Adipositas ist besonders in den Industrienationen ein zunehmendes gesellschaftliches und ökonomisches Problem. Dabei sind vor allem die kardiovaskulären und metabolischen Begleiterkrankungen von entscheidender Bedeutung. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass verschiedene Adipozyten- und Hepatozyten-sezernierte Proteine Mediatoren von Insulinresistenz und Dyslipidämie darstellen. Kürzlich wurde Angiopoietin-related growth factor (AGF) als ein neues, von der Leber produziertes Protein, das potentiell Insulinresistenz und Adipositas antagonisiert, vorgestellt. Im Mausmodell waren AGF-überexprimierende Tiere schlanker und insulinsensitiver verglichen zu Kontrolltieren. Zudem entwickelten AGF-knockout-Mäuse eine Adipositas, Insulinresistenz sowie eine Leber- und Skelettmuskelverfettung. Weiterhin fand sich in epidermalen Keratinozyten eine Hypervaskularisierung bei transgenen Mäusen mit AGF-Expression. Dies macht AGF möglicherweise zu einem Zielgen in der Behandlung moderner Zivilisationskrankheiten, wie z.B. dem Diabetes mellitus Typ 2 (DMT2). Bisherige Publikationen über AGF basieren zumeist auf Tiermodellen. Über die Regulation beim Menschen existieren dagegen bislang nur wenige Studien. In der vorliegenden Arbeit wurde AGF im Serum verschiedener Patientenpopulationen mit einem erhöhten kardiovaskulären Risikoprofil (Patienten mit chronischer Dialysepflicht, DMT2, Präeklampsie [PE]) mittels enzyme-linked immunosorbent assay quantifiziert und mit Kontrollpatienten verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass AGF bei Patienten mit DMT2 im Vergleich zu Nichtdiabetikern signifikant erhöht ist. Bei terminal-niereninsuffizienten Patienten dagegen fanden sich signifikant niedrigere AGF-Konzentrationen im Serum. Bei PE-Patientinnen waren signifikant höhere AGF-Spiegel nachweisbar verglichen zu gesunden schwangeren Kontrollen. Die vorgestellten Daten weisen darauf hin, dass erhöhte AGF-Spiegel bei DMT2 und PE eine physiologische Gegenregulation darstellen könnten, die der Insulinresistenz bei DMT2 bzw. antiangiogenetischen Faktoren bei PE entgegenwirkt. Alternativ wäre – ähnlich der Insulinresistenz – eine Resistenz von Patienten mit DMT2 bzw. PE gegen AGF möglich mit einer reflektorischen Erhöhung dieses Hepatozyten-exprimierten Faktors. Die genaue Rolle von AGF bei kardiovaskulären Risikopatienten muss in zukünftigen Arbeiten noch weiter aufgeklärt werden.

Angiopoietin-1 (Ang-1), the main ligand for the endothelial cell (EC)-selective Tie-2 receptors, promotes survival, proliferation, migration and differentiation of these cells. Despite its importance in various aspects of vascular biology, the mechanisms of action of the Ang-1/Tie-2 receptor pathway have not been fully explored. / To identify the downstream modulators of Ang-1, we evaluated changes in the transcriptome of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) treated with Ang-1 protein for four hours by employing the oligonucleotide rnicroarray technology. Eighty-six genes were significantly upregulated by this treatment and forty-nine genes were significantly downregulated. These genes are involved in the regulation of cell cycle, proliferation, apoptosis, transcription and differentiation. Furthermore, we found that the Erk1/2, PI3-Kinase and mTOR pathways are implicated in promoting gene expression in HUVECs in response to Ang-1. Analysis of the microarray data employing the Ingenuity Pathways analysis software to place the regulated genes in the context of biological networks revealed several highly connected nodes including the chemokine Interleukin-8 (IL-8) and the transcription factor Early growth response-1 (Egr-1). Due to the importance of these genes in promoting angiogenesis, we decided to evaluate their roles in Ang-1/Tie-2 receptor signaling and biological effects. / Ang-1 induced IL-8 expression in a time- and dose-dependent manner in ECs through both transcriptional and post-transcriptional mechanisms. To study the functional role of Ang-1-induced IL-8, we generated HUVECs that overexpress Ang-1. In these cells, neutralizing IL-8 significantly reduced EC proliferation and migration. IL-8 promoter activity experiments and gel shift assays revealed the involvement of the transcription factor AP-1 in Ang-1-induced IL-8. Ang-1 stimulated the phosphorylation of c-Jun through activation of Erk1/2, JNK and PI-3 kinase pathways. Similarly, Ang-1 provoked the expression and DNA binding of Egr-1 in HUVECs. Employing siRNA and DNAzyme to specifically knock-down Egr-1, we found that Ang-1-induced Egr-1 also promotes EC proliferation and migration. / We conclude that Ang-1 provokes a coordinated response intended to promote EC survival, proliferation, and angiogenesis and to inhibit EC apoptosis. Ang-1 induces EC proliferation and migration in part through the secretion of the soluble mediator Interleukin-8 and through induction of the transcription factor Egr-1.

