Véritable immunothérapie adoptive, l’allogreffe de Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) est destinée à prévenir la rechute d’une hémopathie maligne grâce au combat immunologique du greffon contre la maladie (effet GVL, Graft Versus Leukemia), dans lequel les lymphocytes T apportés par le greffon sont déterminants. Ils peuvent aussi compromettre le résultat escompté, en induisant une réaction du greffon contre l'hôte (GVH, Graft Versus Host) qui reste une complication redoutée de l’allogreffe. Dans une précédente étude prospective portant sur 62 couples donneur/receveur nous avons pu étudier l'impact de la composition du greffon en cellules T de phénotypes naïfs et mémoires sur le devenir des receveurs d’allogreffes à partir d'un donneur HLA-identique apparenté ou non; et nous avons pu démontrer qu’une proportion élevée de lymphocytes T CD4+CCR7+ dans le greffon était un facteur de risque de la survenue, la précocité et la sévérité de la GVH aiguë, sans influence sur la GVH chronique ou la rechute. Dans le but de séparer l’effet GVL de la GVH, nous avons voulu à travers des travaux de cette thèse, étudier le concept d’une T déplétion partielle et sélective du greffon en lymphocytes T CD4+CCR7+. Nous travaux se sont scindés en trois parties :1) Au plan clinique, nous avons pu confirmer nos précédents résultats sur une cohorte additionnelle de 137 patients. Non seulement, nous avons confirmé qu’une proportion élevée de lymphocytes T CD4+CCR7+ dans le greffon était un facteur de risque de la survenue, de la GVH aiguë, mais également, nous avons observé un effet préférentielle de la sous-population naïve des lymphocytes T CD4+ sur l’incidence de la GVH aiguë. Bien entendu, aucun impact sur l’incidence de la rechute post-allogreffe n’a été enregistré.2) Dans un modèle expérimental utilisant des cultures lymphocytaires en présence des cellules dendritiques provenant des six couples (frère/sœur) HLA-identiques, nous avons pu démontrer que les lymphocytes T CD4+ naïfs déclenchaient la réponse allogénique la plus importante et avec un degré moindre les cellules mémoires centrales par rapport aux effecteurs mémoires T CD4+. Ces résultats non seulement, valident in vitro les constatations cliniques mais aussi mettent l’accent sur le rôle prépondérant des lymphocytes T naïfs dans l’alloréactivité, notamment en situation de compatibilité HLA.3) Nous avons dans la troisième partie pu démontrer qu’une déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+ n’altère pas la réponse immunologique secondaires vis-à-vis des virus.La suite de nos travaux se focalise sur l’effet de la déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+ sur la réaction anti-tumorale du greffon dans la situation HLA compatibilité chez l’homme.Nos résultats constituent une pierre angulaire dans le concept de déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+, ex vivo chez l’homme, en vue de réduire l’incidence de la GVHD sans altérer la réponse anti-infectieuse ou tumorale du greffon notamment chez les donneurs présentant un taux élevé de lymphocytes T CD4+ naïfs et/ou mémoire centrale . / A genuine adoptive immunotherapy, Haematopoietic Stem Cell (HSC) allotransplantation aims to prevent the recurrence of a malignant blood disease via an immunological action of the graft against disease (GVL or Graft Versus Leukaemia effect), in which the T lymphocytes supplied by the transplant play a key role. They may also compromise the targeted result, by triggering a GVH (Graft Versus Host) reaction, which remains a serious complication of allotransplantation. In a previous prospective study conducted in 62 donor/recipient pairings, we examined the impact of the transplant\\\'s naive and memory phenotype T cell composition on the fate of recipients of allotransplants from an HLA-identical donor, related to the recipient or otherwise. We demonstrated that a high proportion of CD4+CCR7+ T lymphocytes in the transplant was a risk factor for the development, early onset and severity of acute GVHD, with no influence on chronic GVHD or recurrence. With the objective of separating the GVL effect from the GVH effect, we wanted to investigate the concept of partial and selective CD4+CCR7+ T cell depletion of the graft in the studies conducted as part of this research. Our studies were split into three parts:1) Clinically, we confirmed our previous results in an additional cohort of 137 patients. In addition to confirming that a high proportion of CD4+CCR7+ T lymphocytes in the transplant was a risk factor for the development of acute GVH, we also observed a preferential effect of the naive CD4+T lymphocyte sub-population on the incidence of acute GVHD. Obviously, no impact on the incidence of post-allotransplantation recurrence was recorded.2) In an experimental model using lymphocyte cultures in the presence of dendritic cells taken from six HLA-identical pairings (brother/sister), we demonstrated that naive CD4+ T lymphocytes triggered the greatest allogenic response and, to a lesser degree, central memory cells compared to effector memory CD4+ T cells. Not only do these results validate the clinical observations made in vitro, they also highlight the dominant role of naive T lymphocytes in alloreactivity, particularly in situations of HLA incompatibility.3) In the third part, we demonstrated that selective partial CD4+CCR7+ T cell depletion of the transplants does not impair the secondary immunological response to viruses.The next phase of our research focuses on the effect of selective partial CD4+CCR7+ T cell depletion of grafts on the transplant's anti-tumoural reaction in situations of HLA compatibility in humans.Our results represent a cornerstone in the concept of partial selective T CD4+CCR7+ T cell depletion of transplants, ex vivo in humans, with a view to reducing the incidence of GVHD, without impairing the anti-infectious or anti-tumoural response of the graft, particularly in donors with high levels of naive and/or central memory CD4+ T lymphocytes.

