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INTRODUÇÃO O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 8 milhões de mortes por ano, segundo dados da OMS. As mortes por câncer são provocadas por tumores que se originam em órgãos como pulmão, fígado, estômago, intestino, mama e esôfago. As células-tronco mesenquimais (CTM) foram identificadas em vários órgãos e estudos da sua interação com células tumorais têm apresentado resultados indicando ação inibitória sobre alguns tipos de tumores. Para explorar essa questão foram analisados os efeitos sobre células tumorais de carcinoma hepatocelular humano (HepG-2) do meio condicionado (MC) obtido do cultivo de CTM isoladas de tecido adiposo (TA), líquido amniótico (LA) e geleia de Wharton (GW). MÉTODOS Os MCs foram coletados após 24 horas de incubação das CTM sub-confluentes com ?-MEM contendo 20% de soro fetal bovino (SFB). Os MCs foram centrifugados e passados através de filtros de 0,22 ?M e armazenadas a -20 °C. O MC da própria célula HepG-2 foi utilizado como controle. Os efeitos dos MCs sobre a proliferação de células HepG-2 foram testados por ensaio MTT, em várias concentrações após 24 h de incubação. O ciclo celular de células HepG-2 tratadas com MC a 25%, 50% ou 75% foi analisado por citometria de fluxo (coloração IP) utilizando o software Modfit LT. A expressão dos genes bcl-2, bcl-6, CCND1 foi analisada por RT-PCR. A proliferação celular foi avaliada pela expressão das proteínas survivina, Bcl-2, PCNA e Ki-67 e pela quantificação de mitocôndrias com corante MitoTracker, assim como pelo potencial de membrana mitocondrial por corante JC-1 Mitoscreen utilizando equipamento de high content analysis. RESULTADOS Os meios condicionados de células-tronco de tecido adiposo (MC-TA) não alteraram a proliferação de células tumorais HepG-2 e os meios condicionados de células-tronco de líquido amniótico (MC-LA) e de geleia de Wharton (MC-GW) provocam aumento da proliferação, confirmada pela contagem de células com núcleos corados com Hoescht 33342. A análise de alterações do ciclo celular demonstrou que a exposição de células HepG-2 aos meios MC-LA diminuem as células na fase G0/G1 e aumentam na fase G2/M do ciclo celular. A expressão dos genes CCND1, Bcl2 e Bcl6 que estão relacionados à proliferação e morte celular não apresentaram alteração. A quantificação das proteínas PCNA e survivina não apresentou alteração sob efeito dos MC, porém a comparação direta entre células tratadas com MC-LA e MC-TA indicou a tendência das células tratadas com MC-LA proliferarem. O percentual de células HepG-2 expressando a proteína Ki-67 foi significativamente menor em relação ao controle quando tratadas com MC-TA, não apresentando diferenças quando tratadas com MC-LA e MC-GW. A contagem de mitocôndrias evidenciou aumento de mitocôndrias nas células HepG-2 tratadas com MC-LA e efeito não significativo dos tratamentos com MC-TA e MC-GW. A diferença do potencial de membrana mitocondrial por JC-1 apresentou aumento da polarização nas células HepG-2 cultivadas com MC-TA. CONCLUSÃO Os resultados confirmam que as células-tronco mesenquimais diferem de acordo com a sua origem tecidual em sua ação na proliferação das células HepG-2. Mais estudos são necessários para estabelecer a causa destas ações, que não parecem ser devido a mediadores mais comuns na proliferação e morte celular / INTRODUCTION Cancer is a leading cause of death worldwide, accounting for about 8 million deaths per year, according to WHO data. Cancer deaths are caused by tumors that originate in organs such as lung, liver, stomach, bowel, breast and esophagus. The mesenchymal stem cells (MSCs) have been identified in many organs and studies of their interaction with tumor cells have shown results indicating an inhibitory effect on some types of tumors. To explore this question the effects of the conditioned medium (CM) obtained from mesenchymal stem cell isolated from adipose tissue (AT), amniotic fluid (AF) and Wharton jelly (WJ) on tumor cells of human hepatocellular carcinoma (HepG-2) were analyzed. METHODS The MSC CM was collected after 24 hours incubation of sub confluent MSC with ?