clé pour le développement de l’éosinophilie. De plus, le rejet aigu des cœurs transgéniques pour l’IL-9 est caractérisé par une infiltration massive d'éosinophiles et est inhibé lors de la neutralisation de l'IL-5. Nous avons entrepris la seconde étude pour investiguer le lien fonctionnel entre l’IL-9 et l’IL-5 dans le rejet d’allogreffe, ce qui permettra de mieux comprendre le recrutement des éosinophiles par l’IL-9. Bien que le rejet ne soit pas inhibé par le manque d’IL-9, les allogreffes rejetées par les souris déficientes en IL-9 contiennent moins d’éosinophiles par rapport à des souris contrôles et présentent une production plus faible d’IL-5 par les cellules T alloréactives. De manière intéressante, la production optimale d’IL-5 après une stimulation allogénique requiert un récepteur à l’IL-9 (IL-9R) fonctionnel sur les cellules répondeuses. De plus, l’infiltration d’éosinophiles induite par l’IL-9 est absente dans des peaux transplantées sur des receveurs déficients pour le récepteur de l’IL-9. Finalement, la production d’IL-5 par des cellules T CD4+ stimulées par l’anti-CD3 est abolie par la neutralisation de l’IL-9. En conclusion, nous pouvons dire que l'IL-9 est capable d'induire un rejet de type Th2, caractérisé par une forte infiltration d’éosinophiles et une dépendance à l'IL-5 et à l'IL-4. Notre étude montre également que l’IL-9 peut agir directement sur les cellules T CD4+ pour induire leur capacité à sécréter de l’IL-5. Cependant, l’IL-9 n’est pas indispensable au processus de rejet Th2 et il est probable que lorsque l’IL-9 est bloquée d'autres cytokines soient capables de compenser son absence. Notre étude permet une meilleure compréhension des voies complexes du recrutement des éosinophiles.

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) reste la complication majeure de l’allogreffe de cellules soucheshématopoïétiques (allo-CSH). La GVHD résulte de l’activation de la réponse immunitaire et de la reconnaissanced’alloantigènes par les lymphocytes T (LT) du donneur, entrainant ainsi des lésions tissulaires principalement auniveau de la peau, des intestins et du foie. L’interleukine-22 (IL-22) est une cytokine sécrétée par les LT Th1,Th17 et les cellules de l’immunité innée (ILC). Compte tenu des propriétés de l’IL-22 dans les tissus cibles de laGVHD, nous avons évalué sa contribution dans la physiopathologie de la maladie à l’aide de modèlesexpérimentaux murins. Il apparaît que les souris qui reçoivent des lymphocytes T invalidés pour l’IL-22développent une maladie moins sévère, et leur mortalité est diminuée. L’IL-22 issue du greffon participe donc à lasévérité de la GVHD en favorisant l’inflammation systémique, mais aussi locale au niveau des organes cibles. Deplus, dans les intestins, l’IL-22 agit en synergie avec les interférons de type I pour amplifier l’inflammation de typeTh1 au cours de la GVHD. Chez l’homme, la GVHD est associée à une modification du microbiote intestinal.Nous avons montré que l’absence d’IL-22 semble favoriser la colonisation de lactobacilles au détriment declostridiums, ce qui pourrait également participer à la diminution de la GVHD intestinale. Enfin, nous avonsmontré que l’effet anti-tumoral est préservé malgré l’absence d’IL-22. Ces résultats permettent donc d’envisagerde nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la GVHD. / Graft-versus-host disease (GVHD) is still the major complication after allogeneic stem cell transplantation. GVHDresults from the activation of the immune response and the recognition by donor T cells of alloantigens leading totissue injury, especially in skin, gut and liver. Interleukin-22 (IL-22) is a cytokine secreted by CD4+ T cells Th1 andTh17 but also by innate lymphoid cells (ILC). Given that IL-22 functions in the GVHD target tissues, weinvestigated its contribution in GVHD physiopathology using mouse experimental models. We showed that IL-22deficiency in donor cells reduced the severity of GVHD by limiting systemic and local inflammation. Moreover, inthe large intestine, IL-22 acts in synergy with type I interferon to increase Th1-like inflammation. In humans,GVHD severity is associated with microbiotal modification in the intestine. We demonstrated that IL-22 deficiencyin donor cells seems to favor lactobacillus colonization instead of clostridium. These changes of microbiotacomposition may reduce the severity of intestinal GVHD. Finally, we showed that the antitumor effect is preservedeven in absence of IL-22 donor cells. Overall, our data support the design of new clinical approaches aiming totarget IL-22 pathways in GVHD patients.