La present tesi és un reflex de les dues línies d'investigació principals del nostre grup de recerca. Per una banda, l'estudi de la relació estructura funció de les carboxipeptidases i els seus inhibidors, que constitueix la línia de treball en la que el grup hi porta treballant durant més anys. La segona part de la tesi està centrada en l'estudi del plegament i l'agregació proteica, més concretament en l'estudi de models proteics en els que es pot induir la formació d'estructures amiloïdòtiques, i en el desenvolupament de mètodes de predicció de l'agregació de les proteïnes a partir de la seva seqüència. Part I:La carboxipeptidasa A1 és l'enzim prototip de les carboxipeptidases de la subfamília A/B. En aquesta tesi s'ha obtingut l'estructura tridimensional de la CPA1 humana a la resolució de 1,6 Å. L'estructura de la CPA1 humana a alta resolució aporta detalls addicionals per a aprofundir en l'estudi del seu mecanisme catalític, a més a més, constitueix un motlle excel·lent per a modelar sobre d' ella l'estructura de carboxipeptidases de gran rellevància fisiològica com les implicades en el processament d'hormones i neurotransmissors.En el segon capítol de la primera part de la tesi es presenta l'estructura tridimensional del complex entre la latexina i la carboxipeptidasa A4 humanes. La caracterització funcional de la latexina mitjançant estudis d'inhibició permet descriure-la com un inhibidor de carboxipeptidases d'unió forta i de tipus no-competitiu. En el complex, l'inhibidor es situa a la part superior del canal d'entrada al centre actiu de la carboxipeptidasa. La superfície coberta per la latexina és molt més gran que la descrita en altres complexes proteasa-inhibidor i, en la inhibició no hi participa cap dels seu extrems. En base a aquests resultats, en el present treball es suggereix que les latexines constitueixen la família d'inhibidors endògens de les A/B metal·locarboxipeptidases de vertebrats.Part II:El tercer capítol, amb el que s'obre aquesta segona part, demostra que la latexina podria esdevenir un bon model per a l'estudi dels estats prefibril·lars formats a partir d'un estat totalment desplegat. A diferència de la latexina que pot ser emprada com a model de proteïna intrínsecament desestructurada, en el quart capítol de la tesi es presenta un treball desenvolupat amb l'?-quimotripsina. És una proteïna que en l'estat natiu té un plegament de tipus barril-?, un dels més habituals a la natura. En aquest cas la formació de fibres amiloides requereix la formació prèvia d'un intermediari parcialment plegat ric en estructura ?.El primer i el segon treball d'aquesta segona part són un reflex dels dos models de proteïnes que es troben implicades en el desenvolupament de les malalties amiloïdogèniques. En el cas de la latexina, la formació d'estructures amiloides requereix del desplegament total de la proteïna, pel que seria un model adequat per a l'estudi de les malalties en les que la proteïna que origina l'agregació es troba intrínsecament desestructurada. En canvi, el model de l'?-quimotripsina s'ajustaria al de les proteïnes globulars on el procés d'agregació requereix de la formació d'un estat parcialment plegat ric en estructura ?. Els resultats obtinguts són indicatius de que la capacitat de formar aquestes estructures es pot considerar una habilitat general de totes les cadenes polipeptídiques. Tot i això, la propensió per fer-ho varia molt entre seqüències diferents. En el darrer i cinquè treball de la present tesi, s'ha desenvolupat un mètode per a predir aquestes regions facilitadores de l'agregació, les quals són potencials dianes terapèutiques. La diferència principal entre els escassos mètodes de predicció trobats a la literatura i el que es presenta en la tesi és l'origen de les dades que s'utilitzen per generar el perfil d'agregació de la proteïna; mentre que en la resta de mètodes descrits s'usen fórmules matemàtiques amb valors teòrics que són assignats a regions específiques de la seqüència, en aquest treball s'han usat les dades experimentals d'un sistema in vivo desenvolupat anteriorment al grup. / The present thesis reflects the two main research lines of our group. The first part is related with the study