Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La ribavirine est un agent antiviral à large spectre efficace in vitro contre de nombreux virus à ARN dont certains sont responsables d'encéphalites. In vivo la mauvaise diffusion de cet analogue nucléosidique au niveau de la barrière hémato-encéphalique, limite son efficacité dans le traitement des encéphalites virales. Des études antérieures ont montré la capacité des cyclodextrines natives à former des complexes d’inclusion avec la ribavirine et l’amélioration de l’activité antivirale de la ribavirine in vitro lorsque celle-ci est complexée à l’alpha- ou la bêta-cyclodextrine. Le bénéfice de cette complexation in vivo, a été évalué sur un modèle murin d'encéphalite utilisant une souche neuroadaptée du virus de la rougeole (CAM/RB) inoculée par voie intracrânienne chez la souris CBA/ca âgée de 3 à 4 semaines. Le développement de l’infection a été contrôlé par détermination de la charge virale dans le cerveau des souris, à l’aide d’une RT-PCR quantitative en méthode TaqMan amplifiant le gène N du virus de la rougeole et d’une gamme étalon externe. Lorsque les souris sont traitées par voie intrapéritonéale par 40 mg/kg de ribavirine complexée à l’alpha-cyclodextrine, la morbidité et la mortalité liées à l’encéphalite rougeoleuse sont diminuées par rapport à l’administration de ribavirine libre et la charge virale diminue de façon significative dans le cerveau au jour J6. La complexation à la bêta-cyclodextrine n’apporte pas de bénéfice comparé à la ribavirine libre. Ces données suggèrent que l’alpha-cyclodextrine améliore in vivo le passage de la ribavirine au travers de la barrière hémato-encéphalique. La cinétique de la ribavirine dans le cerveau des souris traitées par le complexe ribavirine/alpha-cyclodextrine a été étudiée de 30 minutes à 48 heures après l’administration de doses uniques ou répétées de ribavirine libre ou complexée à différents dosages. La ribavirine a été purifiée par une technique d’extraction en phase solide et quantifiée par chromatographie liquide haute performance après élaboration d'une gamme de calibration ex vivo. La quantité de ribavirine retrouvée dans le cerveau est plus élevée lorsque la molécule est injectée sous forme de complexe chez la souris saine ou infectée. Ces données illustrent l'amélioration de survie observée au préalable et ce modèle d'étude a permis de mettre en évidence l'impact virologique et pharmacologique de la complexation d'une molécule antivirale à l'alpha-cyclodextrine. / The objective of this work was to study the antiviral activity of ribavirin on measles encephalitis infection when using cyclodextrins as carriers. Ribavirin is a water-soluble synthetic nucleoside with broad spectrum antiviral properties, but it is ineffective against major viral encephalitis because of a failure to cross the blood brain barrier. The use of cyclic oligosaccharides can promote the activity of many drugs and the benefit of the association of ribavirin with alpha- or beta-cyclodextrine has already been demonstrated in vitro. The antiviral activity of the ribavirin/cyclodextrin complexes has been evaluated in vivo using an experimental model based on intracranial injection of the rodent adapted CAM/RB strain of measles virus in CBA/ca mice. Measles encephalitis development was monitored daily by viral load determination in mice brain. Intraperitoneal administration of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin (40 mg/kg of ribavirin) decreased the morbidity and the mortality of measles virus infected mice compared to free ribavirin treatment and the viral load in the brain is reduced at day 6 post-inoculation. At the opposite beta-cyclodextrin did not enhanced ribavirin in vivo antiviral activity. The role of alpha-cyclodextrin thus required to be defined and notably the hypothesis of ribavirin permeation enhancement through the blood brain barrier. Ribavirin specific extraction from brain tissue was developed, based on a solid phase extraction. It was quantified by high performance liquid chromatography at different time points after intraperitoneal injection of single or multiple doses of free ribavirin or of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin. Whatever the tested doses, quantity of ribavirin in the brain is significantly higher when the drug is injected as a complex with alpha-cyclodextrin, in healthy or measles virus-infected mice. So pharmacokinetic of ribavirin in brain tissue explains the advantage of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin over ribavirin in protecting mice from intracerebral infection with measles virus and confirms the interest of cyclodextrin complexes for human central nervous system diseases treatment.