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les mutations du gène codant pour la protéine XIAP (X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein) sont à l’origine du syndrome lymphoprolifératif lié à l’X de type 2 (XLP-2). Il s’agit d’un déficit immunitaire rare caractérisé par une susceptibilité anormale à l’infection par le virus d’Epstein Barr (EBV). De plus, certains patients déficients en XIAP peuvent souffrir d’une pathologie intestinale parfois sévère. XIAP est molécule anti-apoptique qui a aussi été impliquée dans la signalisation et les fonctions de récepteurs de l’immunité innée, les récepteurs NOD1 et NOD2. Mon travail de thèse a eu pour objectif de caractériser cette pathologie intestinale et ses mécanismes physiopathologiques. Pour cela, nous avons étudié une cohorte de patients déficients en XIAP présentant une pathologie inflammatoire intestinale. Nous avons également recherché des mutations de XIAP dans une cohorte d’enfants ayant présenté comme unique signe clinique une pathologie intestinale précoce. Sur 83 patients testés, 3 patients porteurs de mutations de XIAP ont été identifiés. Nous avons ensuite montré que cette pathologie intestinale est très proche sur les plans clinique et histologique de la maladie de Crohn, qui est une des principales affections inflammatoires de l’intestin chez l’adulte. La maladie de Crohn est associée à des facteurs environnementaux et une susceptibilité génétique, dont les polymorphismes dans le gène NOD2 qui représentent le facteur plus important identifié à ce jour. Nous avons ensuite montré que les monocytes des patients déficients en XIAP ont un défaut de production d’IL-8, de MCP-1 et d’IL-10 en réponse à la stimulation de la voie NOD2. Par contre, nous n’avons pas mis en évidence d’excès d’apoptose des cellules épithéliales digestives chez les patients. En revanche, ils présentaient un nombre diminué de leur lymphocytes T innés circulants, Enfin, au cours de cette étude, nous avons identifié pour la première fois des femmes vectrices d’une mutation de XIAP à l’état hétérozygote, ayant développé des manifestations inflammatoires intestinales. Chez ces patientes, l’inactivation du chromosome X, qui normalement est biaisée en faveur de l’allèle sain chez les vectrices asymptomatiques, est de façon inhabituelle biaisée vers l’allèle muté contribuant à une diminution de l’expression de XIAP dans les monocytes et une altération de la voie NOD2. Ce travail a permis de montrer que le déficit en XIAP est responsable d’une forme monogénique de la maladie de Crohn. Nos résultats suggèrent que le défaut d’activation des monocytes par NOD2 est un mécanisme important de la pathogénèse de la maladie. Sur le plan thérapeutique, la greffe de moelle osseuse semble indiquée dans les formes sévères, puisque le principal défaut identifié est une anomalie du compartiment hématopoïétique, et chez deux de nos patients, elle a permis en effet une amélioration franche de la pathologie digestive qui était très sévère. / Mutations in the gene encoding for XIAP (X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein) are causing the X-linked lymphoproliferative syndrome type 2 (XLP-2). It is a rare immunodeficiency characterized by an abnormal susceptibility to infection with Epstein Barr virus (EBV). In addition, some XIAP-deficient patients may suffer from an intestinal disease that can be severe. XIAP is an anti-apoptotic molecule which has also been involved in the signaling and the functions of receptors of the innate immunity, NOD1 and NOD2. My thesis work aimed to characterize this intestinal pathology and its pathophysiology. For this, we studied a cohort of known XIAP-deficient patients with inflammatory bowel disease. We also looked for mutations of XIAP in a cohort of children who presented as the only clinical sign an early intestinal pathology. In 83 patients tested, three were identified as carrier of a XIAP mutation. We then showed that this intestinal pathology is clinically and histologically very close to Crohn’s disease, which is a major inflammatory bowel disease in adults. Crohn's disease is associated with environmental factors and genetic