of the structure-function relationship in metallocarboxypeptidases and their inhibitors. While the second part, is focused on the study of folding and protein aggregation and more specifically on the study of protein models in which the formation of amyloid structures can be induced and in the development of protein aggregation prediction methods from their primary sequence.Part I:Carboxypeptidase A1 is the prototype of the A/B carboxypeptidase subfamily. In this thesis has been obtained the three dimensional structure of human CPA1 at 1.6 Å resolution. This structure at high resolution provides a template for modeling the structure of physiologically relevant carboxypeptidases, as the ones implied in hormone and neuropeptide processing, as well as for the specific design of inhibitors.In the second chapter the three dimensional structure of human latexin in complex with human CPA4 was been solved. The functional characterization of latexin by inhibition assays describes it as a non-competitive inhibitor of vertebrate A/B metallocarboxypeptidases. In the complex, the inhibitor sits on the top of the funnel rim occluding the entrance to the active site covering a higher area than in other typical protease-inhibitor interfaces. In contrast to other protein inhibitors of metalloproteases, inhibition by latexin does not involve any of its termini. Our molecular studies show that structural determinants simultaneously confer vertebrate-linked specificity to latexins and sufficient variability to strongly inhibit all vertebrate forms tested. Latexins could represent the family of endogenous MCP inhibitors in vertebrates.Part II:The third chapter, which opens the second part, indicates that latexin could be a good model for the study of the prefibrillar states originate from an unfolded state.In contrast to latexin, which can be used as an intrinsically unstructured protein model, in the fourth chapter of the thesis a work developed with ?-chymotripsin is presented. This is a protein which in the native state presents a ?-barrel fold, one of the most abundant in nature. In this case, the amyloid fibril formation requires the previous formation of a partially folded intermediate state rich in ?-sheet structure.The first and second works of the second part of the thesis summarizes the two proteins models that are involved in the development of amyloidogenic diseases. In the case of latexin, the amyloid structure formation requires the completely unfolding of the protein, so it can be a good model for the study of the diseases where the protein that originates the aggregation event is completely unfolded. While, the ?-chymotripsin model fits with the globular proteins, where the aggregation process requires the formation of a partially unfolded state rich in ?-sheet structure. The obtained results indicate that the ability to form these structures is general for all the polypeptide chains, although the propensity changes between different sequences.In the last work, a method to predict the aggregation prone regions of a sequence has been developed. Prediction of such sequence stretches is important since they are potential therapeutic targets. The main difference between the few prediction methods available in the literature and the one presented in the thesis is that the origin of the data used to generate the aggregation profile; while in the other methods mathematical formulas with theoretical values are assigned to specific region of the sequence, in this work, we have used experimental data obtained in an in vivo system using ?-amyloid peptide has been used as a model to derive the relative aggregation propensities of each individual natural amino acid when placed in the central position of the CHC of A?.