Les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont des cellules capables de moduler la réponse immunitaire allogénique dans les deux sens. En effet, il a d'abord été démontré dans des modèles expérimentaux de maladie du greffon contre l'hôte (GVHD) chez la souris que l’élimination des Treg pouvait accentuer la GVHD, alors qu’une thérapie cellulaire à base de Treg peut la contrôler. Ces modèles pré-cliniques ont conduit au développement d'essais cliniques de thérapie cellulaire avec des résultats très prometteurs dans l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (alloHSCT). Cependant, les procédures d’élimination des Treg ainsi que leur production restent difficiles à développer en grade clinique limitant ainsi leur utilisation. Il est donc essentiel d'avoir une meilleure compréhension des facteurs impliqués in-vivo dans l’effet des Treg au cours de l’alloHSCT afin de développer des approches thérapeutiques alternatives.Plusieurs études ont montré qu'en l'absence de cellules T effectrices, l’effet suppresseur des Treg est altéré. Etant donné que le TNFαest une cytokine centrale abondamment produite par les cellules T au cours de la GVHD, nous avons testé si dans ce contexte les Treg étaient également dépendent d’une signalisation via le TNFα. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé trois approches expérimentales différentes bloquant l’interaction TNF/TNFR2 dans notre modèle de GVHD expérimentale. Nous révélons pour la première fois une dépendance complète au TNFα des Treg en termes de capacités suppressives in-vivo. Nous montrons également que la seule inhibition de la production de TNFα par les cellules T du donneur est suffisante pour abolir complètement l'effet suppresseur des Treg. Nous pensons que nos résultats ouvrent la voie vers le développement d’une nouvelle approche thérapeutique ciblant les points de contrôle de la réponse immunitaires afin de moduler l’alloréactivité après alloHSCT. En effet, l'inhibition de la voie TNF/TNFR2 pourrait potentialiser l'effet GVL des lymphocytes T du donneur en bloquant l'effet des Treg. Inversement, l’alloréactivité pourrait être fortement réduite ce qui aboutirait au contrôle de la GVHD par l’utilisation d’une molécule agoniste du TNFR2 qui permettrait d’augmenter les Treg ex-vivo. / Regulatory Tcells (Treg) are key target cells to modulate in both ways the allogeneic immune response. Indeed, it was initially demonstrated in experimental mouse models of graft-versus-host disease (GVHD) that Tregs depletion could intensify the disorder whereas cell therapy using Tregs allowed to efficiently prevent experimental aGVHD. These pre-clinical models led to the development of clinical trials of Treg-based cell therapy with already very promising results in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT). However, the procedures of ex-vivo Tregs depletion as well as Tregs production remain difficult to develop at clinical grade thus limiting their dissemination. It is therefore critical to have a better understanding of factors involved in-vivo in these Treg-dependent effects in alloHSCT to develop alternative therapeutic approaches.Previous studies showed that in the absence of effector Tcells, suppressive effect of Tregs was significantly altered. Since TNFα is a central cytokine abundantly produced by Tcells during aGVHD, we tested whether in the context of alloHSCT the Tregs effect also depends on TNFα signaling. To test this hypothesis, we used three different experimental approaches to prevent TNF/TNFR2 interaction in our model of experimental aGVHD. We revealed for the first time a complete TNFα dependency for Tregs in terms of suppressive capacity in-vivo. We also showed that the sole inhibition of TNFα production by donor Tcells was sufficient to completely abolish the Tregs suppressive effect. We believe that our results pave the way for a novel immune checkpoint therapy to modulate alloreactivity after alloHSCT. Indeed, TNFα inhibition could potentiate the GVL effect of donor lymphocyte by blocking Treg effect. On the other hand, the alloreactivity could be strongly reduced to control GVHD by using TNFR2 agonist molecules in order to expand Tregs ex-vivo.

