Enquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e &#945-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 &#177 0,20 e 7,7 &#177 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice &#945 . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-&#945 do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro. / Human cells synthesize purine nucleotide by again and salvage pathways, while parasitic protozoa use only salvage pathways. For this reason, the enzymes that compound the salvage pathway are important targets to development of new antiparasitic drugs. The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) converts adenine and &#945-D-5-phosphoribosyll-pyraphosphate (PRPP) to adenosine monophosphate (AMP) at salvage pathway. In this work, the APRT and APRT-His recombinants had been characterized by biochemical and spectroscopic methods. The expression of the aprt genes from L. tarentolae inserted into pET29+ (Novagen) and pQ30 (Qiagen) vectors yielded 5 and 10 mg.mL-1 of the APRT and APRT-His, on soluble form, respectively. The APRT remained stable and homogeneous in vitro at Tris pH 7.5 containing 5 mM MgSO4 and 150 mM KCl, but APRT-His was instable and insoluble above 0.5 mg.mL-1 at the same pH. The solubility study showed that histidine increased the APRT-His solubility and it is partially stabilized at Tris pH 8.5 containing 150 mM KCl. The addition of the histidine 50 mM was efficient for concentrations up to 8 mg.mL-1.Then, the APRT-His was purified and storage in that buffer for spectroscopic assays. The biochemical characterization of the APRT and APRT-His indicated that a both are dimercs in its buffers, and they have isoelectric points at pH 6.45 &#177 0.20 and 7.7 &#177 0.16, respectively. By enzymatic activity assays, the APRT is twice activer than APRT-His. The CD spectra of the APRT-His were more intense than the APRT spectra. and showed helix &#945 profile. The fluorescence spectra marked a maximum emission fluorescence at 342 nm for the APRT-His and 332 um for the APRT. In addition, the spectra revealed that PRPP and AMP quenched the fluorescence of the tryptophan (Trp) into APRT. The quench was related to position of the ligands inside active site of the enzyme and the absent of fluorescence of the Trp, inside APRT-His, was related to absent of the Mg2+. The results has demonstrated that the presence of the histidine residues at N-terminal region of the APRT-His induced to conformational changes of the enzyme following to continuos precipitation. In the same sense, the absent of histidine residues associated to enzyme favored to stability of the protein in vitro.

Enquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e &#945-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 &#177 0,20 e 7,7 &#177 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice &#945 . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-&#945 do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro. / Human cells synthesize purine nucleotide by again and salvage pathways, while parasitic protozoa use only salvage pathways. For this reason, the enzymes that compound the salvage pathway are important targets to development of new antiparasitic drugs. The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) converts adenine and &#945-D-5-phosphoribosyll-pyraphosphate (PRPP) to adenosine monophosphate (AMP) at salvage pathway. In this work, the APRT and APRT-His recombinants had been characterized by biochemical and spectroscopic methods. The expression of the aprt genes from L. tarentolae inserted into pET29+ (Novagen) and pQ30 (Qiagen) vectors yielded 5 and 10 mg.mL-1 of the APRT and APRT-His, on soluble form, respectively. The APRT remained stable and homogeneous in vitro at Tris pH 7.5 containing 5 mM MgSO4 and 150 mM KCl, but APRT-His was instable and insoluble above 0.5 mg.mL-1 at the same pH. The solubility study showed that histidine increased the APRT-His solubility and it is partially stabilized at Tris pH 8.5 containing 150 mM KCl. The addition of the histidine 50 mM was efficient for concentrations up to 8 mg.mL-1.Then, the APRT-His was purified and storage in that buffer for spectroscopic assays. The biochemical characterization of the APRT and APRT-His indicated that a both are dimercs in its buffers, and they have isoelectric points at pH 6.45 &#177 0.20 and 7.7 &#177 0.16, respectively. By enzymatic activity assays, the APRT is twice activer than APRT-His. The CD spectra of the APRT-His were more intense than the APRT spectra. and showed helix &#945 profile. The fluorescence spectra marked a maximum emission fluorescence at 342 nm for the APRT-His and 332 um for the APRT. In addition, the spectra revealed that PRPP and AMP quenched the fluorescence of the tryptophan (Trp) into APRT. The quench was related to position of the ligands inside active site of the enzyme and the absent of fluorescence of the Trp, inside APRT-His, was related to absent of the Mg2+. The results has demonstrated that the presence of the histidine residues at N-terminal region of the APRT-His induced to conformational changes of the enzyme following to continuos precipitation. In the same sense, the absent of histidine residues associated to enzyme favored to stability of the protein in vitro.

