Introdução: O vírus da influenza causa doença generalizada e pode ser fatal. A vacinação diminuiu a morbimortalidade. A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) é uma imunodeficiência primária caracterizada por defeitos na maturação e diferenciação dos linfócitos B (LB) resultando em hipogamaglobulinemia, ausência de resposta aos antígenos específicos e infecções de repetição. A maior susceptibilidade a infecções reforça o benefício da vacinação em pacientes com imunodeficiências. O questionamento sobre a vacinação neste grupo de indivíduos se deve a eficácia, uma vez que na ICV as medidas sorológicas não se mostraram úteis como correlatos de proteção. Estudos recentes do nosso grupo observaram a melhora clínica em relação ao número de infecções de vias aéreas em pacientes com ICV após a vacinação contra influenza, porém sem produção de anticorpos específicos em níveis protetores. Objetivos: Diante das observações apontadas, este trabalho tem o objetivo de investigar o envolvimento das subpopulações de linfócitos T naive e de memória, CD4+ e CD8+, na proteção induzida pela vacina influenza em pacientes com ICV. Casuística e Métodos: Foram selecionados 16 pacientes ICV e 16 controles saudáveis. Amostras de sangue foram colhidas antes e após a administração das vacinas contra A H1N1/H3N2 e B (cepas: A/Califórnia/7/2009, A/Victoria/361/2011, B/Brisbane/60/2008). A resposta específica de células T de memória foi avaliada nas condições sem estímulo pré e pós-vacina nos períodos de 1 mês, 3 meses e 6 meses, além da realização de culturas de linfócitos com a hemaglutinina de influenza (HA) e lisado viral, nos mesmos tempos. As subpopulações de linfócitos T naive e de memória foram avaliados a partir da marcação CD3+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e CCR7+ detectados por citometria de fluxo. Esta marcação nos permitiu identificar quatro subtipos de linfócitos: LT naive (CD45+RA+CCR7+); LT de memória efetora (TEM, CD45+RA-CCR7-); LT de memória central (TCM, CD45+RA-CCR7+) e LT de memória terminalmente diferenciado (TEMRA, CD45+RA+CCR7-). A avaliação funcional dos linfócitos T após estímulo foi realizada através da marcação intracelular de IFN-Gama e IL-2. Resultados: Este estudo demonstrou uma redução na frequência de linfócitos T CD4 +, linfócitos CD4 + TCM e CD8 + TCM em pacientes com ICV e controles saudáveis após a vacina contra influenza. Observamos uma frequência aumentada de linfócitos TEM CD4 + e CD8 + em controles saudáveis e aumento da frequência de linfócitos CD8 + TEMRA em pacientes com ICV, bem como em controles saudáveis. A vacina contra influenza foi capaz de induzir a proliferação de subpopulações de linfócitos T que pode ser caracterizada pela hipótese de diferenciação linear de células sugerida por alguns autores (naive - TCM - TEM / TEMRA). Os peptídeos de HA e o lisado viral foram capazes de estimular subpopulações de linfócitos T de memória específica em pacientes com ICV e controles saudáveis, dependendo do período e das condições dos estímulos. Os resultados mostraram que nos linfócitos T CD4+, a vacinação induziu uma resposta predominantemente IL-2+, enquanto no compartimento T CD8+ observamos uma resposta polifuncional com a produção de IL-2+ e IFN-Gama+. Conclusões: Este é o primeiro estudo a avaliar as subpopulações de linfócitos T de memória em pacientes com DCV vacinados contra Influenza A (H3N2) / B e Influenza A H1N1. Nossos resultados mostraram mudanças no padrão de distribuição das subpopulações de linfócitos T naive, TCM, TEM e TEMRA e na produção de IL-2+ e IFN-Gama+ após a vacinação contra influenza, dados que sugerem e possivelmente justificam a resposta clínica e celular protetora observada em pacientes com ICV / Introduction: Influenza viruses infect humans causing widespread, sometimes fatal, disease. Common Variable Immunodeficiency (CVID) is a primary immunodeficiency characterized by defects in B lymphocyte maturation and differentiation resulting in hypogammaglobulinemia, failure to produce specific antigens and recurrent infections. The increased susceptibility to infections reinforces the benefit