Les thérapies anticancéreuses nécessitent aujourd’hui une approche plus ciblée. L’approche immunologique est devenue dans cette optique un enjeu d’importance notamment grâce à sa capacité d’atteindre de manière plus spécifique des cibles tumorales. Récemment, mon équipe a identifié des peptides antigéniques issus de la préprocalcitonine (ppCT), qui étaient capables d’induire une réponse T cytotoxique spontanée chez un patient atteint de cancer bronchique non à petites cellules bénéficiant d’une longue survie et correspondent donc à des candidats potentiels dans des approches vaccinales. Dans ma thèse, je fournis une preuve de concept préclinique pour un vaccin fondé sur la ppCT à usage thérapeutique contre le cancer du poumon. Cette approche est optimisée en la combinant avec un anticorps monoclonal anti-PD- 1. En plus, j'ai identifiée de nouveaux épitopes issus de cet antigène et j'ai construit un lentivirus codant la ppCT pour des perspectives thérapeutiques. / Cancer therapies today require a more targeted approach to optimize the anti-tumor response. In this context, the immunological approach has become an important issue, mostly through the identification of specific tumor-associated antigens (TAA). Recently, my team identified new tumor antigens derived from the preprocalcitonin (ppCT) which were able to induce a spontaneous cytotoxic T-cell response with long term survival in patients with non-small cell lung cancer and therefore correspond to be potential candidates for vaccine approaches. In my thesis, I provide a preclinical proof of concept for the ppCT peptide vaccine for the therapeutic use against lung cancer which is optimized by combining the treatment with the monoclonal antibody anti-PD-1, nivolumab. In addition, I identified new epitopes from this Ag and constructed a lentivirus encoding ppCT for further therapeutic perspectives.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20254号 / 医博第4213号 / 新制||医||1020(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武藤 学, 教授 川上 浩司, 教授 生田 宏一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La survie des patients atteints de cancer et traités avec des thérapies conventionnelles reste faible dans plusieurs types de tumeurs. Récemment, une nouvelle approche immunothérapeutique a été développée pour cibler le système immunitaire au lieu de la tumeur elle-même, afin de restaurer la fonctionnalité des cellules immunitaires et la destruction des cellules cancéreuses. L’immunothérapie ciblant le récepteur inhibiteur PD-1 occupe une place privilégiée dans les thérapies anticancéreuses en raison de sa haute spécificité et de sa faible toxicité par rapport aux thérapies conventionnelles. Cependant, le taux de réponse reste faible avec seulement 20 à 25% de patients répondant à une immunothérapie anti-PD-1. Il est donc important de comprendre les mécanismes associés à la résistance à ces thérapies et d’identifier des biomarqueurs prédictifs de réponse. L'expression du ligand de PD-1, PD-L1, sur les cellules tumorales, la charge mutationnelle tumorale et l'infiltration tumorale par les lymphocytes ont déjà été décrits, mais de nouveaux biomarqueurs sont nécessaires pour mieux déterminer la sous-population de patients susceptible de bénéficier de ces traitements. Au cours de ce travail, nous avons établi une cohorte de 118 patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules (CBNPC) traités avec une immunothérapie anti-PD-1/PD-L1, et nous avons étudié l'expression de plusieurs biomarqueurs potentiels, en particulier les cellules T mémoires résidentes dans le tissu (TRM) CD8+CD103+. Ces cellules constituent un candidat potentiel car elles représentent une population privilégiée de lymphocytes T CD8 grâce à l’expression de PD-1 et une forte capacité cytotoxique vis-à-vis des cellules tumorales autologues suite à la neutralisation de l’interaction de PD-1 avec PD-L1. Nous montrons qu’une forte infiltration de tumeurs de CBNPC avec des cellules TRM corrèle à une survie sans progression plus élevée (PFS) et une réponse plus efficace à anti-PD-1 que les tumeurs avec une faible infiltration par des TRM. De plus, les tumeurs qui expriment fortement ICAM-1, un ligand de l’intégrine LFA-1 exprimée sur les lymphocytes T CD8, sont hautement infiltrées par des TRM. Par ailleurs, il est bien connu que le signal TGF-β est crucial pour l’induction de CD103 et la formation de TRM CD8+CD103+. Je me suis donc intéressée à l'activation du TGF-β par les intégrines αV exprimée par les