Neovascularization, or the formation of blood vessels, is important in both normal physiological processes as well as pathophysiological processes. The main players in neovascularization, endothelial cells (EC), are highly influenced by hemodynamic shear stress and this may play an important role in neovascularization. Two typical types of shear stress found in the vascular system are a unidirectional laminar shear stress (LS) found in straight regions and a disturbed, oscillatory shear stress (OS) found at branches or curves. At the cellular level, LS is thought to promote EC quiescence whereas OS is thought to promote EC dysfunction. Oscillatory sheared EC are pro-proliferative, pro-migratory, and secrete growth factors, all functions important in neovascularization. There are several diseases that involve both disturbed shear stress and neovascularization, such as atherosclerosis, aortic valve disease, and occlusive vascular disease. In these pathophysiological scenarios fluid shear stress may provide a driving force for neovascularization. Therefore, we hypothesized that oscillatory shear stress promotes greater neovascularization compared to unidirectional laminar shear stress through the secretion of angiogenic factors, which play a physiological role in neovascularization in vivo. To test this hypothesis, we first performed tubule formation and migration assays, two important functions in neovessel formation. We found that OS promotes greater tubule formation and migration of EC as compared to LS and this was mediated through secreted factors. Using gene and protein array analysis, we identified Angiopoietin-2 (Ang2) as being upregulated by OS compared to LS in EC. We found that inhibiting Ang2 blocked OS-mediated tubule formation and migration and that LS-inhibited tubule formation could be rescued by addition of Ang2. In addition, Ang2 was found to be upregulated at sites of disturbed flow in vivo, implicating a physiological role for Ang2. To further investigate the physiological role of Ang2 in neovascularization, we examined the effects of inhibiting Ang2 in a mouse model of hindlimb ischemia, which involves both disturbed flow and neovascularization. We found that Ang2 was upregulated in the ischemic adductor muscle suggesting that it plays a role in recovery during hindlimb ischemia. In addition, we found that inhibiting Ang2 decreased blood flow recovery. Ang2 inhibition resulted in decreased smooth muscle cell coverage of vessels as well as decreased macrophage infiltration. These findings suggest that Ang2 promotes blood flow recovery through the recruitment of smooth muscle cells and formation of collaterals, as well as the recruitment of macrophages that secrete important growth factors and help degrade the extracellular matrix in order for neovascularization to occur. In conclusion, this work illustrates the shear stress regulation of neovessel formation through the expression of Ang2, and the role of Ang2 in neovascularization in vivo. By understanding how angiogenic factors are regulated and what role they play in vivo, we can better understand human disease and develop important therapeutic targets.