Während der letzten 10 Jahre, wurden viele neue immunsuppremierende Medikamente für die Verbesserung des Kurzzeit-Transplantationsergebnisses entwickelt (Halbwertzeit bzw. Abstoßung einer Niere nach ca. 10-12 Jahren). Das heutige therapeutische Ziel besteht auf der einen Seite aus der Minimierung der Kosten bzw. der Minimierung der Nebenwirkungen verursacht durch die Immunsuppressiva und auf der anderen Seite der Verbesserung des Langzeit-Überleben eines Transplantates. Um eine dosis-abhängige Zerstörung des Transplantates durch die Immunsuppressiva zu vermeiden, bedarf es der spezifischen Entwicklung von zusätzlichen Toleranzprotokollen. Ein Top-Kandidat für die Toleranzinduktion in Transplantationen stellen die CD4+CD25high regulatorischen T Zellen dar. Da humane regulatorische T Zellen jedoch nur 1-2 % der peripheren CD4+ T Zellen repräsentieren, ist es nicht möglich ausreichende Zellmengen auf zu reinigen. Dazu ist die Etablierung adäquater Protokolle für die Isolation und ex vivo Expansion von CD4+CD25high Treg’s notwendig. In unserem System ist es uns möglich die CD4+CD25high zellen mit einer sehr hohen Reinheit zu isolieren ( ca. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Danach werden die isolierten Treg’s mit verschiedenen Protokollen, wie der Expansion mit CD2-,CD3- und CD28 Expansionbeads oder allogenen Feederzellen, expandiert. Das suppressive Potential der expandierten CD4+CD25+ Treg’s wurde in drei funktionellen Assays, einem CFSE-basierenden Proliferationsassay, einem Cytokin-Bead-Array und einem Elispot bestimmt. Basierend auf den genannten Methoden wurde das Proliferationspotential allogen stimulierter Responder T Zellen, die IFNg Produktion und das Th1/TH2 Cytokinprofil in einer gemischten Lymphozytenreaktion mit unterschiedlichen Mengen der expandierten Treg’s untersucht Ein weiterer Aspekt dieses Projektes ist die Expansion isolierter regulatorischer T Zellen mit zusätzlichem Rapamycin. Das immunsuppremierende Medikament Rapamycin blockiert die Il2-abhängige T Zellproliferation durch die Inhibition von mTOR und induziert die Expansion regulatorischer T Zellen. / During the last decade, a broad set of immunosuppressive drugs has been developed which improve short-term transplant results (1yr survival, acute graft rejection), but not long-term results (graft half life, e.g. kidney rejection after approx. 10-12 years). In this regard, the therapeutic aim is to minimise costs and long-term side effects caused by immunosuppressive drugs on the one hand, and on the other to considerably improve the long term survival of transplanted patients. To avoid dose-dependent damage of the transplant by immunosuppressive drugs, a specific development of additional tolerance protocols is mandatory. One top candidate for the tolerance induction in transplantation is the population of CD4+CD25high regulatory T cells (Treg’s). Because Tregs constitute 1-2% of peripheral CD4+ T cells in human, it may not be possible to purify sufficient cells ex vivo. Therefore it is necessary to establish appropriate protocols for isolation and expansion of CD4+CD25high Treg’s. In our system we are able to isolate CD4+CD25high cells with a very high purity (approx. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Afterwards we expand the isolated Treg’s by different expansion protocolls such as expansion with CD3-, CD2- and CD28-expansionsbeads as well as allogeneic feedercells. The suppressive potential of the expanded CD4+CD25+ Treg’s was determined by three different functional assays, a CFSE-based proliferationassay, a Cytokine-Bead-Array, and an IFNGamma-Elispot. Based on mentioned methods, the proliferative potential of allogenic stimulated responder T cells, IFNGamma production and Th1/Th2 cytokine profile, as well as the IFNGamma producing T-cells in a mixed lymphocyte reaction with different amounts of the expanded regulatory T cells were tested. Another aspect of our project is the expansion of the isolated regulatory T cells with additional rapamycin. The immunosuppressive drug rapamycin is a powerful pharmacological agent which blocks IL2-dependent T cell proliferation by accumulation with mTOR and induces expansion of regulatory T cells.

