Användningen av biokatalysatorer, särskilt enzymer, inom kemikalie- och läkemedelsindustrin erbjuder betydande fördelar jämfört med de traditionella kemo-katalytiska metoderna som historiskt har dominerat industrin. En viktig klass av enzymer, transaminaser, spelar en central roll i tillverkningen av kirala aminer, som utgör grundläggande byggstenar i dessa industriella sektorer. Denna studie är inriktad på ett specifikt amin transaminas från Silicibacter pomeroyi. Tidigare har detta enzym visat förmåga att katalysera en mängd olika reaktioner för produktion av kirala aminer, men för att realisera dess fulla potential inom industriella tillämpningar krävs förbättrad stabilitet vid högre temperaturer. I motsats till de vanligt förekommande metoderna för proteinteknik, såsom rationell design och riktad evolution, används i denna studie släktsekvensrekonstruktion för att skapa mer temperaturtåliga varianter av detta enzym. Tidigare användning av denna metod har visat sig kunna generera proteiner med högre temperaturtålighet. Genom denna metod, där förfäder till detta enzym återskapas utifrån bevarade sekvenser, förväntas generering av varianter som kan bibehålla sin funktion vid högre temperaturer under en längre tid. Genom att utforska denna alternativa strategi för proteinteknik strävar studien efter att ge mer robusta biokatalysatorer för industriella tillämpningar. Utfallet från denna studie visade att två förfäder hade ökad termostabilitet. Detta visade sig dels genom analys av T5015 som påvisade en 3.9 och 6 C° förbättring för respektive förfader. Vidare påvisade t1/2 mätningar att dessa enzymer kunde utstå 2.06 till 3.72 gånger så lång tid vid 55 C° innan de inaktiverades. De påvisade dock lägre specifik aktivitet vid rumstemperatur, där en bidragande faktor till detta var att enbart en liten fraktion av förfäderna är korrekt veckade. Detta visar att det är nödvändigt med fortsatta förbättringar och fortsatta studier kring substratacceptans och stabilitet i olika lösningsmedel. Sammanfattningsvis påvisar resultaten att släktsekvensrekonstruktion är en proteinteknik som fungerar för att skapa proteiner med ökad termostabilitet och bör ses som ett mer självklart alternativ till riktad evolution och rationell design. / The utilisation of biocatalysts, particularly enzymes, in chemical and pharmaceutical industries presents significant advantages over the traditional chemocatalytic methods that historically dominated the industry. A crucial class of enzymes, transaminases, play a central role in the production of chiral amines, fundamental building blocks in these industrial sectors. This study focuses on a specific amine transaminase from Silicibacter pomeroyi. While this enzyme has previously demonstrated the ability to catalyse a variety of reactions for chiral amine production, realising its full potential in industrial applications requires enhanced stability at higher temperatures. In contrast to commonly employed protein engineering methods such as rational design and directed evolution, this study utilises ancestral sequence reconstruction to generate more temperature-resistant variants of this enzyme. Previous applications of this method have shown promising results in generating proteins with increased thermal stability. Through this approach, wherein ancestors of this enzyme are recreated from extant sequences, it is expected that variants capable of maintaining function at higher temperatures will be produced. By exploring this alternative strategy for protein engineering, the study aims to provide more robust biocatalysts for industrial applications. The outcome of this study is that two ancestors exhibited increased thermostability. This was evidenced by the analysis of T5015, which showed an improvement of 3.9 and 6 °C for each respective ancestor. Furthermore, t1/2 measurements indicated that they remained active for 2.06 to 3.72 fold longer at 55 °C before becoming inactive. However, they exhibited lower specific activity at room temperature, partially due to only a small fraction of the ancestral protein samples being properly folded. This suggests further improvements and continued investigations into substrate acceptance and stability in different solvents are required. In conclusion, this study demonstrates that ancestral sequence reconstruction is a protein engineering technique effective in enhancing protein thermostability and should be considered a more viable alternative to directed evolution and rational design.

Bakgrund: Över 20 mutagena ämnen har detekterats i tillagade livsmedel. Till dessa räknas heterocykliska aminer. Studier har visat att dessa aminer kan orsaka mutationer och därmed öka risken för att utveckla cancer. Heterocykliska aminer bildas under tillagning av kött i höga temperaturer genom Maillardreaktionen. Syfte: Syftet med denna litteraturstudie var att se om marinering med öl, vin eller örtkryddor kan minska bildningen av heterocykliska aminer vid tillagning av kött. Metod: Denna studie är en litteraturstudie med ett urval av artiklar från databaserna PubMed och Web of Science. Totalt inkluderades 6 artiklar varav 3 artiklar studerade marinering med öl/vin och 3 studerade marinering med örtkryddor och örtextrakt. Resultat: Samtliga studier som undersöktes visade att marinering har en reducerande effekt på mängden heterocykliska aminer som bildas vid tillagning. Den mest troliga hypotesen om mekanismen är att effekten beror på den antioxidativa förmågan hos marinaderna. Ett exempel är en marinad med kombinationen gurkmeja och citrongräs som reducerade koncentrationen heterocykliska aminer med 94,8%. Slutsats: Marinering med öl, vin eller örtkryddor visades effektivt reducera mängden heterocykliska aminer. Stora reducerande effekter detekterades i marinader med gurkmeja, citrongräs, ingefära och mörk lager. Mer forskning behövs för att fastställa om reduktionen är kopplad till den antioxidativa effekten hos marinaderna / Background: Over 20 different mutagenic substances has been detected in cooked food. These include heterocyclic amines. Studies have shown that these amines can create mutations and increase the risk of developing cancer. Heterocyclic amines are formed in meat during the Maillard reaction which occours at high temperature cooking. Aim: The aim of this study was to investigate if the effect of marinating with beer, wine and herbs/spices can reduce the formation of heterocyclic amines found in cooked meat. Method: This study is a literature study with a selection of articles from databases PubMed and Web of Science. Six articles were included in this study. 3 articles involved marinade with beer/wine and 3 articles involved marinade with herbs/spices and extract. Results: All studies examined showed that marinating has a reducing effect on the concentration of heterocyclic amines formed during cooking. The most credible hypothesis of the mechanism is that the effect depends on the antioxidativ capacity of the marinades. For example one marinade with the combination of turmeric and lemon grass reduced the concentration of heterocyclic amines by 94,8%. Conclusion: Marinades containing beer, wine or herbs/spices was shown to effectively reduce the amount of heterocyclic amines. Great reducing effects were found using turmeric, lemon grass, ginger and black beer. More scientific research is needed to determine if the reduction is linked to the antioxidant effect in marinades.