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L’angiogenèse est le processus biologique par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins se forment à partir du réseau vasculaire pré-existant. Sa première étape, l’activation endothéliale, est caractérisée par la prolifération des cellules endothéliales, la sécrétion de facteurs pro-angiogéniques comme l’Angiopoïétine-2 (Ang-2) et la relocalisation de la nucléoline du noyau vers la surface cellulaire. Dans les vaisseaux matures, les cellules endothéliales sont quiescentes et l’endothélium est recouvert de péricytes. L’activation endothéliale induit un détachement des péricytes favorisant le remodelage du réseau vasculaire. L’objectif de cette thèse est d’étudier les mécanismes de l’activation endothéliale au cours de l’angiogenèse physiologique et d’évaluer les effets de son inhibition dans un contexte d’angiogenèse tumorale. Des études in vivo dans la rétine de souris et in vitro sur des cellules endothéliales humaines ont montré que le VEGF régule l’exocytose des Corps de Weibel et Palade (WPBs), des compartiments cytoplasmiques spécifiques des cellules endothéliales pouvant contenir de l’Ang-2. Ce travail suggère que l’exocytose des WPBs induite par le VEGF régule la sécrétion de l’Ang-2 par les cellules endothéliales activées et que l’Ang-2 sécrétée régule à son tour le recrutement des péricytes sur les vaisseaux. Le ciblage de la nucléoline dans un modèle de cancer du pancréas a inhibé l’activation endothéliale et cette inhibition a diminué la croissance et l’angiogenèse tumorales tout en favorisant le recrutement des péricytes et la normalisation des vaisseaux tumoraux. La normalisation vasculaire induite par l’inhibition de l’activation endothéliale via le ciblage de la nucléoline représente une stratégie prometteuse pour le traitement de pathologies associées à une dérégulation de l’angiogenèse comme les cancers ou les rétinopathies. / Angiogenesis is the biological process of new blood vessel formation from the pre-existing vascular network. Its first step, endothelial activation, is characterized by endothelial cell proliferation, the secretion of pro-angiogenic factors such as Angiopoietin-2 (Ang-2) and the relocation of nucleolin from the nucleus to the cell surface. In the mature vessels, endothelial cells are quiescent and the endothelium is covered by pericytes. Endothelial activation induces pericyte detachment which promotes the remodeling of the vascular network. The aim of this thesis is to study the mechanisms of endothelial activation during physiological angiogenesis and to evaluate the effects of its inhibition in a context of tumor angiogenesis. In vivo studies in mouse retina and in vitro studies on human endothelial cells showed that VEGF regulates the exocytosis of Weibel-Palade bodies (WPB), cytoplasmic compartments specific for endothelial cells that may contain Ang-2. This work suggests that the exocytosis of WPBs induced by VEGF regulates the secretion of Ang-2 by activated endothelial cells and that secreted Ang-2 regulates the recruitment of pericytes on the vessels. Nucleolin targeting in a pancreatic cancer model inhibited endothelial activation and this inhibition decreased tumor growth and angiogenesis while promoting recruitment of pericytes and normalization of tumor vessels. Vascular normalization induced by the inhibition of endothelial activation via nucleolin targeting may be a promising strategy for the treatment of pathologies associated with dysregulation of angiogenesis, such as cancers or retinopathies.