Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf Major-Histokompatibilitätskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molekülen ist von entscheidender Bedeutung für eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Präsentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verständnis der Abläufe zu leisten, die an der endogenen Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukleär lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Präsentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpräsentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR über einen endogenen Präsentationsweg und nicht über die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach möglichen Eintrittspforten für nukleäre Proteine in diesen Abbauweg gesucht. Für die Autophagie-abhängige Präsentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Auflösung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verstärkte Antigenpräsentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpräsentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpräsentation mit der MHC-II-Oberflächenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine ähnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abhängiger Antigenpräsentation wurde auch für EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abhängige Präsentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene Präsentation der untersuchten nukleären Antigene auf MHC-II-Molekülen. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabhängig von ihrer subzellulären Lokalisation Zugang zu diesem Präsentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellulären Antigene, die einer CD4+ T-Zellüberwachung unterliegen. / The endogenous presentation of intracellular antigens on major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules plays an important role in adaptive immune responses, but the underlying molecular mechanisms are not well understood. The aim of this study was to gain insight into the endogenous presentation pathways for nuclear antigens on MHC-II molecules. By using antigen-specific CD4+ T cell clones, MHC-II presentation of the nuclear antigens neomycin phosphotransferase II (NucNeoR) and Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) was studied in professional and non-professional antigen presenting cells (APC). Both types of APC presented peptides derived from these nuclear proteins on MHC-II molecules by an endogenous presentation pathway and not by release and reuptake as exogenous protein. Inhibition of autophagy drastically reduced endogenous antigen presentation, indicating that nuclear proteins enter the MHC-II processing and loading compartment through autophagic vesicles. Because autophagocytosis occurs in the cytoplasm, potential entry routes for nuclear proteins into this pathway were investigated. Endogenous presentation of NucNeoR on MHC-II molecules by autophagy did neither involve the CRM1-mediated export of the nuclear protein into the cytoplasm, nor the redistribution of nuclear and cytoplasmic components following the dissolution of the nuclear envelope during mitosis. Conditional antigen expression and cell cycle phase separation of antigen-expressing cells revealed that antigen presentation was maximal in cells in G1/0 and then gradually decreased as cells progressed in the cell cycle. This reduction in antigen presentation correlated with a cell cycle-dependent decrease in antigen transcription/translation, but not with the total amount of antigen present in these cells. By contrast, when antigen expression was turned off, antigen presentation correlated with MHC-II surface expression, which increased from G1/0- to G2/M-phase. A similar correlation between antigen presentation and antigen transcription/translation was also observed for the antigens EBNA3C and the cytosolic variant of neomycin phosphotransferase II (NeoR). These results identify autophagocytosis of newly-synthesized proteins as the molecular mechanism mediating endogenous presentation of nuclear and cytosolic antigens on MHC-II molecules. By coupling protein translation and autophagocytosis, newly-synthesized proteins gain access to the endogenous MHC-II presentation pathway irrespective of their subcellular localisation and thereby broaden the spectrum of intracellular antigens that are presented to CD4+ T cells.

Die kutane Leishmaniose ist eine Infektionskrankheit, die besonders in tropischen und Wüstenregionen endemisch ist, mit einer Inzidenz von 1,5 Millionen Fällen im Jahr und einer Prävalenz von 12 Millionen Infizierten weltweit. Die Infektion kann durch den intrazellulären Parasiten Leishmania major hervorgerufen werden. Am Mausmodell ist die Krankheit ausführlich untersucht. Wie dabei deutlich wurde, ist für die Immunität gegen den Erreger die Induktion einer Klasse von Interferon (IFN)--produzierenden CD4+ T-Helfer-Zellen (TH1-Zellen) entscheidend, welche Makrophagen dazu aktivieren, die von ihnen beherbergten Parasiten abzutöten. Die Umlenkung der Immunantwort in Richtung einer schützenden TH1-Antwort wird auch der Schlüssel zu einem effektiven Impfstoff sein. Ex vivo mit Leishmanienantigenen beladene dendritische Zellen sind vor einiger Zeit als Vakzine gegen L. major-Infektionen beschrieben worden. Ein einzelnes rekombinantes Antigen, LeIF (Leishmania homologue of eukaryotic ribosomal initiation factor 4a), ein parasitäres Protein, das die IL-12-Produktion durch dendritische Zellen stimuliert und das als mikrobiell konserviertes Strukturmolekül (pattern-associated molecular pattern; PAMP) diskutiert wird, vermittelte dabei, zum Pulsen von dendritischen Zellen verwendet, einen schützenden TH1-abhängigen Effekt. Der Einsatz rekombinanter Proteine ist jedoch mit etlichen Nachteilen verbunden, weshalb andere Methoden zur Verabreichung von Antigenen entwickelt wurden. Aus der Tumorforschung ist unlängst die RNA-Elektroporation dendritischer Zellen als eine sichere und vielseitige Methode hervorgegangen, bei der eine große Anzahl von RNA-Molekülen, die für ein bestimmtes Antigen kodieren, durch einen elektrischen Impuls in das Cytosol dendritischer Zellen gelangt. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal die Transfektion dendritischer Zellen mit RNA eines molekular definierten Parasitenantigens. Zunächst erfolgte die Etablierung eines standardisierten Protokolls für die RNA-Transfektion mit dem enhanced green fluorescent protein (EGFP) als Reporterantigen. EGFP-RNA war gut translatierbar in einem In-vitro-Translationssystem, und es konnten sowohl eine Zellinie (fetal skin-derived dendritic cells; FSDC) als auch primäre, aus Knochenmarkkulturen der Maus gewonnene dendritische Zellen (bone marrow-derived dendritic cells; BMDC) mit einem Anteil von bis zu 90% bzw. 75% effizient EGFP-transfiziert werden. In beiden Zelltypen wurde die maximale Transfektionseffizienz mit 20 µg RNA erreicht, die mit größeren Mengen an RNA nicht weiter zu steigern war. Die Höhe der Antigenexpression, gemessen als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) in der Durchflußzytometrie, war direkt proportional zur verwendeten RNA-Menge. In FSDC waren die Transfektionseffizienz und die MFI generell höher als in BMDC bei gleicher RNA-Menge. Zudem konnte gezeigt werden, daß eine Behandlung mit LPS die Kinetik beeinflußt: Die maximale Expression war höher und wurde auch eher erreicht, worauf zudem ein schnellerer Abfall folgte. In den Transfektionsexperimenten mit LeIF wurden zwei Varianten von LeIF-RNA verwendet: eine für die gesamte LeIF-Sequenz kodierende LeIF(fl)-RNA, und eine nur für die aminoterminale Hälfte der LeIF-Sequenz (226 Aminosäuren), dem immunogenen Teil des LeIF-Moleküls, kodierende LeIF(226)-RNA. Im Western Blot von Ganzzellysaten dendritischer Zellen war nur LeIF(fl) nach Transfektion nachzuweisen, wohingegen LeIF(226) in LeIF(226)-transfizierten BMDC nie nachzuweisen war. Da beide Konstrukte aber gut im zellfreien System translatierbar waren, stellte der fehlgeschlagene Nachweis von LeIF(226) kein Fehlschlagen der RNA-Translation, sondern vielmehr einen raschen Antigenabbau dar. Es bestand daher die Erwartung, daß LeIF(226)-transfizierte BMDC trotzdem in der Lage sein müßten, von LeIF(226) abgeleitete antigene Peptide an T-Zellen von mit rekombinantem LeIF (rLeIF) immunisierten BALB/c-Mäusen zu präsentieren. Diese Vermutung wurde durch Messung von IFN- in Stimulationsversuchen mit BMDC und T-Zellen bestätigt, die zeigten, daß am Tag 7 der Kultur mit rLeIF gepulste, LeIF(226)- und LeIF(fl)-transfizierte BMDC in der Tat antigenspezifisch T-Zellen aus LeIF-immunisierten Mäusen aktivierten. IL-4 hingegen wurde nicht produziert, was mit der Tatsache vereinbar ist, daß in Lymphknoten LeIF-vakzinierter Mäusen hauptsächlich T-Zellen vom TH1-Typ zu finden sind. In den Überständen LeIF-transfizierter BMDC-Kulturen, im Gegensatz zu rLeIF-gepulsten BMDC, waren die proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6, IL-10 und IL-12 nicht nachzuweisen. Dieser Effekt lag nicht am Elektroporationsvorgang, da die Zytokinproduktion von mit rekombinantem LeIF elektroporierten BMDC nur teilweise beeinträchtigt war. Die Expression von CD86 war nach LeIF-Transfektion zudem geringer als nach Pulsen mit rLeIF. LeIF-Transfektion führte mithin nicht zur Reifung dendritischer Zellen. LeIF-transfizierte BMDC könnten im Ergebnis als antigenspezifische Toleranzinduktoren fungiert haben, mit regulatorischen T-Zellen als Respondern. Der Effekt der Transfektion mit LeIF-RNA auf die immunstimulatorische Wirkung von BMDC war nicht signifikant erhöht, wenn BMDC am Tag 8 oder 9 der Kultur verwendet wurden. BMDC, die am Tag 8, und mehr noch am Tag 9 mit rLeIF gepulst wurden, induzierten hingegen eine energische T-Zell-Antwort. BMDC vom Tag 9 waren sogar in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren. Bevor eine starke, gegen LeIF gerichtete T-Zell-Antwort eingeleitet werden kann, müssen dendritische Zellen also letztlich – neben Präsentation des Antigens und Expression kostimulatorischer Moleküle – eine gewisse „Empfindlichkeit“ gegenüber dem Strukturmolekül LeIF besitzen, die mit ihrem Reifungsalter in Zusammenhang steht. Dieses dritte Signal wird nicht durch intrazelluläres LeIF nach Transfektion mit LeIF-RNA übermittelt, oder es wird unterdrückt. Darüber hinaus war nach Elektroporation von rLeIF die IL-12-Produktion von BMDC gänzlich aufgehoben, die Produktion von IL-1 bei höheren Antigendosen reduziert und die Produktion von IL-10 teilweise erhöht. Die Produktion von IL-6 war unbeeinflußt. Dieses veränderte Zytokinprofil legt eine Doppelnatur von LeIF als PAMP nahe: Neben der bei extrazellulärem Vorliegen von LeIF erwiesenen Eigenschaft, die Produktion von IL-12 zu stimulieren, welches die Resistenz des Wirtes gegen L. major steigert, könnte LeIF bei intrazellulärem Vorliegen auch zu Evasionsmechanismen des Parasiten vor dem Immunsystem des Wirtes beitragen, möglicherweise durch Wechselwirkung mit MAP (mitogen-activated protein)-Kinase-Signalwegen. Die Eigenschaften von LeIF als Adjuvans hängen also sowohl von der Verabreichungsmethode (Transfektion mit RNA bzw. Pulsen mit dem rekombinanten Protein) als auch vom Zielkompartiment (extra- bzw. intrazellulär) ab. Zusammenfassend konnte also in dieser Arbeit gezeigt werden, daß BMDC mit einem Parasitenantigen transfizierbar sind. Das Antigen wird dabei prozessiert und präsentiert, aber von dendritischen Zellen nicht als PAMP erkannt. Durch Transfektion mit antigenkodierender mRNA alleine werden mithin nicht alle notwendigen Signale für die Induktion einer potenten Immunantwort übermittelt. / Cutaneous leishmaniasis is an infectious disease that is endemic especially in tropical and desert regions with an incidence of 1.5 million cases per year and a prevalence of 12 million people infected worldwide. The infection can be caused by the intracellular parasite Leishmania major. The disease has been studied extensively in the murine model. It has become apparent that the induction of a class of interferon (IFN)--producing