of vaccination in patients with immunodeficiencies. The major discussion regarding vaccination of CVID patients is the efficacy once these patients do not produce antibodies which are used as correlates of protection. Recent studies from our group showed reduced respiratory infection rates in influenza vaccinated CVID patients demonstrating a clinical response however with no production of specific antibodies in protective levels. Objective: Considering the above observations, this study has the objective of investigating the involvement of naïve and memory T lymphocytes subpopulations, CD4+ and CD8+, in the protection of influenza vaccination CVID in patients. Patients and Methods: Sixteen CVID patients and 16 healthy controls were selected for this study. Blood samples collected before and after administration of the H1N1 / H3N2 and B vaccines (strains: A / California / 7/2009, A / Victoria / 361/2011 B / Brisbane / 60/2008). Specific memory T cell response was evaluated pre and post vaccination with influenza (1 month, 3 months and 6 months). Besides characterization of lymphocyte subpopulations in PBMCs, cell culture with an influenza hemagglutinin (HA) and viral lysate were also realized. T lymphocytes subpopulations characterized by CD3+, CD4+, CD8+, CD45RA+ and CCR7+ were identified by flow cytometry. These antibodies permitted to identify four lymphocyte subtypes: naïve T cells (CD45RA+CCR7+); effective memory T cells (TEM, CD45RA-CCR7-); Central memory (TCM, CD45RACCR7+) and terminally differentiated memory T (TEMRA, CD45RA+CCR7-). Functional evaluation of lymphocytes was performed through intracellular labelling of IFN-Gama and IL-2. Results: This study showed the reductions of naïve CD4+ T cells, CD4+TCM and CD8+TCM cells in CVID patients and healthy controls after influenza vaccine. We observed an increased frequency of CD4+TEM and CD8+TEM lymphocytes in healthy controls, and increased frequency of CD8+TEMRA lymphocytes in CVID patients and healthy controls. Influenza vaccine was able to induce the proliferation of T lymphocyte subpopulations that can characterize the linear cell differentiation suggested by the authors (Naïve - TCM - TEM / TEMRA). Regarding cytokine production, there was an increase in IL-2+ production by CD4+T and CD8+T cells and an increase of IFN-Gama+ by CD8+T cells in CVID and control patients, indicating a polyfunctional cytokine response. Conclusions: To our knowledge, this is the first study that evaluated memory T lymphocyte subpopulations of CVID patients vaccinated against Influenza A (H3N2) / B and Influenza A H1N1. We show changes in the pattern of T lymphocyte subpopulations: naïve, TCM, TEM and TEMRA and IL-2+ and IFN-Gama+ production after influenza vaccination that may suggest and possibly explain the protective cellular and clinical response observed in CVID patients

Introdução: A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) faz parte de um grupo de imunodeficiências primárias na qual os pacientes apresentam defeitos na maturação e diferenciação dos linfócitos B (LB), resultando em distúrbios funcionais além de alterações na distribuição de seus subtipos. Consequentemente, estes pacientes apresentam hipogamaglobulinemia, susceptibilidade a infecções e ausência de produção de anticorpos a antígenos específicos. Na tentativa de reduzir os episódios de infecções recorrentes, alguns trabalhos têm recomendado a vacinação com patógenos mortos ou subunidades e em trabalho anterior demonstramos a eficácia clínica da vacinação de pacientes com ICV, porém, a experiência com a administração de vacinas em imunocomprometidos é limitada. Objetivos: Avaliar a cinética da distribuição das subpopulações de linfócitos B antes e após a vacinação com antígenos proteicos e polissacarídicos em pacientes com ICV acompanhados no Ambulatório de Imunodeficiências Primárias do Hospital das Clínicas, FMUSP, além da produção de anticorpos específicos aos antígenos vacinais. Pacientes e Métodos: Um grupo de 35 pacientes com ICV e 16 controles foram vacinados contra Influenza, H1N1 e S. pneumoniae. Após as coletas nos tempos pré e