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die prognostische Relevanz von Angiopoietin-2 (Ang-2) und Fibroblast Growth Factor 23 (FGF-23) als Prädiktor der 30-Tages sowie Ein-Jahres Mortalität bei Patienten im infarktbedingten kardiogenen Schock (CS) untersucht und dargestellt. Das betrachtete Patientenkollektiv dieser Substudie rekrutierte sich dabei aus den 218, im Rahmen der IABP- SHOCK II Studie in Leipzig eingeschlossenen Patienten. Nach Hospitalisierung und Randomisierung in den jeweiligen Therapiearm (IABP, Nicht-IABP) erfolgte eine prospektiv geplante Blutentnahme an den Tagen eins bis drei. Zur laborchemischen Bestimmung der Serum-, beziehungsweise Plasma Proteinkonzentration mittels ELISA von Ang-2 standen 189, für das Phosphathormon FGF-23 182 Blutproben zur Verfügung. Die 30-Tages Mortalität der untersuchten Substudien-Kohorte betrug 40%, die Ein-Jahres Mortalität 57%. Die vorliegende Arbeit bestätigt Ang-2 als einen starken und unabhängigen negativen Prädiktor des Kurz- und Langzeitverlaufs bei Patienten im CS auf Grund eines akuten Myokardinfarks. Weiterhin zeigt die Auswertung, dass die prognostische Relevanz des betrachteten Biomarkers im zeitlichen Verlauf signifikant zunimmt und verschiedene klinische Parameter wie beispielsweise eine akut eingeschränkte Nierenfunktion oder Blutungskomplikationen unabhängig mit erhöhten Ang-2 Konzentrationen assoziiert sind. Somit sind im infarktbedingten CS hohe Werte von Ang-2 unabhängig mit einem schlechteren klinischen Verlauf des Patienten, sowie dem Reperfusionserfolg und weiteren Komplikationen assoziiert. Patienten der Substudien-Kohorte im infarktbedingten CS waren durch signifikant erhöhte Konzentrationen von FGF-23 charakterisiert. Weiterhin zeigte sich, dass diese signifikant erhöhten Werte unabhängig mit einer deutlich schlechteren Prognose der 30-Tages und Ein-Jahres Mortalität verbunden sind. Diese Assoziation konnte jedoch ausschließlich bei Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion nachgewiesen werden.

Aims Cardiac dysfunction is a critical manifestation of severe sepsis/septic shock and is responsible for high mortality due to sepsis. Recent evidence suggests that angiogenic factors have a protective effect on sepsis-induced organ damage. Heat shock protein A12B (HSPA12B) is a newly discovered gene that is essential for angiogenesis. We hypothesized that overexpression of HSPA12B would induce protection against endotoxin-induced cardiac dysfunction.Methods and results To evaluate this hypothesis, we generated transgenic mice overexpressing the human hspa12b gene (Tg). Wild-type (WT) littermates served as controls. Tg and WT mice were treated with lipopolysaccharide (LPS) and cardiac function was measured after 6 h. LPS treatment caused cardiac dysfunction in WT mice. In contrast, cardiac function was significantly preserved in Tg mice following LPS administration. LPS increased the expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)/intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and leucocyte infiltration into the myocardium of WT mice. In Tg mice, LPS-increased VCAM-1/ICAM-1 expression and leucocyte infiltration were significantly attenuated. Overexpression of HSPA12B also prevented the decrement in the activation of phosphatidlyinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signalling in the myocardium. Importantly, PI3K inhibition with Wortmannin abolished the protection of HSPA12B against LPS-induced cardiac dysfunction. Conclusion These results suggest that HSPA12B plays an important role in the attenuation of endotoxin-induced cardiac dysfunction and that the mechanisms involve the preserved activation of PI3K/Akt signalling, resulting in attenuation of LPS-increased expression of VCAM-1/ICAM-1 and leucocyte infiltration into the myocardium.