Les cellules épithéliales pulmonaires constituent la première ligne de défense face aux virus respiratoires via la sécrétion de mucus, de peptides, de cytokines et chimiokines qui déterminent l'élimination ou la progression de l’infection. Les principales cytokines antivirales produites par les cellules épithéliales alvéolaires (AEC) sont les interférons (IFN) type I (α/β) et III (λ). La liaison d’IFNβ à son récepteur induit une voie antivirale bien caractérisée qui aboutit à l’activation du complexe ISGF3 (STAT1, STAT2 et IRF9) qui permet la transcription de multiples gènes codant pour des protéines à activité antivirale et immunorégulatrice. Il a récemment été démontré que la costimulation des cellules épithéliales pulmonaires par l’IFNβ et le Tumor Necrosis Factor α (TNFα), également produit lors d’une infection, synergisent pour induire un état antiviral tardif distinct. D’autre part, il a été montré que la synergie entre le TNFα et l'IFNβ induit une voie de signalisation impliquant STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1 permettant l’expression du gène DUOX2. Notre but est de déterminer l’importance de cette nouvelle voie de signalisation induite par la costimulation du TNFα+IFNβ, impliquant STAT2 et IRF9 indépendamment de STAT1 dans la régulation d’un programme transcriptionnel antiviral et immunorégulateur tardif. Notre premier objectif est de déterminer si des gènes antiviraux et immunorégulateurs qui sont induits par la costimulation par TNFα+IFNβ sont dépendants de la voie STAT2/IRF9, indépendamment de STAT1. En utilisant la technique de qRT-PCR, nous avons identifié 3 gènes immunorégulateurs, CXCL10, IDO et APOBEC3G, induits de manière synergique en réponse à TNFα+IFNβ dans les cellules A549, un modèle de cellules épithéliales pulmonaires. Afin de confirmer que ces gènes sont induits indépendamment de STAT1, nous avons validé leur expression dans la lignée cellulaire U3A déficiente en STAT1. Par l'utilisation d'ARN interférants (ARNi) dirigés contre STAT2 et IRF9, nous avons confirmé que l’induction de ces gènes est dépendante de STAT2 et IRF9. Finalement, l’analyse de l’activité du promoteur de CXCL10 en réponse à TNFα+IFNβ par des essais rapporteurs luciférases a permis de montrer que la régulation se fait au niveau transcriptionnel. Notre deuxième objectif, est de déterminer si STAT6 pourrait remplacer STAT1 dans la voie de signalisation induite par TNFα+IFNβ. En effet, STAT6 est un inducteur connu de l’expression de DUOX2 en réponse à IL4+IL13. Contrairement à notre hypothèse, l’inhibition de STAT6 par ARNi augmente l’expression de DUOX2 en réponse à TNFα+IFNβ suggérant que STAT6 est un régulateur négatif. Nos résultats ont permis de comprendre de manière plus détaillée les mécanismes mis en place dans le développement d’une réponse antivirale. D’autre part, l’étude de l’effet de l’IFNβ et du TNFα est également pertinente pour les maladies chroniques inflammatoires et autoimmunes. De plus, nos résultats illustrent un nouveau paradigme concernant les mécanismes de signalisation cellulaire impliqués dans la synergie entre deux cytokines qui pourrait être applicable à des combinaisons de cytokines autres que TNFα+IFNβ. / Lung epithelial cells are the first line of defense against respiratory viruses via mucus secretion, peptides, cytokines and chemokines that determine the progression of the infection. The main antiviral cytokines produced by alveolar epithelial cells (AEC) are the interferons (IFN) type I (α / β) and III (λ). IFNβ binding to its receptor induces an antiviral pathway that is well characterized and leads to activation of the ISGF3 complex (STAT1, STAT2 and IRF9) which allows the transcription of multiple genes encoding proteins with antiviral and immunoregulatory activity. It has recently been shown that the costimulation of lung epithelial cells by IFNβ and Tumor Necrosis Factor α (TNFα), also produced during infection, induces a separate and late antiviral state, through synergy. On the other hand, it has been shown that the synergy between IFNβ+TNFα induces a signaling pathway involving STAT2 and IRF9 independently of STAT1 permitting the expression of the DUOX2 gene. Our goal is to determine the importance of this new signaling pathway induced by costimulation of TNFα+IFNβ involving STAT2 and IRF9 regardless of STAT1 in regulating the antiviral immunoregulatory and late transcriptional program. Our first objective is to determine whether antiviral and immunomodulatory genes that are induced by costimulation TNFα+IFNβ are dependent on the STAT2/IRF9 way, indenpant of STAT1. Using the technique of qRT-PCR, we identified 3 immunoregulatory genes, CXCL10, IDO and APOBEC3G, synergistically induced in response to TNFα+IFNβ in A549 cells, a model of pulmonary epithelial cells. To confirm that these genes are induced independantly of STAT1, we validated their expression in the STAT1 deficient cell line, U3A. By the use of interfering RNA (siRNA) directed against STAT2 and IRF9, we confirmed