T cells use their highly variable T cell receptor (TCR) to engage major histocompatibility molecules (MHC) presenting peptides on the surface of antigen presenting cells during an immune response. The TCR repertoire of developing T cells is shaped by thymic selection, resulting in a self-tolerant and foreign peptide specific naïve T cell population. However, naive T cells are alloreactive and generate immune responses towards foreign MHC alleles in clinical settings involving transplantation. While T cell immune responses towards foreign pathogens are peptide specific, the overall specificity of allo-responses is still debated. Under normal circumstances, immune system homeostasis and self-tolerance is maintained by specialized natural T regulatory cells (nTregs) that develop in the thymus. nTregs respond to self-peptide MHC they encountered in peripheral tissues with immune-suppressive activities. However, the identify of self-peptides that stimulate nTregs, specificity towards these self-peptides, and the method nTreg TCRs engage self-peptide MHC molecules is not clear. Here, we built a library of defined MHC-linked self-peptides eluted from the I-Ab MHC molecule to screen alloreactive T cells and self-reactive nTregs for activating self-peptides. We used this library to show that negative selection shapes the TCR repertoire’s specificity to self-peptides. We also provide evidence that alloreactive T cells have degenerate self and foreign peptide recognition if the foreign MHC allele is largely different from the host’s MHC allele. Finally, we identified a self-peptide that activates an nTreg, and present protein crystal structures that reveal its TCR engages self and foreign peptide MHC complexes via fairly conventional mechanisms.

We performed a retrospective study in 185 patients with myelogenous leukemias who had received hematopoietic cells from unrelated donors. The aim of this study was to answer the question wether the benefit of KIR ligand incompatibility seen in haploidentical tranplantations can also be seen using unrelated donors. We could not detect a significant difference in survival between patients with a KIR ligand incompatibility and those with either fully matched or partially mismatched unrelated donors in this patient cohort. / In der Therapie von Leukämien ist die Knochenmark- bzw. Stammzelltransplantation eine tragende Säule. Für den Transplantationserfolg ist eine Übereinstimmung der Haupthistokompatibilitätsantige (HLA-Antigene der Klassen I und II) zwischen Spender und Empfänger von zentraler Bedeutung. Diese Notwendigkeit ergibt sich aus der sogenannten MHC-Restriktion in der T-Zellrezeptorerkennung. Ob auch NK-Zellrezeptoren und deren Liganden in der Spenderauswahl berücksichtigt werden sollten, ist bisher unzureichend untersucht. Insbesondere trifft das für die KIR-Rezeptoren zu, die wie die T-Zellrezeptoren ebenfalls HLA-Antigene als Liganden besitzen. Velardi et al. haben 2002 erstmalig gezeigt, daß in der Therapie myeloischer Leukämien die Transplantation von Blutstammzellen verwandter Spender mit KIR-Liganden-Inkompatibilität von klinischem Vorteil ist. Ob KIR-Liganden-Inkompatibilität auch bei Knochenmark-/ Stammzelltransplantationen Unverwandter Bedeutung erlangen könnte, war zu Studienbeginn offen und blieb auch infolge diskrepanter Untersuchungsergebnisse von verschiedenen Arbeitsgruppen im Verlauf der Studie widersprüchlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese Fragestellung, die auch Teil einer internationalen Studie war, an 185 Spender-Empfänger-Paaren retrospektiv untersucht. Dabei wurde bei den Paaren einerseits die KIR-Liganden-Kompatibilität auf der Grundlage der HLA-C-Supertypen erschlossen (nach Velardi et al.). Andererseits konnte sie im internationalen Studienprogramm direkt aus dem KIR-Genotyp des Spenders und dem HLA-C-Supertyp des Empfängers ermittelt werden. Die Untersuchungen ergaben folgende Resultate: bei Vorliegen von KIR-Liganden-Inkompatibilität hat die Verwendung von ATG als Bestandteil der GvHD-Prophylaxe keinen Einfluß auf das klinische Ergebnis. Die Vermutungen von Giebel et al. wurden damit nicht gestützt. Die Bestimmung des KIR-Liganden-Status mit Hilfe der Rückschlußmethode allein aus dem HLA-Typ ist unzuverlässig. Für eine exakte Differenzierung ist die gleichzeitige KIR-Genotypisierung erforderlich. KIR-Liganden-Inkompatibilität ist bei unverwandten Knochenmark-/ Stammzelltransplantationen nicht von klinischem Vorteil. Auch ein gezieltes Aussuchen HLA-C-inkompatibler Spender auf der Grundlage einer KIR-Genotypisierung stellt derzeit keine therapeutische Option dar.