susceptibility, including polymorphisms in the NOD2 gene that represent the most important factor identified to date. We then showed that the monocytes from XIAP-deficient patients have a defect in production of IL-8, MCP-1 and IL-10 in response to stimulation of the NOD2 pathway. However, we did not reveal any excess of apoptosis in intestinal epithelial cells from XIAP-deficient patients. On the other hand, they showed a decreased number of their circulating innate T cells. Finally, during this study, we identified for the first time, female carriers of a mutation of XIAP in the heterozygous state, who developed intestinal inflammatory manifestations. In these patients, the inactivation of the X chromosome, which is normally biased toward the healthy allele in asymptomatic vectors, is biased to the unusually mutated allele contributing to a decrease of the expression of XIAP in monocytes and an alteration of the NOD2 pathway. This work showed that XIAP deficiency is responsible for a monogenic form of Crohn's disease. Our results suggest that the lack of monocyte activation by NOD2 is an important mechanism in the pathogenesis of the disease. Therapeutically, the bone marrow transplant seems indicated in severe cases, since the main identified defect is an abnormality of the hematopoietic compartment and in two of our patients, it allowed a clear improvement of the digestive pathology that was very severe.

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques limitant le succès de ce traitement.La GVHD aiguë est liée à la reconnaissance et la destruction par les lymphocytes Talloréactifs du donneur des tissus cibles du receveur (peau, tube digestif et foie), aprèsactivation par les cellules dendritiques du receveur. Si le rôle des lymphocytes Th17dans la GVHD aiguë a été mis en évidence dans des modèles murins, leur rôle chezl’homme est moins clair. Nous avons exploré la présence des lymphocytes Th17 dansla muqueuse digestive de 23 patients et dans la peau de 38 patients lors du diagnosticde GVHD aiguë, au moyen de 2 marqueurs des Th17, CCR6 et CD161 et du facteurde transcription des Th17, RORγt. Il existe une augmentation significative descellules CCR6+, CD161+ et RORγt+ dans la muqueuse digestive et la peau des patientsavec une GVHD aiguë. De plus, comme il a été rapporté que les cellules dendritiquesplasmocytoïdes (PDC) favorisent la différenciation des lymphocytes Th17, nousavons voulu quantifier chez ces patients les PDC au moyen des 2 marqueurs, CD123et BDCA2. Il existe une augmentation des PDC dans la muqueuse digestive et la peaudes patients avec une GVHD aiguë. De plus la forte expression de la protéine induitepar l’IFN de type I Mx1 dans la peau des patients avec une GVHD aiguë suggère queles PDC sont fonctionnelles et produisent de l’IFN de type I. L’ensemble de cesrésultats suggère l’existence d’une réponse médiée par les lymphocytes Th17 dans laGVHD aiguë digestive et cutanée ainsi qu’un nouveau lien physiopathologique entreles PDC et les lymphocytes Th17. / Acute graft-versus-host disease (GVHD) remains a major complication followingallogeneic stem cell transplantation (allo-SCT) limiting the success of the therapy.GVHD is the result of alloreactive donor T cells attacking host tissues: the skin, gutand liver after activation by the recipient dendritic cells. The contribution of Th17cells in acute GVHD has been demonstrated in mouse models. However theircontribution in human acute GVHD remains unclear. We evaluated the presence ofTh17 cells in the intestinal mucosa of 23 patients and the skin of 35 patients atdiagnosis of acute GVHD using CCR6 and CD161, 2 markers of Th17 cells, andRORγt the key transcription factor of Th17 cells. CCR6+, CD161+ and RORγt+ cellswere significantly increased in the intestinal mucosa and the skin of patients withacute GVHD. Since plasmacytoid dendritic cells (PDC) have been reported to drivethe differentiation of the Th17 subset, we quantified PDC using 2 markers CD123 andBDCA. PDC were significantly increased in the intestinal mucosa and the skin ofpatients with acute GVHD. Moreover, we observed a strong expression of the type IIFN-inducible protein Mx1 in the skin of patients with acute GVHD, suggesting thatPDC produce type I IFN. Overall this study provides evidence for a Th17-mediatedresponse and a potential pathophysiological link between PDC and Th17 in humanacute GVHD.