pós 1, 3 e 6 meses foram realizados a separação de PBMC e cultura de linfócitos com lisado viral e hemaglutinina de Influenza, além da citometria de fluxo para identificação das subpopulações de LB naive, zona marginal (MZB), memória com troca de isotipo (SMB) e plasmoblastos (PBL). Foram dosados os anticorpos específicos e no grupo dos pacientes foi aplicado um score de sintomas antes e após a imunização. Resultados: Apesar da redução significativa na pontuação do score de sintomas, a maioria dos pacientes não produziu anticorpos específicos para Influenza, H1N1 e S. pneumoniae. A análise da cinética das subpopulações de LB revelou que em indivíduos saudáveis, a resposta contra Influenza apresentou duração de 6 meses, observada por meio da redução da subpopulação naive e aumento gradual da frequência de SMB a partir do primeiro mês. Observamos também redução da população de memória por volta do 3º mês, com aumento da população de PBL que permaneceu elevada até o 6º mês. Por outro lado, a despeito de os pacientes apresentarem aumento de SMB no primeiro mês após a vacinação, sua frequência foi inferior ao observado nos controles, decaindo ao terceiro mês. A população de PBL apresentou aumento precoce no primeiro mês após a vacinação, também muito menor do que observado nos controles, não sendo mantido no terceiro mês. Ainda, observamos uma correlação entre o aumento da expressão destas duas subpopulações no primeiro mês. Apenas a população de MZB apresentou aumento significativo no terceiro mês nos pacientes quando comparados aos controles. Ao dividirmos os pacientes de acordo com a expressão de SMB e PBL após 1 mês da administração das vacinas, observamos que os pacientes que apresentaram aumento na expressão de células B de memória foram os que exibiram uma melhora clínica mais expressiva, soroconverteram e desenvolveram soroproteção para H1N1.Conclusões: Apesar de não apresentarem eficaz diferenciação em células de memória e efetoras, resultando na resposta precoce e de curta duração, observamos que os pacientes foram capazes de reconhecer e responder às vacinas. Além disso, a elevada expressão de MZB no terceiro mês após a vacinação pode sugerir a atuação desta subpopulação na apresentação para os LT. Estes achados reforçam a necessidade de uma melhor compreensão da ativação do sistema imune em pacientes com ICV, para uma adequada subdivisão de acordo com o perfil de resposta após a vacinação / Introduction: Common Variable Immunodeficiency (CVID) is a primary antibody deficiency characterized by defects in B lymphocyte maturation, resulting in disturbed differentiation, distribution and functional variations on its subtypes. As a result , CVID patients have hypogammaglobulinemia and poor antibody response to specific antigens with increased susceptibility to infections. In an effort to minimize the recurrent episodes of infections, some studies have recommended immunization with inactivated pathogens or subunits and in a former study we have shown the clinical improvement determined by immunization in CVID patients, but the experience with vaccines\' administration to immunodeficient patients is limited. Objectives: To evaluate the changes in distribution of B cell subtypes before and after vaccination of CVID patients followed at the Division of Clinical Immunology and Allergy of University of São Paulo Medical School with protein and polysaccharide antigens, as well as specific antibody production . Methods: A group of 35 CVID patients and 16 controls were vaccinated against Influenza, H1N1 and S. pneumoniae vaccines. Blood samples were collected before and 1, 3 and 6 months post vaccination. PBMCs were stimulated with Influenza viral lysate and hemagglutinin peptide. Flow cytometry was performed to identify naïve B cells, marginal zone (MZB), switched memory B cells (SMB) and plasmablasts (PBL). Specific antibody production was measured and a symptoms score was applied for clinical evaluation before and after immunization. Results: In spite of the significant reduction in symptoms score after vaccination, most patients didn\'t produce specific antibodies to