cellules tumorales humaines et murines. À l'aide des modèles in vitro et in vivo, nous montrons que les cellules tumorales exprimant les intégrines αV activent le TGF-β et induisent l'expression de CD103 à la fois par les cellules T CD8+ provenant de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL). L’expression plus faible de CD103 par les TIL CD8+ de souris greffées avec des tumeurs déficientes pour l’expression d'αV n'a pas d'effet sur le contrôle de la croissance tumorale. De manière intéressante, nous montrons dans des modèles de tumeurs déficientes pour l’expression d’αV, que le traitement avec des anticorps anti-PD-1 bloquants corrèle avec un meilleur contrôle de la croissance tumorale et une meilleure réponse à l'immunothérapie anti-PD-1 qui sont associés à une infiltration plus forte de TIL et un état d'activation plus élevé des TIL CD8+ exerçant une activité cytotoxique spécifique. De plus, une expression élevée de l'intégrine αV dans les tumeurs corrèle avec une réponse plus faible des patients atteints de CBNPC à une immunothérapie anti-PD-1/PD-L1. Ces données montrent comment trois marqueurs distincts, cellules TRM, ICAM-1 et les intégrines αV, régulent le microenvironnement tumoral et l’immunité T CD8 avec des implications potentielles pour potentialiser les réponses aux immunothérapies. / The survival of cancer patients treated with conventional therapies remains low in multiple cancers. Recently, a new immunotherapeutic approach has been developed to target the immune system instead of the tumor itself, in order to restore immune cell functions in cancer destruction. Immunotherapy targeting the T cell inhibitory receptor PD-1 occupies a privileged place in cancer therapy thanks to its high specificity and low toxicity compared to chemotherapies. However, the response rate remains low with only 20-25% of patients responding to anti-PD-1 immunotherapy. An important issue is therefore to understand the mechanisms associated with resistance to these therapies and to identify the predictive biomarkers of response. The expression of the PD-1 ligand, PD-L1, on tumor cells, tumor mutational burden (TMB) and tumor infiltration by lymphocytes have been described to predict the response to immune checkpoint blockade (ICB). However, new biomarkers are needed to better determine patient subpopulation which could benefit from this treatment. To address this question, we established a cohort of 118 non-small cell lung cancer (NSCLC) patients treated with anti-PD-1/PD-L1 immunotherapy and studied the expression of several potential biomarkers. Tissue-resident memory T (TRM) cells are a potential candidate because they represent a distinct population of CD8+ T cells highly expressing integrin αEβ7 (CD103) and PD-1; and showing strong cytotoxic capacity towards autologous tumor cells upon neutralisation of PD-1/PD-L1 interaction. Results from the present study show that high infiltration of TRM cells in NSCLC tumors correlates with higher progression-free survival (PFS) and a better response to anti-PD-1/PD-L1 immunotherapy. Moreover, tumors with high expression levels of ICAM-1, the ligand of integrin LFA-1 expressed on T cells, show higher TRM infiltration. TGF-β is a cytokine directly involved in CD103 induction on activated tumor-specific T cells. Therefore, I also investigated the role of αV integrins in activating TGF-β and thereby in controlling TRM differentiation and anti-tumor T cell immunity. Using human and mouse models, we show that tumor cells expressing αV integrins activate TGF-β, which can in turn induce expression of CD103 on CD8+ T cells in vitro on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and in vivo on tumor infiltrating lymphocytes (TIL). However, lower CD103 expression on CD8+ TIL and thus CD103+ TRM cell formation in C57BL/6 mice engrafted with αV-lacking cancer cells had no effect on tumor growth control. Remarkably, αV-deficient tumors responded more effectively to anti-PD-1 immunotherapy than αV-efficient tumors and this response correlates with higher tumor infiltration by activated CD8+ T cells and stronger cytotoxic activity toward autologous cancer cells. Moreover, high expression of αV integrins in NSCLC tumors correlates with worse response to anti-PD-1/PD-L1 immunotherapy. These data show how three distinct markers, TRM cells, ICAM-1, and αV integrins regulate the tumor microenvironment and CD8+ T cell immunity, with potential implications in improving response to ICB immunotherapies.