La physiopathologie de la GVHa implique de nombreux mécanismes aboutissant à ces lésions tissulaires responsables d'une comorbidité majeure en allo-CSH. L'objectif principal de notre étude a été d'identifier des marqueurs précoces de GVHa et d'explorer leurs rôles dans la physiopathologie de ce phénomène. Quarante-deux cytokines ou chémokines, ont été étudiés à J0 dans le sérum de 109 patients allogreffés avec un conditionnement d'intensité réduite. Nous avons complété ce travail par une étude cinétique à différents temps de l'allo-CSH et une étude histologique de biopsies coliques de patients atteints de GVHa. A J0 de l'allo-CSH, seule la mesure de CX3CL1 J0 était significativement plus élevée chez les patients développant par la suite une GVHa en comparaison aux patients indemnes de GVHa (P=0 ,04). Cette observation persistait à J30 et J50 post allo-CSH mais pas à J100 (P=0,02, P=0,03 et P=0,12, respectivement). L'étude des dosages sériques avant le conditionnement (J-30) ne retrouvait pas de différence significative entre ces 2 groupes. L'analyse phénotypique des différents types cellulaires a mis en évidence une augmentation signification de la proportion de lymphocytes CD8+CX3CR1+ chez les patients présentant une GVHa (P=0,01). L'analyse histologique de biopsies coliques (n=12) montrait une nette augmentation de l'expression de CX3CL1 au niveau des cellules épithéliales de la muqueuse intestinale en cas de GVHa ainsi que la présence de cellules mononuclées CX3CR1+ aux contacts de ces cellules épithéliales. Les résultats de cette étude suggèrent fortement l'implication de CX3CL1 et de son récepteur CX3CR1 dans la physiopathologie de la GVHa. / This study investigated the role of cytokines and chemokines in acute graft-versus host disease (aGVHD) incidence and severity in 109 patients who underwent reduced-intensity conditioning allogeneic stem cell transplantation (HSCT). Among the 42 cytokines tested at day 0, only CX3CL1 levels at day 0 was significantly associated with grades II to IV aGVHD development (P=0.04). Increased levels of CX3CL1 at day 30 and day 50 post-HSCT were also significantly associated with aGVHD (P=0.02 and P=0.03, respectively). No such association was found before conditioning regimen or at day 100 post-HSCT. Because the receptor for CX3CL1 is CX3CR1, the number of CX3CR1+ cells was determined by flow cytometry. The CX3CR1+CD8+T cell proportion was significantly higher in patients with aGVHD than those without aGVHD (P=0.01). To investigate the distribution of the CX3CL1/CX3CR1 axis in the anatomic sites of aGVHD, CX3CL1 and CX3CR1 levels were studied using an in situ immunohistochemical analysis on gastro-intestinal biospsies of patients with intestinal aGVHD. CX3CL1 expression was significantly increased in the epithelial cells and mononuclear cells of the lamina propria. CX3CR1+ cells mononuclear cells were identified in close contact with epithelial cells. These findings strongly suggest the implication of the CX3CL1/CX3CR1 axis in the pathogenesis of aGVHD.