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De par sa présence dans tous les vaisseaux sanguins, l'endothélium joue un rôle clef dans le processus d’hémostase, tant par sa libération de facteurs anticoagulants que par ses changements protéiques qui permettent à l’organisme de déclencher la réparation tissulaire. La fonction anticoagulante de l’endothélium peut être mise en défaut en cas d’atteinte de son intégrité, entrainant la formation de thrombus, le rejet précoce de greffes ou encore l’induction de l’athérosclérose. L’intégrité de l’endothélium est donc capitale pour la prévention de nombreuses maladies cardiovasculaires. Chez l’adulte, les cellules endothéliales (CE), normalement quiescentes, sont rapidement activées en cas d’hypoxie ou d’inflammation, leur permettant ainsi d’amorcer le processus angiogénique comme suit: Tout d’abord, l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire permet l’extravasation des protéines plasmatiques. Ensuite, la dégradation de la lame basale par des métalloprotéases permet aux CE de se détacher, de proliférer, de migrer et de s’organiser pour former l’ébauche du futur vaisseau. La dernière étape consiste en la maturation du vaisseau, c’est-à-dire son recouvrement par des cellules murales, telles que les cellules musculaires lisses et les péricytes. Ces processus sont régulés par de nombreux facteurs angiogéniques tels que les membres de la famille Notch, du vascular endothelial growth factor (VEGF), du fibroblast growth factor (FGF), des angiopoïétines, et des matrix metalloproteases (MMP). L’angiogenèse pathologique, soit une insuffisance ou un excès de vascularisation, est impliquée dans les blessures chroniques, les accidents cardiovasculaires, les pathologies coronariennes artérielles, les pathologies tumorales, l’arthrite rhumatoïde, la rétinopathie diabétique, l’athérosclérose, le psoriasis et l’asthme. Ces pathologies sont souvent issues d’une dérégulation de l’activité endothéliale, fréquemment observée conjointement à l’expression continue de molécules d’adhésion leucocytaires, à l’augmentation de la perméabilité vasculaire, et aux anomalies de la vasoréactivité. L’activation non-contrôlée de l’endothélium entraîne ainsi une inflammation chronique et la formation de structures vasculaires anarchiques. Les premiers leucocytes à répondre à l’appel inflammatoire sont les neutrophiles. Equippées d’une panoplie de produits antibactériens puissants mais aussi nocifs pour les tissus qui les entourent, ces cellules polylobées participent à chaque étape du processus inflammatoire, depuis l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire jusqu’à la résolution. En effet, grâce à leurs récepteurs, les neutrophiles détectent et interprètent les signaux biochimiques présents dans la circulation et à la surface de l’endothélium, et libèrent aussi leurs propres médiateurs tels le VEGF, les MMP, et l’interleukine-8 (IL-8), dont les effets sont à la fois paracrines et autocrines. Existent-ils d’autres modulateurs typiques de la fonction endothéliale capables d’influencer le comportement des neutrophiles? En effet, notre laboratoire a démontré que chez l’humain, une stimulation directe aux angiopoïétines incitait les neutrophiles à adhérer aux CE, à migrer, à synthétiser et à relâcher l’IL-8, voire même à vivre plus longtemps. La présence du récepteur des angiopoïétines, Tie2, à la surface des neutrophiles laisse présager que la famille possèderait d’autres fonctions leucocytaires encore non-identifiées. Par ailleurs, dans un modèle classique de l’angiogenèse in vivo (matrigel), nous avons observé que sous l’effet du FGF1 et 2, les ébauches des nouveaux vaisseaux étaient parfois accompagnées d’une infiltration de cellules granulocytaires. Ainsi, en partant de ces observations, l’objectif de nos études (présentées ci-après) était d’approfondir nos connaissances sur la relation entre neutrophiles et facteurs angiogéniques, notamment les FGF et les angiopoïétines. Par tests in vitro, nous avons confirmé que les neutrophiles humains exprimaient plusieurs récepteurs du FGF (FGFR1-4) d’une façon hétérogène, et qu’ils migraient vers un gradient des ligands FGF1 et 2. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux voies de signalisation inflammatoires activées par les ligands FGF1, FGF2, Ang1 et Ang2. Grâce à une stratégie génique ciblant 84 gènes inflammatoires, nous avons identifié plusieurs cibles d’intérêt touchées par Ang1, dont certains membres de la famille de l’IL-1, alors qu’aucun des gènes testés n’avait changé de façon significative sous l’effet des FGF ou d’Ang2. Suite à des cinétiques approfondies, nous avons démontré qu’Ang1 stimulait la transcription de l’ARN messager de l’IL-1β, et augmentait simultanément la quantité de protéine immature (pro-IL-1β; inactive) et clivée (IL-1β « mature »; active). En parallèle, Ang1 augmentait la sécrétion de l’antagoniste naturel de l’IL-1β, l’IL-1RA, sans pour autant stimuler la relâche de