CD4+ T helper cells (TH1 cells) that activate macrophages to kill the parasites they harbor is desicive for the establishment of immunity. The redirection of the host’s immune response towards a protective TH1 phenotype will also be the key to an effective vaccine. Dendritic cells (DC) loaded with leishmanial antigens ex vivo were lately described as vaccines against L. major infections. One single recombinant Leishmania antigen, LeIF (Leishmania homologue of eukaryotic ribosomal initiation factor 4a), which was identified as a protein that stimulates DC to secrete interleukin (IL)-12 and discussed as a pattern-associated molecular pattern (PAMP), was found to mediate a protective TH1-dependent effect when used for pulsing of DC. The application of recombinant proteins is tied to many disadvantages, which is why other methods of antigen administration have been developed. RNA electroporation of DC has recently emerged from tumor research as a safe and versatile method of antigen delivery, by which a large number of RNA molecules encoding a specific antigen gains access to the cytosol of DC by an electrical impulse. The present study describes, for the first time, transfection of DC with RNA encoding a molecularly defined parasite antigen. Initially, a standardized protocol for RNA transfection was established, using the enhanced green fluorescent protein (EGFP) as reporter antigen. EGFP-RNA was well translatable in an in vitro translation system, and both a DC cell line (fetal skin-derived DC; FSDC) and murine primary bone marrow-derived DC (BMDC) could be transfected efficiently, with a yield of up to 90% and 75%, respectively. In both cell types, maximal transfection efficiency was attained with 20 µg RNA and could not be further increased with larger amounts of RNA. The level of antigen expression, measured as the mean fluorescence intensity (MFI) by flow cytometry, was directly proportional to the amount of RNA used for transfection. In FSDC, transfection efficiency and MFI were generally higher than in BMDC when the same amounts of RNA were used. Furthermore, the kinetics was shown to be sensitive to treatment with lipopolysaccharide (LPS): the expression peak was higher and was reached sooner, followed by a more rapid decline. In transfection experiments with LeIF, two variants of LeIF-RNA were used: LeIF(fl)-RNA, encoding the complete LeIF sequence, and LeIF(226)-RNA, encoding only the aminoterminal half of the LeIF sequence (226 amino acids), the immunogenic part of LeIF. Only LeIF(fl) was detectable by Western Blot in whole cell lysates of BMDC after LeIF(fl)-RNA transfection, whereas LeIF(226) could never be detected in LeIF(226)-transfected BMDC. However, as both constructs were well translatable in a cell-free system, the failure to detect LeIF(226) in BMDC lysates did not represent a failure in RNA translation, but rather a rapid antigen degradation. It was therefore expected that LeIF(226)-transfected BMDC should nevertheless be able to present LeIF(226)-derived antigenic peptides to T cells from BALB/c mice primed with recombinant LeIF (rLeIF). This hypothesis was confirmed by measuring IFN- production in BMDC-T cell co-incubation assays, showing that rLeIF-pulsed, LeIF(226)- and LeIF(fl)-transfected day 7 BMDC did indeed activate T cells from LeIF-immunized mice in an antigen-specific manner. In contrast, IL-4 was not produced, which was consistent with the fact that T cells found in lymph nodes from LeIF-primed mice are primarily of the TH1 type. In the supernatants of LeIF-transfected BMDC cultures, in contrast to rLeIF-pulsed BMDC, the proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, IL-10 and IL-12 were not detected. This effect was not due to the electroporation procedure, as cytokine production by BMDC electroporated with rLeIF was only partially impaired. Also, the expression levels of CD86 were lower upon LeIF transfection than after pulsing with rLeIF. Thus, LeIF transfection did not induce maturation of DC. In conclusion, LeIF-transfected BMDC may have acted as semi-mature antigen-specific tolerance inducers, with regulatory T cells as responders. The effect of LeIF transfection on the immunostimulatory capacity of BMDC was not significantly increased when day 8 or 9 BMDC were used. However, day 8, and even more day 9 BMDC pulsed with rLeIF mounted a vigorous T cell response. Day 9 BMDC were able to activate naïve T cells. In conclusion, before a strong T cell response against LeIF can be induced, DC need to – besides presenting antigen and expressing co-stimulatory molecules – exhibit a susceptibility to the innate signaling molecule LeIF which is linked to their maturation age. This third signal is provided by extracellular rLeIF, but it is not conveyed – or is suppressed – by intracellular LeIF after LeIF-RNA transfection. Furthermore, electroporation of rLeIF abrogated IL-12 production by BMDC completely, the production of IL-1 was reduced with higher antigen doses, and the production of IL-10 was partially increased. The IL-6 production was unaffected. This altered cytokine profile suggests that LeIF as a PAMP might have a bipartite nature: besides exhibiting the capacity to stimulate IL-12 production upon extracellular presence, thereby enhancing host resistance against L. major, LeIF could also contribute to parasitic host evasion mechanisms from intracellular compartments of DC, possibly by interfering with mitogen-activated protein (MAP) kinase signaling pathways. Thus, the adjuvant properties of LeIF depend both on its mode of delivery (transfection with RNA vs. pulsing with the recombinant protein) and the targeted compartment (extra- vs. intracellular). From this work, it can be summarized that BMDC are well transfectable with a parasite antigen. The antigen is processed and presented, but it is not recognized as a PAMP by DC. Hence, transfection with antigen-encoding mRNA by itself does not convey all necessary signals for the elicitation of a potent immune response.