that the induction of these genes is dependent STAT2 and IRF9. Finally, the analysis of the activity of CXCL10 promoter in response to TNFα+IFNβ by luciferase reporter assays has shown that the regulation is at the transcriptional level. Our second objective is to determine whether STAT6 could replace the STAT1 in the signaling pathway induced by TNFα+IFNβ. Indeed, STAT6 is a known inducer of the expression of DUOX2 in response to IL4+IL13. Contrarily to our hypothesis, inhibition of STAT6 by RNAi increases the expression of DUOX2 in response to TNFα+IFNβ suggesting that STAT6 is a negative regulator. Our results allow the understanding of the mechanisms in the development of an antiviral response in more detail. On the other hand, the study of the effect of IFNβ and TNFα is also relevant for chronic inflammatory and autoimmune diseases. In addition, our results illustrate a new paradigm for cell signaling mechanisms involved in the synergy between two cytokines that may be applicable to combinations of cytokines other than TNFα+IFNβ.

Le traitement utilisé actuellement contre le virus de l’hépatite C présente une efficacité limitée et induit d’importants effets secondaires. La délivrance de molécules antivirales spécifiquement dans les cellules infectées devrait permettre d’améliorer leur efficacité.Ce travail présente le développement d’une nouvelle approche utilisant à son profit la machinerie de réplication virale pour délivrer une molécule antivirale aux seules cellules infectées. Cette stratégie repose sur l’utilisation d’ARN non codants réplicables (nrRNA) portant les structures reconnues par le complexe de réplication du VHC, encadrant la séquence complémentaire d’un gène antiviral. Le complexe de réplication du VHC réplique le nrRNA comme s’il s’agissait du génome viral, permettant ainsi la synthèse d’un ARN codant à partir duquel la molécule antivirale est exprimée. Les cellules non-infectées n’exprimant pas le complexe de réplication, cette machinerie spécifique peut être utilisée et détournée, de façon à cibler les cellules infectées sans impact sur les cellules saines.Nous montrons ici que cette approche s’avère efficace contre le réplicon (génotype 1b) et le virus JFH-1 (génotype 2a) : les nrRNA induisent une forte baisse de la quantité d’ARN et de complexe de réplication viral. Ces effets sont corrélés à une forte activation de la transcription de différents gènes de la réponse IFN de type I.Nous avons également vérifié l’innocuité de ce système sur les cellules non infectée en utilisant des nrRNA RicineA. La réplication et la traduction de ces nrRNA conduit à la mort cellulaire par inactivation des ribosomes. Mais la viabilité des cellules non infectées par le VHC n’est pas perturbée, signe que les nrRNA RicineA ne sont ni répliqués ni traduits en absence du complexe de réplication viral.La vectorisation des nrRNA a également été développée au moyen de particules lentivirales modifiées. Nous testons désormais la réplication et la traduction des nrRNA dans un modèle murin, en vectorisant ces ARN par injection hydrodynamique ou par l’intermédiaire des particules lentivirales. / The current treatment used against Hepatitis C Virus has a limited efficacy and is often hampered by the induction of side-effects. The specific delivery of antiviral proteins in infected cells should increase their efficiency and reduce their impact on healthy cells.Here, we describe the development of a new approach which takes advantage of the viral replication machinery to specifically target the antiviral protein expression to the infected cells. The strategy is based on the delivery of a non-coding replicative RNA (nrRNA) carrying the structures required for the binding of the viral replication complex, flanking the complementary sequence of an antiviral gene. The HCV replication complex replicates the nrRNA similarly to the viral genome to give a coding RNA from which the antiviral protein will be expressed. As non-infected cells do not express the replication complex, this specific machinery can be used to target virus-infected cells without affecting healthy cells.We show that this approach can be successfully applied in both replicon-harboring cells (genotype 1b) and JFH-1 infected cells (genotype 2a) : nrRNAs induced a strong decrease in genomic RNA and viral protein NS5A. These effects were correlated with a strong activation of several interferon stimulated genes.We also verify the harmlessness of the system in uninfected cells by transfecting a RicinA nrRNA. The replication and translation of this nrRNA lead to the cell death by ribosomes inactivation. But nothing occurs in non?infected cells, showing that nrRNA are neither replicated nor translated in absence of the HCV replication complex.The vectorisation of nrRNa was also developed by the use of modified lentivirale particles. We now test the efficient replication and translation of nRNAs in a murin model by using hydrodynamic transfection or the lentiviral delivery of nrRNAs.