-MEM containing 20% fetal bovine serum (FBS). The MSC CM were centrifuged and passed through 0.22 ?M filter and stored at -20° C. The CM of HepG-2 cell itself was used as control. The effects of contrast media on proliferation of HepG-2 cells were tested by MTT assay at various concentrations after 24 h of incubation. The cell cycle HepG-2 cells treated with CM at 25%, 50% or 75% was analyzed by flow cytometry (PI staining) using Modfit software LT. The expression of the genes Bcl-2, Bcl-6, CCND1 was analyzed by RT-PCR. Cell proliferation was assessed by the expression of survivin, Bcl-2, Ki-67 and PCNA proteins, and the quantization of mitochondrial by MitoTracker dye, as well as the mitochondrial membrane potential by JC-1 Mitoscreen dye using high content analysis equipment. RESULTS The conditioned media of mesenchymal stem cells (MSC) from adipose tissue (AT-CM) did not alter the proliferation of tumor HepG-2 cells and conditioned media of MSC cells from amniotic fluid (AF-CM) and Wharton jelly (WJ-CM) caused increased proliferation, confirmed by counting cells with nuclei stained with Hoechst 33342. The cell cycle analysis showed that exposure of HepG-2 cells to AF-CM means decrease the cells in G0 / G1 cell cycle phase and increase in phase G2 / M. The expression of Bcl2, Bcl6 and CCND1 genes that are related to proliferation and cell death did not change. The quantization of PCNA and survivin protein did not change under the effect of conditioned media, but a direct comparison between cells treated with AF-CM and AT-CM indicated the tendency of cells treated with AF-CM proliferate. The percentage of HepG-2 cells expressing the protein Ki-67 was significantly lower than the control when treated with AT-CM and no differences when treated with AF-CM and WJ-CM. The counting of mitochondria showed increased mitochondria in HepG-2 cells treated with AF-CM and no significant effect of treatment with WJ-CM and AT-CM. The difference in mitochondrial membrane potential by JC-1 showed an increase in polarization in HepG-2 cells cultured with AT-CM. CONCLUSION The results confirm that mesenchymal stem cells differ according to their tissue origin in its action on the proliferation of HepG-2 cells. More studies are needed to establish the cause of these actions, which seem to be not related to the most common mediators in cell proliferation and death

INTRODUÇÃO O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 8 milhões de mortes por ano, segundo dados da OMS. As mortes por câncer são provocadas por tumores que se originam em órgãos como pulmão, fígado, estômago, intestino, mama e esôfago. As células-tronco mesenquimais (CTM) foram identificadas em vários órgãos e estudos da sua interação com células tumorais têm apresentado resultados indicando ação inibitória sobre alguns tipos de tumores. Para explorar essa questão foram analisados os efeitos sobre células tumorais de carcinoma hepatocelular humano (HepG-2) do meio condicionado (MC) obtido do cultivo de CTM isoladas de tecido adiposo (TA), líquido amniótico (LA) e geleia de Wharton (GW). MÉTODOS Os MCs foram coletados após 24 horas de incubação das CTM sub-confluentes com ?-MEM contendo 20% de soro fetal bovino (SFB). Os MCs foram centrifugados e passados através de filtros de 0,22 ?M e armazenadas a -20 °C. O MC da própria célula HepG-2 foi utilizado como controle. Os efeitos dos MCs sobre a proliferação de células HepG-2 foram testados por ensaio MTT, em várias concentrações após 24 h de incubação. O ciclo celular de células HepG-2 tratadas com MC a 25%, 50% ou 75% foi analisado por citometria de fluxo (coloração IP) utilizando o software Modfit LT. A expressão dos genes bcl-2, bcl-6, CCND1 foi analisada por RT-PCR. A proliferação celular foi avaliada pela expressão das proteínas survivina, Bcl-2, PCNA e Ki-67 e pela quantificação de mitocôndrias com corante MitoTracker, assim como pelo potencial de membrana mitocondrial por corante JC-1 Mitoscreen utilizando equipamento de high content analysis. RESULTADOS Os meios condicionados de células-tronco de tecido adiposo (MC-TA) não alteraram a proliferação de células tumorais HepG-2 e os meios condicionados de células-tronco de líquido amniótico (MC-LA) e de geleia de Wharton (MC-GW) provocam aumento da proliferação, confirmada pela contagem de células com núcleos corados com Hoescht 33342. A análise de alterações do ciclo celular demonstrou que a exposição de células HepG-2 aos meios MC-LA diminuem as células na fase G0/G1 e aumentam na fase G2/M do ciclo celular. A expressão dos genes CCND1, Bcl2 e Bcl6 que estão relacionados à proliferação e morte celular não apresentaram alteração. A quantificação das proteínas PCNA e survivina não apresentou alteração sob efeito dos MC, porém a comparação direta entre células tratadas com MC-LA e MC-TA indicou a tendência das células tratadas com MC-LA proliferarem. O percentual de células HepG-2 expressando a proteína Ki-67 foi significativamente menor em relação ao controle quando tratadas com MC-TA, não apresentando diferenças quando tratadas com MC-LA e MC-GW. A contagem de mitocôndrias evidenciou aumento de mitocôndrias nas células HepG-2 tratadas com MC-LA e efeito não significativo dos tratamentos com MC-TA e MC-GW. A diferença do potencial de membrana mitocondrial por JC-1 apresentou aumento da polarização nas células HepG-2 cultivadas com MC-TA. CONCLUSÃO Os resultados confirmam que as células-tronco mesenquimais diferem de acordo com a sua origem tecidual em