Myelin-assoziierte Epitope können Ziel destruktiver T-Zell Antworten während autoimmuner Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose oder der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis werden. Dagegen reagieren selbstspezifische T-Zellen nach axonaler Degeneration nicht mit destruktiver Autoimmunität, obwohl die entsprechenden Epitope durch Myelin-phagozytierende Mikroglia präsentiert werden. Im Modell der entorhinalen Kortexläsion von Ratte und Mause zeigten wir, daß Autoimmunität nach solchen Läsionen durch die Expression des Todesliganden CD95L (FasL, Apo1L) auf Astrozyten verhindert wird, da hochaktivierte T-Zellen durch CD95L apoptotisch eliminiert werden. Myelin-phagozytierende Mikroglia reguliert MHC-II und B7-2 hoch, nicht aber das kostimulatorische B7-1 Moleküle, das mit Autoimmunität im Gehirn assoziiert ist. In Zonen retrograder Degeneration, wo Axone am Sproutingprozess beteiligt sind, zeigen Mikrogliazellen bis mindestens 90 Tage nach Läsion einen MHC-II und B7-2 positiven Immunphänotyp. Trotz Anwesenheit von CD4/B7-2 positiven a/b T-Zellen, behält Mikroglia ihre ramifizierte, ruhende Morphologie. Im Gegensatz zu autoimmunen Erkrankungen im Gehirn, erfolgt die Antigenpräsentation nach axonaler Läsion durch Mikroglia also nicht über das B7-1 Molekül. Dies kann der Grund für das Ausbleiben destruktiver Autoimmunität nach axonaler Schädigung sein. / Myelin-associated epitopes are targets of destructive T cell responses during autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). On the other hand, autoimmune T cells do not respond in a destructive way to mechanically-induced axonal degeneration despite myelin phagocytosis and presentation by local microglia. Using entorhinal cortex lesion, a model of axonal degeneration and reactive sprouting, we showed that autoimmunity in the brain is prevented by the expression of the death Ligand CD95L expressed on astrocytes lading to apoptosis of highly activated T cells. Moreover, myelin phagocytosing microglia upregulate MHC-II and B7-2, but lack expression of B7-1, a costimulatory molecule related to destructive immunity. In zones of retrograde axonal degeneration, where axons undergo secondary damage and later contribute to the sprouting response, MHC-II/B7-2 positive microglia are still found at 90 days post lesion. These cells exhibit the ramified morphology of resting microglia in the presence of CD4/B7-2 positive a/b T cells. Thus, in contrast to autoimmune brain disease, axonal degeneration is lacking a signal to induce B7-1 on microglial cells and the recruited T cells do not induce microglial activation. Differences in B7-phenotype of local antigen-presenting cells might provide an explanation for the important finding that autoimmune T cells elicit protective rather than destructive effects following axonal degeneration in the CNS.

Interleukin-10 ist ein Paradebeispiel eines immunhemmenden Zytokins. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe von Tumoren Interleukin-10 produziert, um einer Antitumor-Immunantwort zu entgehen. Viele Studien haben sich mit dem Einfluss von Interleukin-10 auf die antigenpräsentierenden Fähigkeiten der Dendritischen Zellen beschäftigt. Es gibt eindeutige Hinweise, dass der Effekt von tumorproduziertem Interleukin-10 nicht nur in einer hemmenden Wirkung auf die Ausreifung Dendritischer Zellen besteht, sondern dass Interleukin-10 zu einer Reduktion der Anzahl an Dendritischen Zellen führen kann. Ziel dieser Arbeit ist es daher, den Mechanismus für eine solche depletierende Wirkung auf die Dendritischen Zellen zu analysieren. Hierzu wurden die Effekte von Interleukin-10 auf die frühe Differenzierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten untersucht. Die Zugabe von Interleukin-10 zu einem Differenzierungscocktail aus Interleukin-4 und Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierendem-Faktor führt zu einer nachhaltigen Hemmung des Differenzierungsprozesses von Monozyten zu Dendritischen Zellen. Bereits 48h nach Beginn der Zellkultur konnte mit Hilfe von cDNA-Microarray-Analysen gezeigt werden, dass Interleukin-10 nicht nur einen Differenzierungs-hemmenden Effekt ausübt, sondern auch die Entstehung aberranter Zellphänotypen bewirkt. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Effekte des Interleukin-10 in der frühen Differenzierungsphase weitgehend irreversibel sind. Zusammenfassend können die Ergebnisse zur Erklärung beitragen, wie es bei Patienten mit Tumoren unter dem Einfluss von Interleukin-10 zu einer Reduktion der absoluten Zahl Dendritischer Zellen kommen kann.

Die Ätiologie und Pathogenese autoimmuner Lebererkrankungen sind nur unvollständig verstanden. Bei der primär sklerosierenden Cholangitis bzw. bei der autoimmunen Hepatitis sind Cholangiozyten der größeren Gallengänge und Hepatozyten die Zielzellen der Autoimmunreaktion in der Leber. Mausmodelle sind zur Analyse initialer pathophysiologischer Prozesse notwendig und tragen zum besseren Verständnis der immunologischen Vorgänge in der Leber bei. Mit Hilfe transgener Mauslinien, die das Modellantigen Ovalbumin gewebespezifisch in den Cholangiozyten (ASBT-OVA) oder in den Hepatozyten (TF-OVA) exprimieren, sowie adoptiven Transfers antigenspezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen wurden Untersuchungen zur Antigenpräsentation, T-Zell-Aktivierung und Toleranzinduktion in der Leber durchgeführt. Die Expression von Ovalbumin in Cholangiozyten resultierte in einer Aktivierung der CD8+ T-Zellen in der Leber und den Lymphknoten. Im Gegensatz dazu ignorierten naive CD4+ T-Zellen das Antigen und wurden nicht aktiviert. Die Expression von Ovalbumin in Hepatozyten resultierte in einer vollständigen Aktivierung der CD8+ T-Zellen zu Effektorzellen über Kreuzpräsentation durch professionelle antigenpräsentierende Zellen (APZ) in der Leber. Diese Aktivierung war transient und selbst-limitiert. Die Induktion von CD4+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen trug entscheidend zur Limitierung der induzierten Autoimmunität und Kontrolle der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen bei. Naive CD4+ T-Zellen benötigten die Aktivierung durch APZ in einem anderen Organ, bevor sie in die Leber relokalisierten und wiesen keinen Effektorphänotyp auf. Beide Modelle repräsentieren nicht die chronische Eigenschaft humaner autoimmuner Lebererkrankungen, ermöglichen jedoch Untersuchungen zum besseren Verständnis der Rolle verschiedener T-Zell-Populationen in der Pathogenese autoimmuner Lebererkrankungen sowie der Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen durch hepatisches Antigen. / Aetiology and pathogenesis of autoimmune liver diseases are still incompletely understood. Cholangiocytes of the larger bile ducts and hepatocytes are the target structures of autoimmune reactions in the liver in primary sclerosing cholangitis and autoimmune hepatitis, respectively. Mouse models are necessary to analyse initial pathophysiological processes and contribute to a better understanding of immunological processes in the liver. With the help of transgenic mouse strains, in which the model antigen ovalbumin is expressed specifically in the cholangiocytes (ASBT-OVA) or in hepatocytes (TF-OVA), as well as the adoptive transfer of antigen specific CD4+ and CD8+ T cells, antigen presentation, T cell activation and tolerance induction in the liver, were analyzed. Expression of ovalbumin in cholangiocytes resulted in activation of CD8+ T cells in the liver and lymph nodes. In contrary, naïve antigen specific CD4+ T cells ignored the antigen expressed by cholangiocytes and were not activated. Expression of ovalbumin in hepatocytes resulted in complete activation of CD8+ T cells to become effector cells by crosspresentation depending on professional antigen presenting cells (APCs) in the liver. This activation was transient and self-limiting. Induction of CD4+Foxp3+ regulatory T cells played a crucial role in limiting autoimmunity and controlling the expansion of antigen specific CD8+ T cells in the liver. By contrast, naïve CD4+ T cells required activation by professional APCs in a different organ before relocating to the liver and did not display an effector phenotype. Both models do not represent the chronic characteristics of human autoimmune liver diseases, but help to gain a better understanding regarding the role of specific T cell populations in the pathogenesis of autoimmune liver diseases, as well as regarding antigen presentation and activation of T cells by hepatic antigen.