Functional impairment of the bone marrow (BM) niche has been suggested as a major reason for prolonged cytopenia and secondary graft failure after allogeneic hematopoietic cell transplantation (alloHCT). Because mesenchymal stromal cells (MSCs) serve as multipotent progenitors for several niche components in the BM, they might play a key role in this process. We used collagenase digested trephine biopsies to directly quantify MSCs in 73 patients before (n = 18) and/or after alloHCT (n = 65). For the first time, we demonstrate that acute graft-versus-host disease (aGvHD, n = 39) is associated with a significant decrease in MSC numbers. MSC reduction can be observed even before the clinical onset of aGvHD (n = 10). Assessing MSCs instantly after biopsy collection revealed phenotypic and functional differences depending on the occurrence of aGvHD. These differences vanished during ex vivo expansion. The MSC endotypes observed revealed an enhanced population of donor-derived classical dendritic cells type 1 and alloreactive T cells as the causing agent for compartmental inflammation and MSC damage before clinical onset of aGvHD was ascertained. In conclusion, MSCs endotypes may constitute a predisposing conductor of alloreactivity after alloHCT preceding the clinical diagnosis of aGvHD.

We performed a retrospective study in 185 patients with myelogenous leukemias who had received hematopoietic cells from unrelated donors. The aim of this study was to answer the question wether the benefit of KIR ligand incompatibility seen in haploidentical tranplantations can also be seen using unrelated donors. We could not detect a significant difference in survival between patients with a KIR ligand incompatibility and those with either fully matched or partially mismatched unrelated donors in this patient cohort. / In der Therapie von Leukämien ist die Knochenmark- bzw. Stammzelltransplantation eine tragende Säule. Für den Transplantationserfolg ist eine Übereinstimmung der Haupthistokompatibilitätsantige (HLA-Antigene der Klassen I und II) zwischen Spender und Empfänger von zentraler Bedeutung. Diese Notwendigkeit ergibt sich aus der sogenannten MHC-Restriktion in der T-Zellrezeptorerkennung. Ob auch NK-Zellrezeptoren und deren Liganden in der Spenderauswahl berücksichtigt werden sollten, ist bisher unzureichend untersucht. Insbesondere trifft das für die KIR-Rezeptoren zu, die wie die T-Zellrezeptoren ebenfalls HLA-Antigene als Liganden besitzen. Velardi et al. haben 2002 erstmalig gezeigt, daß in der Therapie myeloischer Leukämien die Transplantation von Blutstammzellen verwandter Spender mit KIR-Liganden-Inkompatibilität von klinischem Vorteil ist. Ob KIR-Liganden-Inkompatibilität auch bei Knochenmark-/ Stammzelltransplantationen Unverwandter Bedeutung erlangen könnte, war zu Studienbeginn offen und blieb auch infolge diskrepanter Untersuchungsergebnisse von verschiedenen Arbeitsgruppen im Verlauf der Studie widersprüchlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese Fragestellung, die auch Teil einer internationalen Studie war, an 185 Spender-Empfänger-Paaren retrospektiv untersucht. Dabei wurde bei den Paaren einerseits die KIR-Liganden-Kompatibilität auf der Grundlage der HLA-C-Supertypen erschlossen (nach Velardi et al.). Andererseits konnte sie im internationalen Studienprogramm direkt aus dem KIR-Genotyp des Spenders und dem HLA-C-Supertyp des Empfängers ermittelt werden. Die Untersuchungen ergaben folgende Resultate: bei Vorliegen von KIR-Liganden-Inkompatibilität hat die Verwendung von ATG als Bestandteil der GvHD-Prophylaxe keinen Einfluß auf das klinische Ergebnis. Die Vermutungen von Giebel et al. wurden damit nicht gestützt. Die Bestimmung des KIR-Liganden-Status mit Hilfe der Rückschlußmethode allein aus dem HLA-Typ ist unzuverlässig. Für eine exakte Differenzierung ist die gleichzeitige KIR-Genotypisierung erforderlich. KIR-Liganden-Inkompatibilität ist bei unverwandten Knochenmark-/ Stammzelltransplantationen nicht von klinischem Vorteil. Auch ein gezieltes Aussuchen HLA-C-inkompatibler Spender auf der Grundlage einer KIR-Genotypisierung stellt derzeit keine therapeutische Option dar.