Le mélanome métastatique reste un enjeu majeur de santé publique. Les avancées fulgurantes de ces dernières années ont permis d’améliorer la prise en charge thérapeutique, notamment avec l’arrivée des anticorps bloquant ou agonistiques ciblant les molécules de co-inhibition ou de co-stimulation. Cependant, certains patients sont réfractaires à tout traitement. Il est donc nécessaire de mettre en évidence l’importance de certains paramètres immunologiques permettant d’améliorer le suivi des patients de stade III à haut risque de récidive. De plus, il est primordial de découvrir des marqueurs prédictifs associés à la réponse à ces différents traitements immunomodulateurs. Nous avons identifié une association entre une fréquence élevée de CD45RA+CD4+ et de CD3-CD56- au sein des métastases ganglionnaires avec la survenue d’une récidive anticipée.Une forte expression de NKG2D à la surface des lymphocytes T CD8+, une faible proportion de Tregs ou une faible expression de PD-L1 à la surface des T circulants sont associées à une meilleure survie. Aussi, la mise en place d’un test in-vitro étudiant les réactivités fonctionnelles des lymphocytes infiltrant les tumeurs a permis de dégager l’importance de l’expression de CD95/Fas sur les T CD4+ circulants et de CD137/4-1BB sur les T CD8+ circulants dans la prédiction de la réponse à l’ipilimumab (anti-CTLA-4) et à la combinaison ipilimumab + nivolumab (anti-PD-1). Par ailleurs, le pattern d’expression des récepteurs de chimiokines à la surface des lymphocytes T périphériques permet de détecter les localisations métastatiques de mélanome. Cette étude a révélé également l’importance biologique de l’axe CCR9/CCL25 dans l’immunosurveillance naturelle anti-tumorale. / Metastatic melanoma (MM) is an unmet medical need. The development of immune checkpoint blockers (ICB) improved patient’s clinical outcomes. However, some patients still do not respond to these therapies. To adress these issues, we must find some immunological parameters which predict the relapse of high risk resected stage III melanoma patients. Moreover, it is an urgent need to identify some predicting parameters to these ICB. In our studies, high frequencies of CD45RA+CD4+ and CD3-CD56- in metastatic lymph nodes are associated with a short relapse-free survival. Higher expression of NKG2D on CD8 T cells, low Tregs and low PD-L1 expression on circulating T cells are associated with a prolonged overall survival.Furthermore, we designed an in-vitro test to assess intratumor lymphocytes reactivities to ICB and cytokines (IL-2 and IFNα2a). Low expression of CD95/Fas on CD4+ circulating T cells and high expression of CD137/4-1BB on circulating CD8+ T cells are associated with the response to ipilimumab (anti-CTLA-4) and to the combination ipilimumab + nivolumab (anti-PD-1), respectively. In addition, the chemokine receptor pattern expressed at the surface of circulating lymphocytes could predict the metastatic spreading of melanoma. In this last study, we demonstrated the critical role of CCR9/CCL25 pathway in the natural anti-cancer immune surveillance.

Biological activity of IL-2 and IL-7 in vivo is significantly increased when complexed with some of the respective anti-cytokine mAb. Different immune cell subsets can be preferentially stimulated depending on the anti-IL-2 mAb used to complex IL-2. IL-2/anti-IL-2 mAb S4B6 immunocomplexes (IL-2/S4B6) induce preferential expansion of CD122high cells whereas IL-2/anti-IL-2 mAb JES6-1 immunocomplexes (IL-2/JES6-1) highly selectively stimulate CD25high cells in mice. Similarly, IL-7/anti-IL-7 mAb M25 immunocomplexes (IL-7/M25) possess higher stimulatory activity for both naïve and memory CD8+ T cells in vivo in comparison to free IL-7. CTLA-4 and PD-1 molecules are inhibitory receptors which negatively regulate proliferation, survival and effector functions of T cells. Blocking antibodies against these molecules represent promising immunotherapeutic tool for treatment of malignant diseases. We examined possible synergism of IL-2/S4B6 and αCTLA-4 plus αPD-1 mAbs in tumor-bearing mice. We found that the expansion of recently activated CD8+ T cells driven by IL-2/S4B6 was further augmented by αCTLA-4 plus αPD-1 mAbs. However, these two immunotherapeutic approaches did not show synergistic antitumor activity in any mouse tumor model tested. Next, we showed that IL-7/M25 possessed higher biological activity...