Die initialen immunologischen Prozesse, die zur Entwicklung autoimmuner Lebererkrankungen führen, sind weitgehend unbekannt. Deshalb wurden in dieser Arbeit die Antigenpräsentation, die Migration sowie der Phänotyp in vivo aktivierter CD8 T-Zellen in der Leber anhand eines Mausmodells der autoimmunen Hepatitis untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass hepatische dendritische Zellen an der Entstehung von CD8 Effektor-T-Zellen und an der Inflammation der Leber beteiligt sind. Kupffer-Zellen dagegen nehmen im autoimmunen Kontext in der Leber eine tolerogene Funktion ein. Die in vivo in der Leber aktivierten CD8 T-Zellen zeigten spezifische Oberflächenmarker und ein ungewöhnliches Migrationsverhalten. So wurde zum einen mit Neuropilin-1 ein weitgehend unbekannter Oberflächenmarker identifiziert, zum anderen spricht die Expression von bekannten Markern, die den Aktivierungsstatus der CD8 T-Zellen definieren, für einen hybriden Phänotyp. Sie besitzen sowohl Charakteristika von naiven CD8 T-Zellen als auch von Effektorzellen, eine Eigenschaft, die auch bei zentralen Gedächtniszellen gefunden wird. In der Leber aktivierte CD8 T-Zellen können nicht nur proinflammatorische Zytokine ausschütten und somit eine Inflammation in der Leber auslösen, sondern sind außerdem in der Lage durch Lymphknoten zu zirkulieren. Dagegen ist ihnen der Zugang zum Darm verwehrt, womit eine direkte regulatorische Funktion im Darm ausgeschlossen werden kann. Obwohl auf in der Leber aktivierten CD8 T-Zellen spezifische Adhäsionsmoleküle identifiziert wurden, existiert keine exklusive gewebespezifische Migration in die Leber, wie sie etwa für im Darm aktivierte CD8 T-Zellen nachgewiesen wurde. Im darmassoziierten lymphatischen Gewebe aktivierte CD8 T-Zellen akkumulieren in der Leber und tragen möglicherweise zur Schädigung der Leber im Rahmen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen bei. Diese Arbeit trägt somit zum besseren Verständnis der Entstehung autoimmuner Prozesse in der Leber bei. / Initial immunological processes leading to autoimmune liver diseases are largely unknown. Therefore this thesis analyzed the antigen presentation, the migration as well as the phenotype of in vivo activated CD8 T cells in the liver by employing a mouse model for autoimmune hepatitis. It was shown that hepatic dendritic cells are effective antigen-presenting cells, which contribute to the induction of functional effector CD8 T cells in the liver and hepatitis. In contrast, Kupffer cells have a tolerogenic role during autoimmune processes in the liver. CD8 T cells that were in vivo activated in the liver display specific surface markers and unusual migration patterns. On the one hand an unusual surface molecule Neuropilin-1 was identified, on the other hand expression of well-known markers defining the activation-status of CD8 T cells suggests a hybrid phenotype. They reflect aspects of naive and effector T cells, characteristics also found on central memory T cells. Liver-primed CD8 T cells do not only produce pro-inflammatory cytokines leading to hepatitis, but they also retain their ability to circulate through lymph nodes. However, they have no access to the gut, which suggests that a direct regulatory function in the gut can be excluded. Although specific adhesion molecules on CD8 T cells activated in the liver were identified, no exclusive tissue-specific migration into the liver exists, as was shown for CD8 T cells primed in the gut. CD8 T cells activated in the gut-associated lymphoid tissue accumulate in the liver, in principle enabling them to induce liver pathology in the context of inflammatory bowel disease. Thus, the here described findings contribute to the understanding of initial immunological processes in autoimmune liver diseases.