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) reste la complication majeure de l’allogreffe de cellules soucheshématopoïétiques (allo-CSH). La GVHD résulte de l’activation de la réponse immunitaire et de la reconnaissanced’alloantigènes par les lymphocytes T (LT) du donneur, entrainant ainsi des lésions tissulaires principalement auniveau de la peau, des intestins et du foie. L’interleukine-22 (IL-22) est une cytokine sécrétée par les LT Th1,Th17 et les cellules de l’immunité innée (ILC). Compte tenu des propriétés de l’IL-22 dans les tissus cibles de laGVHD, nous avons évalué sa contribution dans la physiopathologie de la maladie à l’aide de modèlesexpérimentaux murins. Il apparaît que les souris qui reçoivent des lymphocytes T invalidés pour l’IL-22développent une maladie moins sévère, et leur mortalité est diminuée. L’IL-22 issue du greffon participe donc à lasévérité de la GVHD en favorisant l’inflammation systémique, mais aussi locale au niveau des organes cibles. Deplus, dans les intestins, l’IL-22 agit en synergie avec les interférons de type I pour amplifier l’inflammation de typeTh1 au cours de la GVHD. Chez l’homme, la GVHD est associée à une modification du microbiote intestinal.Nous avons montré que l’absence d’IL-22 semble favoriser la colonisation de lactobacilles au détriment declostridiums, ce qui pourrait également participer à la diminution de la GVHD intestinale. Enfin, nous avonsmontré que l’effet anti-tumoral est préservé malgré l’absence d’IL-22. Ces résultats permettent donc d’envisagerde nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la GVHD. / Graft-versus-host disease (GVHD) is still the major complication after allogeneic stem cell transplantation. GVHDresults from the activation of the immune response and the recognition by donor T cells of alloantigens leading totissue injury, especially in skin, gut and liver. Interleukin-22 (IL-22) is a cytokine secreted by CD4+ T cells Th1 andTh17 but also by innate lymphoid cells (ILC). Given that IL-22 functions in the GVHD target tissues, weinvestigated its contribution in GVHD physiopathology using mouse experimental models. We showed that IL-22deficiency in donor cells reduced the severity of GVHD by limiting systemic and local inflammation. Moreover, inthe large intestine, IL-22 acts in synergy with type I interferon to increase Th1-like inflammation. In humans,GVHD severity is associated with microbiotal modification in the intestine. We demonstrated that IL-22 deficiencyin donor cells seems to favor lactobacillus colonization instead of clostridium. These changes of microbiotacomposition may reduce the severity of intestinal GVHD. Finally, we showed that the antitumor effect is preservedeven in absence of IL-22 donor cells. Overall, our data support the design of new clinical approaches aiming totarget IL-22 pathways in GVHD patients.

Ce travail a pour objet de déterminer les conditions optimales de production de substituts allogéniques capables de combler les lésions cartilagineuses dans le cadre du traitement de l’arthrose. Il s’oriente particulièrement sur la composante cellulaire de ces substituts. L’usage de cellules souches mésenchymateuses issues de cordons ombilicaux (CSM-GW) implique de déterminer quels facteurs obstétricaux, liés à l’environnement direct et indirect des CSM-GW, peuvent influencer leur prolifération ainsi que leur différenciation chondrocytaire. Dans une première partie de ce travail, trois types de facteurs ont été étudiés : les facteurs liés à l’enfant donneur, au déroulement de l’accouchement et de la délivrance, à la grossesse et à la mère. Nos données montrent que les CSM-GW ont des capacités prolifératives améliorées lorsque l’accouchement s’est déroulé à terme et sans complication, avec utilisation de Syntocinon® pendant le travail. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé les CSM-GW les plus efficaces dans le cadre de l’ingénierie du cartilage. Il a ensuite été essentiel d’élucider le profil d’action des CSM-GW dans un contexte allogénique. Le deuxième temps de ce travail a donc consisté à chercher le profil de stimulation le plus performant, au regard de la viabilité des cellules et de l’évolution de la sécrétion des facteurs solubles responsables des propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la différenciation chondrocytaire. Nous avons alors mimé, in vitro et en biomatériaux d’Alginate/Acide hyaluronique (Alg/HA) une telle situation en stimulant les CSM-GW avec différentes doses d’IFN-γ et de TNF-α. Selon nos résultats, la stimulation par IFN-γ et TNF-α sur les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA est plus efficace lorsque ces deux cytokines sont utilisées conjointement et n’est pas délétère pour la viabilité cellulaire aux concentrations respectives de 20 et 30 ng/mL. Cette double stimulation induit une augmentation de la sécrétion d’IL-6 et de PGE-2 par les CSM-GW, ne modifie pas leur sécrétion de TGF-β, et diminue la sécrétion de VEGF. Nous avons confirmé ces données lors d’une mise en situation fonctionnelle : des cocultures avec des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains nous ont permis d’évaluer la réponse des CSM-GW lors d’une situation allogénique. Ces mises en situations allogéniques ont été étudiées à différents temps afin d’évaluer les propriétés immunologiques des CSM-GW au cours du temps passé en biomatériaux. Nos résultats montrent que les CSM-GW peuvent exprimer des molécules HLA-G ainsi