Dans les organismes multicellulaires, la régulation de l’expression des gènes par les microARNs est un mécanisme essentiel pour le développement cellulaire et l’homéostasie. De plus, le rôle des microARNs a été démontré dans de nombreux processus immunitaires, tels que l’inflammation. Les virus évoluant conjointement avec leurs hôtes, ils ont appris à détourner la machinerie cellulaire pour leur propre bénéfice. Ainsi, des microARNs codés par certains génomes viraux ont été mis en évidence, mais leurs fonctions, ainsi que leurs cibles, restent encore largement inconnues. En utilisant une lignée de souris présentant une mutation hypomorphe pour le gène dicer, caractérisée par une diminution de la production des microARNs, et son hôte naturel, le cytomégalovirus murin, un virus membre de la famille des β-Herpesvirus, nous avons étudié le rôle potentiel des microARNs d’origine cellulaire et virale dans la pathogénèse de ce virus. Lors de l’infection aigüe, nos résultats montrent un rôle dominant et protecteur des microARNs cellulaires, comparé à celui des microARNs viraux, prédits pour être des facteurs de pathogénicité. / In multicellular organisms, gene expression regulation by microRNAs is an essential mechanism for cell development and homeostasis. Moreover, several immune-related processes, such as inflammation, have been demonstrated to require specific microRNAs. As viruses have coevolved with their host, they have learned to hijack the cellular defenses for their own benefit. Thus microRNAs-encoding genes were also recently discovered in the genome of Herpesviruses, but up to now, the function and the targets of most microRNAs of viral origin are still largely unknown. Using a hypomorphic mouse mutant line, characterized by a diminished production of microRNAs, and the Mouse Cytomegalovirus, a natural pathogen of mice which belongs to the family of β-Herpesviruses, we investigated the potential roles of microRNAs of both cellular and viral origin in the pathogenesis of this virus. Our results point toward a dominant role of cellular microRNAs as protective factors compared to virally-derived microRNAs which are usually predicted to carry pathogenic functions in acute infections.

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie chronique multifactorielle. Les infections entérovirales, en particulier à Coxsackievirus du groupe B (CVB), et notamment CVB4, transmises par voie digestive, constituent le facteur de risque le plus souvent évoqué dans la littérature. Plusieurs mécanismes physiopathologiques sont proposés pour expliquer cette relation entre CVB4 et diabète de type 1. Il s’agit, entre autres, du tropisme préférentiel de CVB4 pour les ilots et les cellules β pancréatiques et l’inflammation qui s’ensuit, de la persistance du virus au niveau des cellules infectées qui pourrait constituer un facteur déterminant dans le processus d’altération des cellules endocrines, de l’exacerbation possible de l’infection par des d’anticorps facilitateurs ou encore du mimétisme moléculaire entre les auto-antigènes et les antigènes viraux. Par ailleurs des auteurs ont montré que la cause de la déplétion des cellules β chez des souris infectées par la souche diabétogénique CVB4E2 est un défaut de régénération plutôt qu’une destruction directe de ces cellules par le virus. La présence de constituants entéroviraux dans les cellules ductales du pancréas de patients diabétiques a été observée. Le diabète de type 1, qui serait l’expression finale d’un long processus, survient généralement chez des sujets jeunes, c’est pourquoi l’hypothèse que le tissu pancréatique jeune serait plus permissif aux infections à CVB4 n’est pas exclue. La prévention des infections virales reste le meilleur moyen de protéger les individus contre les maladies qu’elles provoquent. Un intérêt particulier est aujourd’hui accordé à la mise en évidences et à la caractérisation d’inhibiteurs antiviraux à large spectre. L’absence d’allaitement maternel est associé à un risque plus élevé de diabète de type 1, mais la nature du ou des facteurs du lait conférant une protection est mal connue, et l’activité anti-CVB4 du lait maternel n’a pas été étudiée jusqu’à présent. Objectifs : Nous avons émis l’hypothèse que CVB4 pouvait infecter des cellules humaines précurseurs de cellules endocrines, impliquées dans la régénération des îlots. L’infection de ces cellules par CVB4E2 et ses conséquences ont été étudiées ; nous avons utilisé des cellules humaines précurseurs canalaires primitives et la lignée continue de cellules Panc-1, dont la différenciation in vitro est possible. La permissivité au CVB4 du tissu pancréatique selon l’âge a été étudiée ex vivo chez le rat et l’existence