sua ação na proliferação das células HepG-2. Mais estudos são necessários para estabelecer a causa destas ações, que não parecem ser devido a mediadores mais comuns na proliferação e morte celular / INTRODUCTION Cancer is a leading cause of death worldwide, accounting for about 8 million deaths per year, according to WHO data. Cancer deaths are caused by tumors that originate in organs such as lung, liver, stomach, bowel, breast and esophagus. The mesenchymal stem cells (MSCs) have been identified in many organs and studies of their interaction with tumor cells have shown results indicating an inhibitory effect on some types of tumors. To explore this question the effects of the conditioned medium (CM) obtained from mesenchymal stem cell isolated from adipose tissue (AT), amniotic fluid (AF) and Wharton jelly (WJ) on tumor cells of human hepatocellular carcinoma (HepG-2) were analyzed. METHODS The MSC CM was collected after 24 hours incubation of sub confluent MSC with ?-MEM containing 20% fetal bovine serum (FBS). The MSC CM were centrifuged and passed through 0.22 ?M filter and stored at -20° C. The CM of HepG-2 cell itself was used as control. The effects of contrast media on proliferation of HepG-2 cells were tested by MTT assay at various concentrations after 24 h of incubation. The cell cycle HepG-2 cells treated with CM at 25%, 50% or 75% was analyzed by flow cytometry (PI staining) using Modfit software LT. The expression of the genes Bcl-2, Bcl-6, CCND1 was analyzed by RT-PCR. Cell proliferation was assessed by the expression of survivin, Bcl-2, Ki-67 and PCNA proteins, and the quantization of mitochondrial by MitoTracker dye, as well as the mitochondrial membrane potential by JC-1 Mitoscreen dye using high content analysis equipment. RESULTS The conditioned media of mesenchymal stem cells (MSC) from adipose tissue (AT-CM) did not alter the proliferation of tumor HepG-2 cells and conditioned media of MSC cells from amniotic fluid (AF-CM) and Wharton jelly (WJ-CM) caused increased proliferation, confirmed by counting cells with nuclei stained with Hoechst 33342. The cell cycle analysis showed that exposure of HepG-2 cells to AF-CM means decrease the cells in G0 / G1 cell cycle phase and increase in phase G2 / M. The expression of Bcl2, Bcl6 and CCND1 genes that are related to proliferation and cell death did not change. The quantization of PCNA and survivin protein did not change under the effect of conditioned media, but a direct comparison between cells treated with AF-CM and AT-CM indicated the tendency of cells treated with AF-CM proliferate. The percentage of HepG-2 cells expressing the protein Ki-67 was significantly lower than the control when treated with AT-CM and no differences when treated with AF-CM and WJ-CM. The counting of mitochondria showed increased mitochondria in HepG-2 cells treated with AF-CM and no significant effect of treatment with WJ-CM and AT-CM. The difference in mitochondrial membrane potential by JC-1 showed an increase in polarization in HepG-2 cells cultured with AT-CM. CONCLUSION The results confirm that mesenchymal stem cells differ according to their tissue origin in its action on the proliferation of HepG-2 cells. More studies are needed to establish the cause of these actions, which seem to be not related to the most common mediators in cell proliferation and death

No Brasil, houve significativa redução da mortalidade infantil, porém não do componente perinatal que corresponde a 13% do total. O diagnóstico das infecções congênitas com base apenas em dados clínicos, ultrassonográficos e sorológicos maternos é muito difícil, havendo necessidade de um número grande de sorologias, algumas delas não disponíveis na rotina laboratorial, e o simples encontro de sorologia positiva (IgM e IgG positivas) na gestante não constitui prova inequívoca da transmissão vertical. A extração de DNA/ RNA a partir de líquido amniótico possui baixo rendimento, dificultando a realização de inúmeros testes moleculares. Sendo assim, na tentativa de preencher esta lacuna diagnóstica, a presente pesquisa teve como objetivo a padronização e validação de uma multiplex-nested-PCR capaz de detectar, de forma simultânea, sete patógenos que causam infecções congênitas e possuem DNA no genoma: CMV, HSV, VZV, EBV, adenovírus, parvovírus B19 e Toxoplasma gondii, com determinação da frequência relativa de cada microrganismo em um grupo de gestantes com (estudo) e sem suspeita de infecção (controle). No grupo de estudo, 147 gestantes foram recrutadas, com 57 casos positivos (38,8%): 32 com T. gondii (21,8% do total e 56,1% dos positivos);12 com CMV (8,1% e 21%); 5 casos com parvovírus (3,4% e 8,8%); 4 com adenovírus (2,7% e 7%) e 4 casos com dupla detecção (2 casos com T. gondii e CMV; 1 caso com T. gondii e VZV e 1 caso com CMV e parvovírus