l’IL-1β. A l’instar des endotoxines bactériennes dont les effets liés à l’IL-1 dépendaient de la kinase p38, ceux d’Ang1 découlaient presque entièrement des voies de signalisation du p42/44. / Endothelial cells (ECs) form a monolayer that lines the inside of all blood vessels; thus, as the first barrier that separates blood elements from all things that fall beyond the blood vessel, ECs are strategically placed to play a central role in many essential physiological processes. While it is found mostly in a quiescent state in adult organisms, the endothelium retains a high level of plasticity that allows it to react to stimulus and dynamically control the passage of blood components to and from the bloodstream. For instance, upon detecting an activating angiogenic signal, ECs forgo their quiescence and undergo biochemical and structural changes necessary for the initiation of angiogenesis. Thus, activated ECs down-regulate their own expression of junctional molecules and secrete proteins to digest the extracellular matrix (ECM), thereby giving them the space to proliferate and migrate. Relaxing endothelial junctions also increases permeability, opening up the doorway for leukocyte infiltration. These cells can then modulate angiogenesis via their own set of mediators. Though the instigating stimuli may differ, the biochemical sequence of events that initiates angiogenesis is also common to the inflammatory response. In the latter case, changes in EC biochemistry include the release of chemotactic agents and expression of surface adhesion molecules, increasing the efficiency of leukocyte infiltration, particularly those of the myeloid lineage. Evidently, because angiogenesis and inflammation can be initiated by the same sequence of events, they will inevitably share effector molecules. Of the recruited leukocytes, neutrophils are generally the first responders at the site of inflammation, contributing mediators that propagate and eventually resolve inflammation. We and other groups have shown that endothelial modulators such as angiogenic growth factors exert a direct action on neutrophil activity independently of the presence of the endothelium. In particular, our laboratory has shown that members of the angiopoietin family and their receptor Tie2 are expressed by neutrophils and are capable of activating neutrophil intracellular signalling pathways that impact their survival, adhesion, migration, and protein production. The ability of angiopoietins to directly engage neutrophils illustrates an intimate link between angiogenesis and inflammation, and provides an explanation for why vascular pathologies are often accompanied by an exacerbated inflammatory response. In the studies presented herein, we sought to expand our understanding of the relationship between angiogenic growth factors and neutrophil behavior. In a pilot experiment using in vivo subcutaneous matrigel plugs, short-term treatment with fibroblast growth factors (FGF) 1 and 2 resulted in significant neovascularization; interestingly, the tissues surrounding the matrigel plug showed an increase in polymorphonuclear cell infiltration. Encouraged by the paucity of information in the literature regarding FGF-neutrophil interaction, we looked at the expression of FGF receptors (FGFRs) on neutrophils from different human donors, as well as the ability of FGFs to induce neutrophil chemotaxis. We demonstrated that the expression of FGFR was strongly dependent on genetic background: Overall, FGFR2 showed the highest incidence as a neutrophil cell-surface receptor, but none of the receptors were universally or uniformly expressed. Despite the genetic factor, neutrophils migrated in response to both FGF1 and FGF2 in vitro, suggesting that other neutrophil adaptors may be engaging FGFs. Given the shared ability of FGFs and angiopoietins (Ang) to induce neutrophil migration, we performed a wide-scale RNA assay to determine which genes were being engaged by the main ligands of both families. While none of FGF1, FGF2 or Ang2 had a strong effect on the 84 inflammatory cytokine genes tested (FGFs - unpublished data, 2011), at least two target genes belonging to the interleukin-1 (IL-1) family were significantly upregulated following Ang1 treatment. Further analysis showed that Ang1 not only stimulates gene transcription, but also translation and processing of the precursor of IL-1β (pro-IL-1β), and both precursor and mature proteins accumulate in the cell simultaneously. Interestingly, although no IL-1β is secreted from neutrophils after Ang1 or endotoxin (LPS) treatment, substantial quantities of the naturally occurring IL-1β antagonist (IL-1RA) are released, thereby tipping the balance in favor of inhibiting IL-1β activity. Finally, the activities of Ang1 on IL-1β and IL-1RA production and/or release are largely mediated by p42/44 MAPK; in contrast, the effects of LPS are driven by recruitment of p38.

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