d’inhibiteurs antiviraux à large spectre est notamment explorée dans l’intestin de souris. L’activité anti-CVB4 du lait maternel susceptible de protéger, à un âge critique, le jeune enfant vis-à-vis d’un virus diabétogène a été étudiée in vitro et l’hypothèse que le lait humain pourrait prévenir le déclenchement du DT1 chez la souris NOD a également été évaluée in vivo. / Type 1 diabetes (T1D) is a chronic multifactorial disease. Enteroviral infections, especially those with group B coxsackieviruses, and in particular the B4 serotype (CVB4), mainly transmitted by the fecal-oral route, are among the environmental factors most able to be involved in the pathogenesis of the disease. Several pathophysiological mechanisms have been proposed to explain this relationship between CVB4 and T1D. Among these mechanisms, the preferential tropism of CVB4 for islets and pancreatic β cells and the resulted inflammation; virus persistence in infected cells which can constitute an important factor in the process leading to endocrine cells alteration; the possible worsening of the infection by enhancing antibodies or molecular mimicry between self-antigens and viral antigens. Moreover, some studies have demonstrated that β-cell depletion in mice infected with the diabetogenic strain CVB4E2 is due to lack of regeneration rather than direct destruction of these cells by the virus. Enteroviral constituents have been detected in pancreatic ductal cells of T1D patients. Type 1 diabetes is a final expression of a long process usually occurring in young children. Therefore, the hypothesis that the pancreatic tissue of young subjects is more permissive to CVB4 infection can not be excluded. Prevention of viral infections is the best way to protect people against diseases they cause. Thus, identification and characterization of broad-spectrum antiviral inhibitors are of particular interest. A lower risk of T1D is associated with breastfeeding, however, the support of the breast milk protective effect has not been clarified, and the neutralizing activity of breast milk in vitro against CVB4 has not been studied so far.

Le cytomégalovirus humain (HCMV), un membre de la famille des Herpesviridae, cause des infections latentes chez plus de la moitié (60 %) de la population dans les pays développés. Cette proportion peut atteindre jusqu’à la totalité (100%) de la population dans les pays en voie de développement. Sa primo-infection chez le foetus en développement ou chez le nouveau-né ainsi que sa réactivation chez les individus immunodéprimés sont associés à de nombreux cas de morbidité et de mortalité. L’infection congénitale est l’infection à HCMV la plus importante et engendre un coût économique de plus de 2 milliards de dollars américains chaque année. Aucun vaccin n’est approuvé à ce jour pour la prévention de l’infection à HCMV. Cependant, des antiviraux sont disponibles pour le traitement de cette infection. Parmi ceux-ci, on retrouve trois types d’analogues : un analogue nucléosidique (ganciclovir), un analogue nucléosidique monophosphaté (cidofovir) et un analogue du pyrophosphate inorganique (foscarnet). Ces antiviraux ont tous comme cible commune l’ADN polymérase virale. Toutefois, de nombreuses souches résistantes à ces antiviraux sont retrouvées chez certains individus infectés. Ces souches résistantes présentent de nombreuses mutations au niveau du gène viral qui encode pour l’ADN polymérase UL54 du cytomégalovirus. Jusqu’à présent dans la littérature, seule l’association entre les mutations et la résistance antivirale a été proposée. Les travaux présentés dans ce mémoire visent à mieux comprendre l’effet des mutations sur la liaison des antiviraux à la polymérase et donc éventuellement élucider le mécanisme moléculaire de résistance aux antiviraux chez ce pathogène. Cette recherche a permis de déterminer que les mutations, associées à la résistance antivirale, affectent la liaison optimale des désoxynucléotides (dNTPs) et bloquent la liaison de l’antiviral (foscarnet) à l’ADN polymérase virale UL54. Toutefois, ces mutations n’affectent pas la liaison de l’ADN simple brin à celle-ci. De plus, selon l’étude présentée ici, les mutations n’affectent pas le repliement global de l’ADN polymérase virale. Le mécanisme de résistance moléculaire semble donc avoir un impact très local sur la protéine. Peu d’informations sur la structure de cette polymérase virale sont disponibles à ce jour dans la littérature. Il serait donc pertinent d’élucider la structure cristallographique de cette polymérase pour éventuellement étudier l’effet structural des mutations sur la polymérase et ainsi élucider le ou les mécanismes moléculaires de résistance aux antiviraux.