PD-1 (Programmed Cell death protein -1) est un récepteur co-inhibiteur exprimé à la surface de lymphocytes T (LT) activés. Ce récepteur joue un rôle important dans le maintien de la tolérance périphérique tout en protégeant contre les maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, une expression élevée et permanente de PD-1 et ses ligands PD-L1 et PD-L2 (PD-Ls) perturbe la réponse immunitaire contre les pathogènes et les cellules tumorales. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) ciblant l'axe PD-1/PD-Ls représentent aujourd’hui une avancé majeure dans le traitement de différents types de cancer, tant sur le plan de l’efficacité que de la tolérance. Le nivolumab (nivo) et le pembrolizumab (pembro) sont deux anticorps monoclonaux (AcM) anti-PD-1 qui bloquent l’interaction de PD-1 avec ses ligands. Ces AcM ont montré des résultats prometteurs dans le traitement de multiples types de cancers comme le mélanome, le cancer bronchique non à petites cellules, le carcinome à cellules rénales, etc. Malgré l’importance thérapeutique de nivo et de pembro dans le cancer, aucune étude n’a défini le devenir de PD-1 après la liaison à ces deux AcM. L’objectif de cette étude a été donc d’évaluer l’endocytose de PD-1 suite au liaison à des AcM anti-PD-1 (clone J110, nivo, pembro) et de déterminer s’il y a différence entre nivo et pembro vis à vis leur capacités à induire l'internalisation de PD-1. L’étude de l’endocytose de PD-1 a été réalisé sur des LT humains obtenus à partir du sang périphérique de donneurs sains et activés avec des Ac anti-CD3/anti-CD28 ou concanavaline A afin d’exprimer le récepteur PD-1. L’analyse des données par cytométrie en flux a montré que l’engagement de PD-1 avec l’Ac anti-PD-1 (clone J110) induit son endocytose dans les LT humains et que 50% de la totalité de PD-1 de surface est internalisé dans les premiers 30 minutes suivant l’incubation de cellules à 37°C, suivi d’un taux d’endocytose plus lent (56% en 60min). Notre étude a montré également que la liaison de nivo et de pembro au PD-1 induit son endocytose et que la plupart de récepteur est internalisée dans les 30 min suivant l’incubation de cellules à 37°C. Toutefois, 32 à 50% des récepteurs sont résistants à l’endocytose. L’analyse comparative de nivo et de pembro a révélé une différence statistiquement significative (p=0.03) entre le taux d’internalisation du complexe PD-1/nivo et celui du PD-1/pembro (46% versus 25% en 30min, respectivement). Même à des concentrations élevées de pembro, la liaison de nivo induit une meilleure internalisation de PD-1, ce qui suggère que nivo pourrait être plus efficace. Bien que les ICI comme nivo et pembro sont connus de bloquer l’interaction de PD-1 avec ses ligands, PD-L1 et PD-L2, notre étude a montré pour la première fois que ce deux AcM induisent aussi l’endocytose du récepteur PD-1 dans les LT humains avec des taux différents, et que 32% à 50% de récepteurs PD-1 sont résistants à l’endocytose. Ces résultats pourraient être exploités pour améliorer l’internalisation de PD-1 dans les LT humains et par la suite augmenter les potentiels thérapeutiques de nivolumab et de pembrolizumab dans le traitement du cancer. Mots clés : Récepteur PD-1, Ligands de PD-1, Lymphocytes T, Inhibiteurs de point de contrôle immunitaires, Anticorps anti-PD-1, Nivolumab, Pembrolizumab, Endocytose, Cancer / PD-1 (Programmed Cell death protein -1) is a co-inhibitory receptor expressed on the surface of activated T cells. It plays an important role in maintaining peripheral tolerance and protecting against autoimmune and inflammatory diseases. However, permanent