qu’IDO, mais ces expressions sont limitées en biomatériaux d’Alg//HA. Les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA en situation allogénique ne sont pas immunogènes, quel que soit le temps de différenciation. En revanche, leurs capacités immunomodulatrices décroissent au cours du temps et sont plus fortes à J0 et J3 de la différenciation chondrocytaire, ce qui oriente vers une utilisation précoce de ces cellules. Les conclusions de ce travail permettent de (i) sélectionner les cordons idoines à l’ingénierie cellulaire et l’ingénierie du cartilage, (ii) définir les conditions permettant de mimer une situation allogénique in vitro, (iii) connaitre les propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la culture en biomatériaux d’Alg/HA, y compris en situation allogénique / The purpose of this work is to determine the optimal conditions for allogeneic substitutes production, adapted to filling the cartilaginous lesions in osteoarthritis treatment. It focuses on the cellular component of these substitutes. The use of mesenchymal stem cells from umbilical cords (WJ-MSC) involves determining which factors, related to direct and indirect environment of the WJ-MSC, can influence their proliferation and chondrogenic differentiation. In a first part of our work, three types of factors were studied: related to the donor child, the course of labor and delivery, pregnancy and the mother. Our results show that WJ-MSC have enhanced proliferative capacities when coming from full-term birth and without complications, with the use of Syntocinon® during labor. On this basis, we used the most effective WJ-MSC for cartilage engineering. It was then essential to elucidate their action profile in allogeneic context. We stimulated WJ-MSC embedded in Alginate/Hyaluronic Acid (Alg/HA) scaffolds with different concentrations of IFN-γ and TNF-α in order to determine the most effective stimulation profile, with regard to viability of the cells and evolution of immunomodulatory soluble factors secretion. According to our results, the stimulation by IFN-γ and TNF-α on WJ-MSC in Alg/HA scaffolds is more effective when these two cytokines are used together and is not deleterious for cell viability at the concentrations of 20 and 30 ng/mL, respectively. This double stimulation induces an increase in the secretion of IL-6 and PGE-2 by the WJ-MSC, a decrease in the secretion of VEGF and does not modify the secretion of TGF-β. We confirmed these data during a functional study: cocultures with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors allowed us to evaluate the response of WJ-MSC in an allogeneic situation. These allogeneic situations have been studied at different times to evaluate the immunological properties of WJ-MSC during the time of chondrogenic differentiation. Our results show that WJ-MSC can express HLA-G molecules as well as IDO, but these expressions are limited in Alg/HA biomaterials. Finally, the WJ-MSC in Alg/HA biomaterials in allogeneic conditions are not immunogenic, regardless of the time of differentiation. On the other hand, their immunomodulatory capacities decrease over time and are stronger at day 0 and day 3 of chondrogenic differentiation, which leads to an early use of these cells. Finally, this work allows us to (i) select the umbilical cords suitable for cellular and cartilage engineering, (ii) define the conditions mimicking in vitro an allogeneic situation, (iii) elucidate the immunomodulatory properties of WJ-MSC during Alg/HA biomaterials chondrogenic differentiation, including allogeneic situations

Ce travail s’efforce d’élaborer une philosophie clinique des greffes, particulièrement des greffes de mains et de visage ; c’est-à-dire une philosophie qui repart toujours de l’expérience du soin et des patients. L’histoire de la constitution des greffes comme soin efficace, du début du vingtième siècle aux années 1960, y est examinée : elle permet de percevoir les obstacles inattendus qu’il a fallu apprendre à surmonter, et combien ces procédures reposent sur des conditions précises et contraignantes. Cette épistémologie critique permet ensuite d’aborder les questions éthiques soulevées par les greffes de tissus composites. Celles-ci ont suscité d’importants débats, auxquels la clinique a en partie apporté des réponses. Mais des questions éthiques subsistent, qui sont abordées en décrivant les conditions délicates du choix de la procédure et en interrogeant les normes qui légitiment de recourir à ce soin risqué pour le traitement de handicaps graves. / This work aims at building a clinical philosophy of transplantations, especially in regards to hand and face allografts; this means a philosophy rooted in the experience of care and that of the patients. The history of the establishment of transplantation as an efficient procedure, from the beginning of the twentieth century to the 1960s, is examined: it helps understand the unexpected challenges that had to be met, and how these procedures are subject to precise and restrictive conditions. This critical epistemology then allows to approach the ethical questions raised by composite tissue allografts. These procedures have given birth to intense debate, to which the clinic has already partially brought answers. But other ethical problems remain, which are considered by describing the delicate conditions for choosing the procedure and by interrogating the norms legitimating this risky procedure as a cure for severe handicaps.