Dans une ère où les moustiques modifiés commencent à être utilisés ou envisagés pour contrôler les épidémies de Dengue ou malaria, le manque de connaissance sur l’immunité des insectes vecteurs envers certains pathogènes se fait cruellement ressentir. Pourtant la possibilité de changements de vecteurs, dû à un changement de leur immunité, provoquée par l’Homme est réelle. Pour déterminer la contribution de l’immunité dans différents compartiments du vecteur contre divers pathogènes avons étudié la réponse antivirale dans la première barrière de transmission chez le moustique vecteur de la malaria après une infection par un repas sanguin. Nous montrons que les réponses antivirales sont différentes entre compartiments, et proposons un modèle où des interactions tripartites entre le virus, l’immunité du moustique et la flore entérique interagissent pour contrôler l’infection précoce du moustique après le repas sanguin. De façon surprenante, nous avons également montré que la voie de l’ARN interférence n’a pas d’effet antiviral dans ce compartiment. Nous suggérons que cette voie est utilisée par le parasite Plasmodium pour détourner la réponse antiparasitaire médiée par Toll, grâce à un facteur de virulence de nature ARN double brin. Nous avons également montré que des biais expérimentaux lors de l’infection des insectes ont conduit à l’élaboration d’un dogme disant que la voie de l’ARN interférence est la voie antivirale principale des insectes, mais nos resultats suggèrent que malgré l’importance de cette voie pour controler l’intensité de la réplication virale lors de l’infection disséminée, cette voie n’a aucune fonction antivirale lors de l’infection initiale du tube digestif. Néanmoins, le séquençage des produits de cette voie permet d’assembler de-novo des génomes de virus commensaux. Les résultats de ces travaux montrent très clairement qu’il faut évaluer le rôle et l’impact de toute modification d’insectes vecteurs pour plusieurs classes de pathogènes. Cela ouvre également de nombreux nouveaux champs de recherches et pose de nombreuses nouvelles questions. / In an era where modified mosquitoes are starting to be used in nature for controlling malaria and Dengue, lack of knowledge about immunity of mosquito vectors to some pathogen classes are becoming more evident. The risks for human-provoked vector shifts of pathogens transmission have not been examined. To fill these gaps, we assessed the antiviral immunity of the malaria vector, Anopheles gambiae, in the strongest mosquito bottleneck for pathogens, the midgut infection barrier after an infective bloodmeal. This work shows that the antiviral responses are different and highly compartmentalized between the midgut and systemic immunity. We propose a model where tripartite interactions between virus, mosquito immunity and enteric flora control early arboviral infection in the midgut. Surprisingly, we showed that while the siRNA pathway had no evident anti-arbovirus activity in the midgut, it was used by Plasmodium to evade mosquito immunity. A virus-like elicitor of double strand RNA nature is transferred from the parasite at the ookinete stage to the mosquito midgut cells, resulting in a shift of immune balance from anti-parasite response to an antiviral-like response. Importantly, our work shows that biases in experimental infection methods led to the misconstruction of a dogma stating that siRNA is the main antiviral pathways in insects, at least in the midgut compartment. And that the use of the pathway products can be successfully used to de-novo assemble previously unknown viruses from the virome. This work indicates that immune modifications in vectors need to be evaluated for changes of vectorial competence to different pathogens. It also opens numerous avenues of research and raises a lot of interesting questions that will need to be investigated in the future.