Influenza, H1N1 and S. pneumoniae. The analyzes of B cell subtypes changes in healthy individuals upon in vitro Influenza stimulation showed that the response endured up to 6 months post immunization. We observed a reduction in naïve B cell frequency while gradual increase in SMB frequency occurred already at 1 month after vaccination. Moreover, as the memory cell population declined, PBL population increased at the third month post vaccination until the sixth month. Although patients had an increase of SMB on the first month after vaccination, it was lower than that observed in controls, decreasing by the third month post vaccination. Plasmablast frequency had an early increase on the first month, also much lower than the observed in controls decreasing by the third month. In addition, we observed a correlation between the increased expression of SMB and PBL on the first month post vaccination. In patients, only MZB subtype presented a significant increase on the third month when compared to controls. We divided the patients according SMB and PBL expression after 1 month post vaccination and we observed that patients who were able to produce memory B cells showed a better clinical improvement, developed H1N1 seroconversion and seroprotection. Conclusion: Despite the defect on differentiation into memory and effector B cells resulting in early response with lowduration, we observed that patients were able to recognize and respond to vaccines. In addition, the over expression of MZB on the third month after vaccination may suggest the role of this subpopulation as an antigen presenting cell for T cells. These findings reinforce the need of a better understanding of immune system activation and response in CVID patients to propose a division according to vaccine (antigen) responders and non responders

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Germinal Centers (GCs) are transient lymphoid structures that arise in lymphoid organs in response to T cell-dependent antigen. Within the GC, follicular T helper (TFH) cells promote GC B cell differentiation and in turn the proper antibody production to protect us from invading pathogens. We wished to study the regulation of this process by transcription factors STAT3 and Bcl6. STAT3 is important for both TFH cell differentiation and IL-4 production by Th2 cells. IL-4 is a major functional cytokine produced by TFH cells. To dissect the role of STAT3 in IL-4 production by TFH cells, we generated T cell-specific conditional STAT3 knockout mice (STAT3KO). Compared to WT mice, TFH cell differentiation in STAT3KO mice was partially impaired, both in spleen following sheep red blood cells (SRBC) immunization and in Peyer's patches (PPs). In STAT3KO mice, the numbers of splenic GC B cells were markedly decreased, whereas PP GC B cells developed at normal numbers and IgG1 class switching was greatly increased. Unexpectedly, we found that STAT3 intrinsically suppressed the expression of IL-4 and Bcl6 in TFH cells. Mechanistically, in vitro repression of IL-4 expression in CD4 T cells by Bcl6 required STAT3 function. Apart from TFH cells, the GC reaction is also controlled by regulatory follicular T helper (TFR) cells, a subset of Treg cells. To study the mechanism of how TFR cells regulate the GC reaction, we generated mice specifically lacking TFR cells by specifically deleting Bcl6 in Treg cells. Following immunization, these "Bcl6FC" mice developed normal TFH and GC B cell populations. However, Bcl6FC mice produced altered antigen-specific antibody responses, with reduced titers of IgG and increased IgA. Bcl6FC mice also developed IgG antibodies with significantly decreased avidity to antigen in an HIV-1 gp120 "prime-boost" vaccine model. Additionally, TFH cells from Bcl6FC mice produced higher levels of Interferon-γ, IL-10 and IL-21. Loss of TFR cells therefore leads to highly abnormal TFH and GC B cell responses. Overall, our studies have uncovered unexpected regulatory roles of STAT3 in TFH cell function as well as the novel regulatory roles of TFR cells on cytokine production by TFH cells and on antibody production.