Made available in DSpace on 2014-06-03T19:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 44.pdf: 10707792 bytes, checksum: c5125ab7f60ab003fc772f74c8c4517f (MD5) 44.pdf.txt: 668966 bytes, checksum: 99d869753275b20698a78896e6240b59 (MD5) 44.pdf.jpg: 1554 bytes, checksum: 1e3f2b67d245dd5c72e348d82e4541ba (MD5) Previous issue date: 2004 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / BUSCA DE PRODUTOS NATURAIS BIOATIVOS EM PLANTAS DAS FAMÍLIAS MYRTACEAE (Siphoneugena densiflora Berg) E VERBENACEAE (Vitex polygama Cham.). Neste trabalho estão sendo descritas trinta e sete substâncias identificadas de V. polygama Cham. e trinta e duas de S. densiflora Berg, provenientes do estudo fitoquímico de seus respectivos extratos. Destas, quatro substâncias isoladas de S. densiflora são destacadas por serem inéditas na literatura, a saber: 6βhidroximaslinato de βD-glucopiranosila; 4-O-α-L-2 -O-acetilramnopiranosídeo do ácido elágico e seu regioisômero com o grupo acetila na posição 3 e a siphoneugenina. São relatadas as atividades inibitórias enzimáticas de várias das substâncias identificadas, e de seus extratos de origem, sobre as enzimas gliceraldeído -fosfatodesidrogenase glicossomal (gGAPDH), de Trypanosoma cruzi; adenina fosforribosiltransferase (APRT), de Leishmania tarentolae; e pectinase, do fungo Leucoagaricus gongylophorus, simbionte da formiga cortadeira Atta sexdens rubropilosa. Dentre todas as substâncias testadas, os taninos castalagina e casuarinina se revelaram os mais promissores inibidores com valores de CI50 de 7,5 e 1,8 µM sobre a gGAPDH e 3,3 e 1,8 µM sobre a APRT, respectivamente. Como os taninos podem precipitar proteínas e causar uma ação inibitória não específica, foram realizados estudos sobre a interação deles com os reagentes dos ensaios enzimáticos. São relatadas as atuações biológicas in vitro de algumas substâncias sobre as formas tripomastigotas de T. cruzi; sobre as lagartas de 1º e 2º instar da mariposa, praga do milho, Spodoptera frugiperda; sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Micrococcus roseus e sobre os fungos Leucoagaricus gongylophorus, Candida albicans, Cryptococcus laurentii, Sacharomyces cerevisae e Trichosporon cutaneum. A mistura dos flavonóis glicosilados 3-O + 4 -O-β-D-glucopiranosil quercetina apresentou a maior atividade tripanocida (1,1 mM; 97 % lise contra 0,6 mM; 100 % lise da violeta genciana), ressaltando-se que sua CI50 sobre a gGAPDH foi de 20 µM. Os extratos metanólicos e hidrometanólicos dos galhos, caule, folhas e cascas da raiz de S. densiflora causaram 100 % de morte das lagartas de S. frugiperda, a uma concentração de 1000 ppm. Do extrato metanólico de folhas de S. densiflora foram isolados dois flavonóides: quercetina e quercitrina que, a uma concentração de 100 ppm, provocaram 78 e 85 % de morte das lagartas. Os taninos casuarinina e 4-O-α-raminopiranosídeo do ácido elágico, na mesma concentração, atuaram principalmente como fagoinibidores. O extrato hidrometanólico de folhas de V. polygama teve uma atividade inseticida de 60 % sobre S. frugiperda a uma concentração de 1000 ppm. Dele foram isoladas as misturas das flavonas di-C-glicosiladas carlinosídeo, schaftosídeo e seus respectivos isômeros, os quais apresentaram atividade inseticida relatada na literatura (SIMMONDS, 2001). O extrato hidrometanólico de folhas de S. densiflora apresentou uma atividade bactericida (halo de inibição de 11 mm) tão intensa quanto a do antibiótico tetraciclina (10 e 12 mm) para as bactérias P. aeruginosa e M. roseus. Das substâncias ensaiadas, apenas a mistura do cafeoil-6-O-a + β-D-glicopiranosídeo foi relativamente ativa sobre o fungo L. gongylophorus causando 60 % de inibição de seu crescimento, a uma concentração de 50 µg/mL. Também está sendo narrado o desenvolvimento de um método, usando-se CLAE, para a análise e quantificação da 20-hidroxiecdisona presente no extrato metanólico de galhos de V. polygama, em virtude de suas inúmeras atividades biológicas e grande uso e importância na indústria farmacêutica.

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