Les arbovirus (virus transmis par des arthropodes) sont à l'origine de maladies humaines telles que la dengue, le chikungunya ou encore le Zika. Le moustique Aedes aegypti, est le vecteur majeur de ces trois arbovirus. La faible efficacité des méthodes de contrôle des populations de moustiques, principalement réalisées au moyen d'insecticides chimiques ouvre un champ de développement de nouvelles approches en lutte antivectorielle. Le moustique, hôte vecteur, contrôle la réplication virale en limitant les réponses immunitaires antivirales. La machinerie RNA interférence (RNAi) est la voie jouant un rôle majeur dans l'immunité antivirale chez le moustique. Alors que le rôle des deux voies, siRNA (" small interfering RNA ") et piRNA (" piwi-interfering RNA "), est de mieux en mieux compris dans les réactions antivirales du vecteur, peu de connaissances sont disponibles à ce jour en ce qui concernent les interactions entre la voie miRNA (" micro RNA ") et les arbovirus. Ainsi, nous proposons une analyse détaillée des mécanismes par lesquels les miARN tentent de réguler la réplication virale chez le moustique. Dans la première partie de la thèse, nous avons effectué une analyse génomique pour identifier les miRNAs pouvant interagir chez Ae. aegypti avec divers lignées/génotypes des virus chikungunya (CHIKV), de dengue (DENV) et de Zika. Avec l'aide d'outils de prédiction faisant appel à divers algorithmes, plusieurs sites de liaison de miARN avec différents lignées/génotypes de chaque arbovirus ont été identifiés. Nous avons ensuite sélectionné les miARN pouvant cibler plus d'un arbovirus et nécessitant un faible seuil d'énergie lors de la formation des complexes entre l'ARNm. / Mosquito-borne arboviruses cause some of the world’s most devastating diseases and are responsible for recent dengue, chikungunya and Zika pandemics. The yellow-fever mosquito. Aedes aegypti, plays an important role in the transmission of all three viruses. The ineffectiveness of chemical control methods targeting Ae. aegypti makes urgent the need for novel vector-based approaches for controlling these diseases. Mosquitoes control arbovirus replication by triggering immune responses. RNAi machinery is the most significant pathway playing a role on antiviral immunity. Although the role of exogenous siRNA and piRNA pathways in mosquito antiviral immunity is increasingly better understood, there is still little knowledge regarding interactions between the mosquito cellular miRNA pathway and arboviruses. Thus further analysis of mechanisms by which miRNAs may regulate arbovirus replication in mosquitoes is pivotal. In the first part of the thesis, we carried out genomic analysis to identify Ae. aegypti miRNAs that potentially interact with various lineages and genotypes of chikungunya (CHIKV), dengue (DENV) and Zika viruses. By using prediction tools with distinct algorithms, several miRNA binding sites were commonly found within different genotypes/and or lineages of each arbovirus. We further analyzed the miRNAs that could target more than one arbovirus and required a low energy threshold to form miRNA-vRNA (viral RNA) complexes and predicted potential RNA structures using RNAhybrid software. Thus, we predicted miRNA candidates that might participate in regulating arboviral replication in Ae. aegypti. In the second part of the thesis, we developed a miRNA-based approach that results in a dual resistance phenotype in mosquitoes to dengue serotype 3 (DENV-3) and chikungunya (CHIKV) viruses for stopping arboviruses spreading within urban cycles. The target viruses are from two distinct arboviral families and the antiviral mechanism is designed to function through the endogenous miRNA pathway in infected mosquitoes. Ten artificial antiviral 4 miRNAs capable of targeting ~97% of all published strains were designed based on derived consensus sequences of CHIKV and DENV-3. The antiviral miRNA constructs were placed under control of either an Aedes PolyUbiquitin (PUb) or Carboxypeptidase A (AeCPA) gene promoter triggering respectively expression ubiquitously in the transgenic mosquitoes or more locally in the midgut epithelial cells following a blood meal. Challenge experiments using viruses added in blood meals showed subsequent reductions in viral transmission efficiency in the saliva of transgenic mosquitoes as a result of lowered infection rate and dissemination efficiency. Several components of mosquito fitness, including larval development time, larval/pupal mortality, adult lifespan, sex ratio, and male mating competitiveness, were examined: transgenic mosquitoes with the PUb promoter showed minor fitness costs at all developing stages whereas those based on AeCPA exhibited a high fitness cost. Further development of these strains with gene editing tools could make them candidates for releases in population replacement strategies for sustainable control of multiple arbovirus diseases.