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In Alzheimer s disease (AD), β-amyloid peptide (Aβ) has been linked with synaptic loss and cognitive dysfunction, albeit the precise mechanism remains unknown. An involvement of N-Methyl-D-Aspartate receptors (NMDAR) in AD is proposed, since its inhibition attenuates some aspects of AD s neuropathology. In this regard, polyamines, like spermidine and spermine, positive modulators of NMDARs, have been shown to have both concentration and synthesis increased by Aβ. Using the novel object recognition task we showed that negative modulation of polyamine system, been trough blockade of its binding site at NMDAR by arcaine (0.02 nmol/site), traxoprodil (0.002 nmol/site), or inhibition of polyamine synthesis by DFMO (2.7 nmol/site), reverses Aβ25-35-induced memory impairment in mice. The activation of polyamine binding site at NMDAR located at extrasynaptic sites might underlie the cognitive deficits of Aβ25-35-treated mice, since incubation of hippocampal neuron cultures with spermidine (400 μM) or Aβ25-35 (10 μM) significantly increased nuclear accumulation of jacob protein, a marker of extrasynaptic NMDAR activation. Moreover, traxoprodil (4nM), arcaine (4 μM) or DFMO (5 μM) blocked the Aβ-induced jacob nuclear translocation. Activation of extrasynaptic NMDAR in neurons leads to striping of synaptic contacts and simplification of neuronal cytoarchitecture. Incubation of hippocampal neuron cultures with traxoprodil (4 Nm), arcaine (4 μM) or DFMO (5 μM) reversed the deleterious effects of Aβ25-35 on dendritic spine number and spine morphology. We also evaluated the involvement of A-type K+ currents on the Aβ25-35-induced memory impairment. Administration of Tx3-1 (3 100 pmol/site), a selective IA blocker, restored memory of mice injected with Aβ25-35 and tested on the novel object recognition task The reversal of memory impairment and the protective effect on dendritic spine alterations exerted by the modulators of the polyamine system suggest the polyamine binding site at extrasynaptic NMDAR a potential player in Aβ-induced cognitive deficit. / O peptídeo β-amiloide (Aβ), reconhecido como agente tóxico na Doença de Alzheimer (DA) é implicado como causador de danos cognitivos e sinápticos, apesar de os mecanismos não serem completamente compreendidos. O envolvimento do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) na DA é sugerido, visto que o seu bloqueio atenua alguns aspectos neuropatológicos da DA. Nesse contexto, tem sido demonstrado que as poliaminas, como espermidina e espermina, moduladores positivos do receptor NMDA, possuem níveis e síntese elevada tanto no cérebro de pacientes com DA como em preparações in vitro utilizando o peptídeo Aβ. Neste estudo demonstrou-se que a modulação do sistema das poliaminas, através do bloqueio do seu sítio de ligação no receptor NMDA por arcaína (0,02 nmol/sítio), traxoprodil (0,002 nmol/sítio) ou da inibição de sua síntese por DFMO (2,7 nmol/sítio), reverte o déficit cognitivo induzido pela injeção de Aβ25-35 em camundongos testados na tarefa de reconhecimento de objetos. A ativação do sítio de ligação das poliaminas em receptores NMDA extrassinápticos pode subjazer o déficit cognitivo de camundongos injetados com Aβ25-35, visto que a incubação de culturas primárias de neurônios hipocampais com espermidina (400 μM), NMDA (200 μM) ou Aβ25-35 (10 μM) aumenta o acúmulo nuclear de jacob, um marcador de ativação de receptores NMDA extrassinápticos, de maneira significante. Ademais, traxoprodil (4 nM), arcaína (4 μM) ou DFMO (5 μM) bloquearam o acúmulo nuclear de jacob induzido por Aβ. A ativação de receptores NMDA extrassinápticos em neurônios leva a simplificação da citoarquitetura neuronal e a diminuição de contatos sinápticos. Aqui demonstrou-se que a incubação de culturas de neurônios hipocampais com traxoprodil (4 nM), arcaína (4 μM) ou DFMO (5 μM) reverte as alterações na a densidade e morfologia de espinhas dendríticas induzido pela incubação com Aβ25-35. Ainda, também avaliou-se o envolvimento de correntes de K+ do tipo A no déficit cognitivo induzido pela injeção i.c.v. de Aβ25-35. A administração de Tx3-1 (3 100 pmol/sítio), um bloqueador seletivo de correntes IA, reverteu o prejuízo de memória de camundongos injetados com Aβ25-35 e testados na tarefa de reconhecimento de objetos. A reversão dos danos cognitivos e sinápticos induzidos por Aβ25-35 através da modulação do sistema das poliaminas sugere a estimulação do sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA, possivelmente extrassínaptico, como um dos mecanimos por trás do déficit cognitivo induzido pelo peptídeo Aβ.