Der MHC I Pathway ist ein Teil des Immunsystems und stellt mittels Antigenen an der Zelloberfläche den Proteinstatus der Körperzellen dar. Ziel dieser Arbeit ist durch die Entwicklung von Modellen zu Proteinsynthese und Abbau sowie den Teilschritten des MHC I Pathways und der Untersuchung von Simulationsergebnissen das Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse zu verbessern und gegebenenfalls die Qualität der Antigenprädiktion zu verbessern. Es wurden statistische Modelle für den Transport der Peptide in das ER mittels TAP, das Schneiden von Peptidbindungen durch das Proteasom und das cytosolische sowie endoplasmatische Trimmen von Peptiden entwickelt. Weiterhin wurden kinetische Modelle zur Synthese und Abbau von viralen Proteinkonstrukten, zur proteasomalen Erstellung von Proteinfragmenten und zum Simulieren des Gesamtprozesses von Infektion bis zur Antigenpräsentation entwickelt. Es wurde gezeigt, dass eine DRiP Rate von 10 Prozent die Antigenpräsentation unabhängig von der Lebenszeit der Proteine gewährleistet und für langlebige Proteine der Anteil der Antigene aus DRiPs die Gesamtmenge der Antigene dominiert. So wird gewährleistet, dass an der Zelloberfläche der Status der momentanen Proteinsynthese dargestellt wird. Die erstellten Teilmodelle der Schritte des MHC I Pathways sind jeweils auf in vitro Daten des jeweiligen Prozesses trainiert und ermöglichen zusammen mindestens die gleiche Vorhersagequalität, wie Pathway Modelle, die auf in vivo Daten trainiert worden sind. Dies zeigt, dass alle wesentlichen Prozesse zur Antigenpräsentation von den erstellten Modulen erfasst werden. Die Module können je nach Bedarf und Fragestellung zu Modellen kombiniert werden. Ein Vorhersagetool wurde auf http://mhc-pathway.net zur Verfügung gestellt. Durch Modellanalysen können der relative Beitrag der einzelnen Schritte des Pathways und die Vorraussetzungen für ein potentielles Antigen bestimmt werden. Das kinetische Modell der Prozesse von Infektion bis Antigenpräsentation erlaubt das Verfolgen aller Peptide und das Analysieren der Prozesse die zur Erstellung von Epitopen führen. Die quantitativen Vorhersagen können experimentell validiert werden. Die proteasomale Fragmenterstellung ist der Teilprozess, der noch am wenigsten gut verstanden ist und bedarf noch weiterer experimenteller Untersuchungen. / The MHC I antigen presentation pathway is part of the immune system and enables cells to show their proteome state at the cell surface. This works aims at improving the understanding of the MHC I pathway and the prediction of antigens from the source proteins where appropriate. The means are the development of models for protein synthesis, degradation and the individual steps of the pathway as well as the analysis of simulation results. Statistical models for the transport of peptides into the ER by TAP, the cleavage of peptide bonds by the proteasome, and the cytosolic and endoplasmic trimming of peptides have been developed. Furthermore, kinetic models for synthesis and degradation of viral protein constructs, for proteasomal generation of protein fragments, and for the simulation of the entire process from viral infection of a cell to the resulting antigen presentation were created. It has been shown that a DRiP rate of 10% is sufficient to have antigen presentation independent of the source protein’s live time and that the antigens derived from the DRiP pool dominate the antigen presentation for long lived proteins. This mechanism enables the presentation of the current protein synthesis state of the cell. Each developed model of a part of the MHC I pathway is trained on in vitro data and together they provide at least the same prediction quality as pathway models that are based on in vivo data. This shows that all processes that contribute significantly to antigen presentation are covered in the developed models. The models for the individual parts can be combined according to the demand and question. A prediction tool has been provided at http://mhc-pathway.net. The contribution of each part of the pathway can be assessed by model supported analysis of the individual steps. It is possible to determine the traits of a potential antigen. The kinetic model of the pathway from infection to antigen presentation enables the generation of time curves for each possible peptide and the analysis of the processes that lead to the development of antigens. The quantitative predictions allow for experimental validation. The proteasomal fragment generation is the least good understood part of the MHC I pathway and requires further experimental study.

Die Wespengiftallergie stellt eine typische allergische Sofortreaktion dar. Für diese IgE-vermittelten, pathologischen Immunreaktionen ist die spezifische Immuntherapie (IT) die einzige zur Zeit zur Verfügung stehende kausale Therapie. Die Wirkmechanismen sind trotz intensiver Bemühungen weiterhin nicht vollständig aufgeklärt. Als wichtigste These wird zur Zeit eine Verlagerung des pathologischen, TH2-dominierten Zytokinmilieus in Richtung "normales" TH1-Milieu diskutiert. Es wurde auch eine reduzierte Mediatorfreisetzung von Effektorzellen, eine verminderte Leukozytenproliferation, eine verminderte Endorganantwort und charakteristische Ig-Titer-Veränderungen mit initialem Anstieg und längerfristigem Abfall des sIgE und Anstieg des sIgG4 beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der IT auf periphere B-Zellen hinsichtlich ihrer Ig-Produktion und ihres Phänotyps untersucht. 15 Patienten mit systemischen Reaktionen nach Wespenstich, Nachweis von spezifischem IgE und positivem Hauttest, bei denen eine Schnell-Immuntherapie eingeleitet wurde, wurden vor Beginn der Therapie (Tag 1), am Tag ihrer Entlassung (Tag 6), also einen Tag, nachdem die Erhaltungsdosis von 100 µg erreicht wurde, und vor der 2. ambulanten Allergeninjektion am 26. Tag untersucht. Die Expression von CD5, CD23, CD32, CD40, CD54, CD86, CD95, HLA-I-ABC und HLA-II-DR wurde auf peripheren mononukleären Blutzellen durchflußzytometrisch bestimmt. Anti-CD19 FITC wurde als spezifischer B-Zellmarker benutzt. Die Serum-Titer des Gesamt-IgE, Wespengift-spezifischen IgE und Wespengift-spezifischen IgG4 wurden mittels ELISA bestimmt. Zur statistischen Auswertung wurde der Wilcoxontest für nicht-parametrische, verbundene Daten benutzt. Die Expression von CD54, CD5, CD32 und HLA-II-DR wurde durch die IT signifikant und die von CD23 tendentiell modifiziert. So war die Expression dieser Moleküle auf der Oberfläche peripherer B-Zellen am Tag 6 im Vergleich zum Ausgangswert vom Tag 1 reduziert. Am 