expression of PD-1 and its ligands PD-L1/ PD-L2 (PD-Ls) disrupts the immune response against pathogens and tumor cells. Immune checkpoint blockade (ICB) targeting the PD-1/PD-Ls axis has revolutionized the treatment of many cancers. Nivolumab (nivo) and pembrolizumab (pembro) are two anti-PD-1 monoclonal antibodies (mAb) that block the interaction between PD-1 and its ligands. They have shown promising results in the treatment of multiple types of cancers such as melanoma, non-small cell lung cancer, renal cell carcinoma, etc. Surprisingly, despite the success of anti-PD-1 in cancer immunotherapy, no-one has defined the destiny of surface PD-1 following antibody binding. Therefore, the objective of my master thesis was to define the fate of surface PD-1 following antibody binding and whether different anti-PD-1 Abs in the clinic differ in their ability to induce PD-1 endocytosis. The study of PD-1 endocytosis was performed on human T lymphocytes obtained from peripheral blood of healthy donors and activated with anti-CD3/anti-CD28 Ab or concanavalin A to express PD-1 receptor. Data analysis by flow cytometry showed that following anti-PD-1 Ab binding, 50% of PD-1 becomes endocytosed by 30min. In addition, we found that the PD-1 receptor is internalised upon its engagement with nivo and pembro and that most of the receptor is endocytosed within 30 min. However, 32 to 50% of the receptors are resistant to endocytosis. The comparative analysis of nivo and pembro has revealed a statistically significant difference (p=0.03) between the internalisation rate of the PD-1/nivo complex versus PD-1/pembro (46% versus 25% by 30min, respectively). Even at high concentrations of pembro, nivo induces better internalization of PD-1, suggesting that nivo could be more effective than pembro. Our study showed for the first time that ICB involves not only in the blockade of PD-1/PD-Ls interaction, but also in the endocytosis of PD-1 receptors from the surface of human T-cells, which differs between nivolumab and pembrolizumab. These results could be exploited to increase the therapeutic potential of nivolumab and pembrolizumab in cancer treatment. Keywords: PD-1 receptor, PD-1 ligands, T lymphocytes, Immune checkpoint blockade, Anti-PD1 antibodies, Nivolumab, Pembrolizumab, Endocytosis, Cancer

Many studies show the ability of gut microbes to modulate the anti-tumour immune response by direct triggering the immune cells or by bacterial metabolites. Interestingly bacteria may even migrate to the tumour tissue and orchestrate the immune response on site. These anti-tumour effects can be improved by the administration of immune checkpoint inhibitors (ICI). Notably, some microbial effects occur only in the presence of ICI. On the contrary, microbiota may also promote tumour growth and negatively impact the effects of ICI therapy. We have disrupted the gut microbiota homeostasis by antibiotics (ATB) to study the effects of gut microbiota on the ICI. This disturbance led surprisingly to reduced tumour growth and enhanced pro-inflammatory immune response not only in the gut but also within the tumour tissue, where especially IFN-γ orchestrated the anti-tumour immune response. Importantly the anti-tumour immune response could be transferred through colonisation of germ-free mice by ATB-changed gut microbiota if concomitantly anti- programmed cell death protein 1 (αPD-1) monoclonal antibody was administrated. These mice had elevated levels of segmented filamentous bacteria (SFB), which induced systemic immune response with increased expression of IL-17 and elevated amounts of Th 17 cells,...