B19). O grupo controle contou com 193 casos e 197 amostras: líquido amniótico para cariotipagem em gestantes com idade avançada (n=44); amostras de sangue (n =150), e fragmentos de placentas (n=3) de gestantes com pré-natal normal, no momento do parto. Neste grupo, duas amostras de líquido amniótico foram positivas (1,04% do total de casos e 4,5% dos líquidos): um caso de adenovírus em feto com cariótipo normal, e um caso de T. gondii em feto com translucência nucal aumentada e trissomia do 21 (síndrome de Down). Neste grupo controle 14/193 cariótipos fetais se encontravam alterados (7,2%). A falta de estudos similares dificultou a comparação dos resultados, porém a multiplex-nested-PCR detectou número quase seis vezes superior ao detectado pelos exames disponíveis nos centros participantes. Todos os resultados positivos foram confirmados pelo sequenciamento dos produtos de amplificação. A similaridade entre as sequências amplificadas e os protótipos do GenBank variou entre 95-98%. No presente estudo, a padronização e validação de uma multiplex-nested-PCR foi realizada com sucesso, utilizando protocolos simples, reprodutíveis, agrupamento dos sete controles positivos em um único plasmídeo bacteriano e substituição da detecção do material amplificado pela eletroforese capilar, mais rápida, com menor custo, e com maior grau de resolução que os géis de agarose. Para a implantação da técnica na rotina laboratorial, pretende-se a substituição do sequenciamento como método confirmatório, pela realização de amplificações em tempo real com Sybr Green, apenas do patógeno que for detectado pela multiplex-nested-PCR. / In Brazil, there was a significant reduction in infant mortality, but not in the perinatal component, which corresponds to 13% of the total. Diagnosis of congenital infections based on maternal clinical, ultrasound and serological data is very difficult, requiring a large number of serologies, some of which are not available in the clinical laboratory routine, and the simple finding of a positive IgM and IgG in the pregnant woman does not constitute unequivocal evidence of vertical transmission. The extraction of DNA/ RNA from amniotic fluid samples has a low yield, making it difficult to perform many molecular tests on this biological material. Therefore, in an attempt to fill this diagnostic gap, the present research aimed at standardizing and validating a multiplex-nested-PCR capable of simultaneously detecting seven pathogens that cause congenital infections and have DNA in their genomes: CMV, HSV, VZV, EBV, adenovirus, parvovirus B19 and Toxoplasma gondii. The study has also aimed at determining the relative frequency of each microorganism in a group of pregnant women with (study group) or without suspicion of infection (control group). In the study group, 147 pregnant women were included and 57 (38.8%) positive cases detected. Thirty-two cases had T. gondii (21.8% of the total and 56.1% of the positive ones), 12 had CMV (8.1% and 21%); 5 cases had parvovirus (3.4% and 8.8%); 4 cases had adenovírus (2.7% and 7%). Four cases showed double detection (2 cases had T. gondii and CMV, 1 case had T. gondii and VZV, and 1 case had CMV and parvovirus). The control group had 193 cases and 197 samples: amniotic fluid for karyotyping in pregnant women with advanced age (n = 44); blood samples (n = 150), and fragments of placentas (n = 3) of pregnant women with normal prenatal care, at delivery. In this group, two amniotic fluid samples were positive (1.04% of total cases and 4.5% of fluids): one case of adenovirus with normal fetal karyotype, and one case of T. gondii with increased nuchal translucency and trisomy 21 (Down syndrome). In this control group, 13/ 193 fetal karyotypes were altered (6.7%). The lack of similar studies made it difficult to compare the results, but the multiplex-nested-PCR detected a number almost six times higher than that detected by the tests available at the participating centers. All the positive amplification products were sequencing and confirmed the results. The similarity between the amplified sequences and the GenBank prototypes varied between 95-98%. In the present study, the standardization and validation of a multiplex-nested-PCR was success, using simple and reproducible protocols, and the clustering of the seven positive controls on a single bacterial plasmid aside from the replacement of the amplification products detection by agarose gels for the capillary electrophoresis, which is faster, less expensive and has a higher degree of resolution. For the technique set up in the laboratory routine, the substitution of the sequencing as the confirmatory method for real-time amplifications with Sybr Green is required, amplifying only the pathogen that has been previously detected by the multiplex-nested-PCR.