26. Tag wurden wieder Werte auf der Höhe der Ausgangswerte vom Tag 1 gemessen. Dagegen veränderte sich die Expression von CD40, CD86, CD95 und HLA-I-ABC während der untersuchten Zeitpunkte nicht. Die Ig-Titer veränderten sich in der für die IT charakteristischen Weise. So stieg nach 3 Wochen der Gesamt-IgE-, sIgE- und sIgG4-Titer hochsignifikant an. Die Expression der untersuchten Oberflächenmoleküle ist als Indikator für Veränderungen der Aktivationslage und des funktionellen Status der Zellen während der IT zu interpretieren. So spricht die Reduktion der Expression von CD32, CD54 und HLA-II für eine verminderte Aktivierungslage der peripheren B-Zellen. Ferner deutet die Reduktion von CD5 und CD32 auf eine Anergie der B-Zellen hin. Durch die reduzierte Expression von CD23 und CD54 könnte die T-B-Zell-Interaktion verschlechtert werden, die für die Effektorfunktionen beider Zellen bedeutsam ist.Einen wesentlichen Beitrag zur Wirksamkeit der IT könnte auch die verminderte Expression des HLA-II leisten, da HLA-II für die Ag-Präsentation essentiell ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die spezifische Immuntherapie einen Einfluß nicht nur auf die Ig-Produktion der B-Zellen hat, sondern auch auf deren Phänotyp. Dies könnte Hinweise auf bisher nicht bekannte Mechanismen bieten, die an der Wirksamkeit der IT beteiligt sind. / Wasp-venom allergy is a typical IgE-mediated allergic reaction. Specific immunotherapy (IT) is the only currently available causal therapy for IgE-mediated allergies. The mechanisms responsible for the efficacy of IT are still not fully understood. So far, the main focus of research has been on changes of T-helper cell (TH) cytokine production with a shift from TH2 to TH1 cytokines. Reduced mediator secretion from effector cells of allergic reactions, decreased leukocyte proliferation, lowered responsiveness of end organs and changes in immunoglobulin levels have been reported as well. The purpose of this study was to investigate the influence of IT on phenotype and Ig-production of B-lymphocytes. 15 venom allergic patients with a history of systemic reactions after a wasp sting and venom-specific skin test reactivity as well as serum IgE were investigated before VIT (day 1), one day after reaching maintenance dose of 100 µg (day 6) during inpatient rush VIT, and again on day 26 during continued outpatient maintenance therapy. Changes in the serum levels of total IgE, allergen-specific IgE (sIgE) and sIgG4 were measured by ELISA. Expression of CD5, CD23, CD32, CD40, CD54, CD86, CD95, HLA-I-ABC and HLA-II-DR on double labeled B cells was studied by flow cytometry of peripheral blood mononuclear cells. On day 6, cell surface expression of CD54, CD5, CD32 and HLA-II-DR was decreased significantly in intensity and numbers of positive cells, compared to day 1, while on day 26, expression of these molecules approached again baseline levels. Furthermore, a trend to decreased CD23 was noted on day 6. No changes were observed for CD40, CD86, CD95 and HLA-I-ABC. Levels of total IgE, sIgE and sIgG4 showed a significant increase after 26 days of VIT. These data show that initiation of rush VIT has profound effects on B-cell phenotype and Ig-production. Reduced expression of surface molecules can be interpreted as a reduction of activation status of B-cells as well as reduced ability to present antigen and to costimulate other leukocytes. B cells may thus be additional direct or indirect targets of high dose antigen therapy and contribute to the efficacy of IT.

Interleukin-10 ist ein Paradebeispiel eines immunhemmenden Zytokins. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe von Tumoren Interleukin-10 produziert, um einer Antitumor-Immunantwort zu entgehen. Viele Studien haben sich mit dem Einfluss von Interleukin-10 auf die antigenpräsentierenden Fähigkeiten der Dendritischen Zellen beschäftigt. Es gibt eindeutige Hinweise, dass der Effekt von tumorproduziertem Interleukin-10 nicht nur in einer hemmenden Wirkung auf die Ausreifung Dendritischer Zellen besteht, sondern dass Interleukin-10 zu einer Reduktion der Anzahl an Dendritischen Zellen führen kann. Ziel dieser Arbeit ist es daher, den Mechanismus für eine solche depletierende Wirkung auf die Dendritischen Zellen zu analysieren. Hierzu wurden die Effekte von Interleukin-10 auf die frühe Differenzierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten untersucht. Die Zugabe von Interleukin-10 zu einem Differenzierungscocktail aus Interleukin-4 und Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierendem-Faktor führt zu einer nachhaltigen Hemmung des Differenzierungsprozesses von Monozyten zu Dendritischen Zellen. Bereits 48h nach Beginn der Zellkultur konnte mit Hilfe von cDNA-Microarray-Analysen gezeigt werden, dass Interleukin-10 nicht nur einen Differenzierungs-hemmenden Effekt ausübt, sondern auch die Entstehung aberranter Zellphänotypen bewirkt. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Effekte des Interleukin-10 in der frühen Differenzierungsphase weitgehend irreversibel sind. Zusammenfassend können die Ergebnisse zur Erklärung beitragen, wie es bei Patienten mit Tumoren unter dem Einfluss von Interleukin-10 zu einer Reduktion der absoluten Zahl Dendritischer Zellen kommen kann.:1. Verzeichnis der Abkürzungen 5 2. Einleitung 7 Fragestellung 11 3. Material und Methoden 12 3.1 Verwendete Materialien 12 3.1.1 Reagenzien für Zellseparation und Zellkultur 12 3.1.2 Stimulatoren 12 3.1.3 Reagenzien für FACS-Analysen 12 3.1.4 Molekularbiologische Reagenzien und Puffer 13 3.1.4.1 RNA-Isolierung 13 3.1.4.2 RT-PCR 13 3.1.4.3 cDNA Microarrays 14 3.2 Zellen und Kulturbedingungen 15 3.2.1 Isolierung von Monozyten aus dem peripheren Blut 15 3.2.2 Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen 16 3.3 Durchflusszytometrie 17 3.4 RNA Isolierung 18 3.4.1 Prinzip und Protokoll der RNA-Isolierung 18 3.4.2 Quantifizierung der RNA und Bestimmung der Reinheit 19 3.4.2.1 Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration 19 3.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 20 3.4.2.3 RNA-Fällung 21 3.5 cDNA Expressions-Ansätze 22 3.5.1 mRNA-Amplifikation 22 3.5.2 Membranmarkierung 23 3.5.2.1 Prinzip des cDNA-Array 23 3.5.2.2 Probensynthese 24 3.5.2.3 Aufreinigung 25 3.5.2.4 Hybridisierung der Nylonmembran 25 3.5.2.5 Auswertung der Ergebnisse 27 3.6 Statistische Auswertung 27 4. Ergebnisse 28 4.1 Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von IL-4 und GM-CSF 28 4.2 Ermittlung der wirksamen hemmenden Konzentration von IL-10 29 4.3 Einfluss von IL-10 während der Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen 30 4.3.1 Oberflächenexpression nach 7 Tagen 30 4.3.2 Oberflächenexpression nach 2 Tagen 32 4.3.3 Oberflächenexpression nach 24 Stunden und 48 Stunden für die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR7 33 4.4 Ausreifung von unreifen Dendritischen Zellen zu reifen Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von KLH, TNF-α und GM-CSF 36 4.5 Kann eine adäquate Ausreifung die hemmenden Effekte von IL-10 überwinden? 