Les immunothérapies de type immune checkpoint blockade (ICB) ont révolutionné les approches thérapeutiques en oncologie médicale et ont largement contribué au fait que l’immunothérapie est maintenant considérée comme le quatrième pilier des traitements anticancer, aux côtés d’approches traditionnelles telles que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Malgré les résultats encourageants des études cliniques évaluant ce type d’immunothérapie, la majorité des patients décèderont des suites de leur maladie. Conséquemment, le domaine de recherche visant à comprendre les mécanismes de résistance aux immunothérapies est en expansion constante. Plusieurs stratégies visant à améliorer les issues cliniques ont été proposées, parmi lesquelles figurent: 1) la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques dans le microenvironnement immun tumoral et; 2) les études de combinaisons thérapeutiques où une immunothérapie est jumelée à d’autres types de modalités thérapeutiques potentiellement synergiques. Chacune des études présentées dans cette thèse de recherche s’apparente à l’une ou l’autre de ces stratégies. Dans le cadre de notre première étude, nous démontrons que la protéine WISP1 représente une cible prometteuse à l’intérieur du microenvironnement de plusieurs types de tumeurs solides étant donné son association avec différentes variables pronostiques et proinflammatoires, ainsi qu’avec un programme épigénétique complexe, la transition épithélialemésenchymateuse (Epithelial-Mesenchymal Transition; EMT). De plus, nous démontrons que les niveaux d’expression de WISP1 sont significativement plus élevés au sein des tumeurs démontrant une résistance primaire aux immunothérapies de type ICB, particulièrement lorsque qu’une signature reliée à l’EMT peut être retrouvée de façon concomitante. Pour notre deuxième étude, nous avons utilisé des modèles murins in vivo de cancer pulmonaire non à petites cellules KRAS-mutés afin de tester différentes combinaisons thérapeutiques jumelant une thérapie dite ciblée (i.e., un inhibiteur de MEK) a différentes immunothérapies de type ICB. Nos résultats démontrent que l’ajout d’une immunothérapie anti-CTLA-4 à l’inhibiteur de MEK AZD6244 (selumetinib) et une immunothérapie anti-PD-L1 augmente significativement la survie, et que ces bénéfices sont associés à une diminution de marqueurs reliés à l’EMT. Il existe donc un lien commun entre ces deux études qui repose sur l’importance de l’EMT comme facteur favorisant la résistance thérapeutique aux immunothérapies. De plus, nous démontrons pour la première fois que les bénéfices associés à la triple combinaison thérapeutique susmentionnée peuvent être corrélés à une diminution d’expression de marqueurs liés à l’EMT. Par conséquent, nos résultats sont discutés en tant que base potentielle pour de futures études visant à réduire la résistance thérapeutique reliée à l’EMT. Nous discutons également de la valeur translationnelle de nos résultats à travers le développement d’une étude clinique. / Immune checkpoint blockade (ICB) has revolutionized therapeutic approaches in the field of medical oncology and has largely contributed to the fact that immunotherapy is now being regarded as the fourth pillar of cancer treatment alongside surgery, radiotherapy and chemotherapy. Despite encouraging results from clinical trials using ICB, most patients ultimately relapse or succumb to their disease. Therefore, the field of immunotherapeutic resistance research is rapidly expanding. Many strategies to improve ICB responses have been undertaken, including: 1) the search for novel, actionable targets in the immune tumor microenvironment (TME) and; 2) therapeutic combination studies where an ICB backbone is combined with different, synergistic treatment modalities. Each of the studies presented in this research thesis embraces one of these strategies. In our first study, we show that WISP1 represents a promising TME target in multiple solid tumor types by demonstrating its association with prognostic and pro-inflammatory variables, as well as to a complex epigenetic program termed Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT). Furthermore, we show that increased WISP1 expression is associated to primary resistance to ICB, particularly when EMT-related signatures are found concomitantly. In our second study, we used in vivo mouse models of KRAS-mutant Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) to test different therapeutic combinations of targeted therapies (i.e., MEK inhibitor) and ICB. We found that the addition of anti-CTLA-4 ICB to MEK inhibitor AZD6244 (selumetinib) and anti-PD-L1 ICB increases survival, and that these benefits are associated with the downregulation of EMT-related markers. Therefore, there exists a common link between these studies, which relies on the significance of EMT as a detrimental factor within the TME and its association with ICB resistance. Moreover, we show for the first time that the benefits of ICB combination therapy can be associated to the downregulation of EMT markers in vivo. Consequently, we discuss how our results may constitute the basis for future work aiming at reducing EMT-mediated therapeutic resistance, as well as the translational relevance of our pre-clinical results through the development of a clinical trial.