L'objectif de notre projet de recherche est l'exploration de la faisabilité de l'allogreffe des tissus composites (ATC) chez les nouveau-nés ayant des anomalies congénitales sévères de la main ou du visage. Dans la partie bibliographique, nous avons étudié les mécanismes de tolérance néonatale chez la souris, ainsi que la transplantation in utero des cellules souches hématopoïétiques avec des modèles animaux et humains. Ensuite, les propriétés du système immunitaire du nouveau-né humain ont été décrites avec étude des différents protocoles de conditionnement non-myéloablatifs utilisés pour induire une tolérance aux greffes d'organes solides, afin de trouver le type de conditionnement utilisable chez les nouveaux nés pour l'induction de tolérance. La greffe du thymus et de la moelle osseuse vascularisée avec l'ATC ont été également étudiés. Enfin, une revue exhaustive des différentes études d'ATC concernant l'induction de tolérance chez les humains et les larges animaux a été faite. Un premier modèle préclinique expérimental d'ATC a été élaboré chez le porcelet nouveau-né. Des études ultérieures ont par suite étudié les agents immunosuppresseurs ainsi que le régime de conditionnement avec l'administration de cyclosporine A., des thymo-globulines de lapin anti-porc et du mycophénolate mofétil. Un protocole d'induction de tolérance pour l'ATC chez les porcelets nouveau-nés a été rédigé et l'expérimentation sera réalisée courant 2014-2015. Si la tolérance d'ATC spécifique du donneur pourra être induite avec notre protocole, nous allons par la suite élaborer un protocole d'induction de tolérance et un programme d'allogreffe de main applicable chez les nouveau-nés humains / This present research is devoted to the exploration of performing vascularized composite allografts as a treatment for severe congenital hand or face anomalies in neonates or very young infants. The bibliographic studies at first revised the discovery and mechanisms of neonatal tolerance in mice, as well as in utero hematopoietic stem cells transplantation in large-animal models and human fetuses. Then the properties of human neonatal immune system were described; and the non-myeloablative or non-toxic conditioning regimens for solid organ transplant tolerance induction were also studied, in order to give the clue to a applicable conditioning regimen for tolerance induction in neonates. The potent thymus and vascularized bone marrow transplantation in neonatal VCA were considered as advantages. Finally, the researches concerning tolerance induction for VCA in large animal models and in human patients were reviewed. ln experimental studies, the preclinical VCA was firstly established in neonatal swines. Subsequent experiments thus studied the immunosuppressive agents, as well as conditioning regimen, including the administration of cyclosporine A, rabbit anti-pig thymocyte globulin and mycophenolate mofetil for VCA in pig neonates. The findings in these experiments were then concluded. Based on these finding, a general tolerance induction protocol for VCA in neonatal swines was designed and experiment will be performed in year 2014-2015. lf donor-specific tolerance for VCA could be induced with present protocol, we will subsequently elaborate an applicable tolerance induction protocol and hand allotransplantation program in human newborn infants