37 4.6 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen 38 4.7 Genexpressionsmuster in der frühen Phase der Differenzierung Dendritischer Zellen 40 5. Diskussion 49 5.1 Hintergrund 49 5.2 Einfluss von IL-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen 51 5.3 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen 53 5.4 Genexpression 55 5.4.1 Übersicht 55 5.4.2 Regulation von CCR1 und CCR2 durch IL-10 56 5.4.3 Regulation von IL-1ß und IL-1R1 durch IL-10 58 5.4.4 Regulation von S100A8 und S100A9 durch IL-10 59 5.5 Biologische Bedeutung 61 6. Zusammenfassung 63 7. Literaturverzeichnis 67

Type 1 diabetes (T1D) is a chronic autoimmune disease characterized by loss of insulin-producing beta cells resulting in life-long insulin deficiency. Beta cell destruction by autoreactive CD8+ effector T-cells is thought to be the main cause of loss of insulin output. Autoreactive T-cells are similarly to autoantibodies, which have been established as markers of risk and progression of the disease, directed towards autoantigens of T1D. These are most notably, insulin, 65 kDa glutamic acid decarboxylase (GAD65, also known as GAD2), insulinoma-associated protein 2 (IA­2, also known as PTPRN or ICA512) or zinc transporter 8 (ZNT8). Most of the known T1D autoantigens are components of insulin secretory granules (SGs). T1D arises from an interplay of genetic and environmental factors, which are thought to act as triggers in susceptible individuals. Predisposing alleles in genetic loci for human leukocyte antigen (HLA) account for by far the highest contribution to the risk of disease development, followed by an array of polymorphisms thought to play a role in either immune cells or beta cells. Of environmental factors that potentially add to the risk of disease progression, the most evidence-supported are Enteroviruses (EVs). Most notably, their genome and viral proteins, as well as higher expression of cellular proteins involved in viral response were detected more often in blood and pancreata of patients with T1D than in healthy population. In addition, recent evidence from a large long-term observational study has implicated prolonged shedding of specifically species Enterovirus B in the stools of children as a risk factor in development of beta cell autoimmunity in children with high genetic risk of T1D. For these reasons, many researchers have studied the potential mechanisms of EV involvement in T1D pathogenesis. In our laboratory, we have investigated the effects of coxsackievirus B5 (CVB5) infection on murine insulinoma MIN6 cells. Previously, we have reported that glucose-stimulated translation of SG proteins can be carried out in a cap-independent manner and is not shut down as part of the early effects of CVB5 infection on MIN6 cells. We have also observed that mature forms of SG proteins are being degraded during viral infection. As intracellular protein degradation is one of the major pathways to supply peptides for presentation on HLA I for immune recognition, we hypothesized that concomitant production and degradation of SG proteins upon viral infection could lead to altered presentation of mainly peptides derived from insulin SG component proteins and potentially drive the response of autoreactive T-cells. To address this hypothesis, we aimed to identify appropriate conditions to study the impact of EV infection on antigen presentation of ECN90 cells. To that end, we established a panel of markers examined by SDS-PAGE and immunoblotting. Stage of viral infection was assessed based on the detection of the viral protein VP1 and cleavage of cellular factors such as eukaryotic translation initiation factor 4 G (eIF4G), poly(A)-binding protein (PABP1), polypyrimidine tract-binding protein 1 (PTBP1), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) and caspase 3, which is mediated by viral proteases. Furthermore, we assessed the levels of ICA512 and chromogranin A and their pro-forms to estimate the size of insulin SG stores, and the expression of HLA I and β2 microglobulin to confirm sufficient antigen presentation. Peptides presented on both HLA I and II were isolated by immunoaffinity purification and identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. About 500 unique HLA I-presented peptides were found on average per replicate and condition with purity of 89% (peptides predicted to bind HLA alleles expressed by ECN90 cells). The distribution of unique peptides presented by infected ECN90 cells significantly differed from those presented by control cells as 54 unique peptides were present only in all infected samples and none of uninfected and 13 peptides were only found in uninfected cells. In total, we identified 26 unique peptides from known T1D autoantigens associated with SGs (e.g. insulin, chromogranin A, ICA512) in both conditions. The majority of them were predicted to bind HLA I alleles B*40:01 and A*02:01, while two identified viral peptides were found to bind B*40:01 and A*03:01 alleles. Both of the viral peptides and almost half of the peptides originating from known T1D autoantigens have not been described before. In addition, on average 300 unique HLA II peptides were found per replicate and condition. Similarly to HLA I peptides, the distribution of unique peptides across infected and control cells differed as well, showing that antigen presentation was altered in infected cells. We identified two viral HLA II-eluted peptides and peptides originating from only two known T1D autoantigens, 35 originated from insulin and 157 from chromogranin A. As most of the newly identified HLA I peptides originating from T1D autoantigens and one peptide from viral proteins were restricted by the allele HLA-B*40:01, our further efforts were invested in the development of a recombinant disulfide-stabilized biotinylated peptide-receptive HLA molecule of this allele. This technology has been extensively validated, and will allow us to test the wide array of novel peptides identified by us for the ability to bind this allele, as well as asses frequencies and responses of specific T-cells in subject populations relevant for T1D.