Among the great challenges in biology are the precise quantification of specific sets of proteins and analyses of their patterns of interaction on a much larger scale than is possible today. This thesis presents a novel protein detection technique - proximity ligation - and reports the development and application of a nucleic acid amplification technique, RCA. Proximity ligation converts information about the presence or co-localization of specific proteins to unique sets of nucleic acid sequences. For detection of target proteins or protein complexes the coincident binding by pairs or triplets of specific protein-binding reagents are required. Oligonucleotide-extensions attached to those binding reagents are joined by a DNA ligase and subsequently analyzed by standard molecular genetic techniques. The technique is shown to sensitively detect an assortment of proteins using different types of binders converted to proximity probes, including SELEX aptamers and mono- and polyclonal antibodies. I discuss factors important for using the technique to analyze many proteins simultaneously. Quantification of target molecules requires precise amplification and detection. I show how rolling circle amplification, RCA, can be used for precise quantification of circular templates using modified molecular beacons with real-time detection. The combination of proximity-probe templated circularization and RCA results in a sensitive method with high selectivity, capable of visualizing individual immobilized proteins. This technique is used for localized detection of a set of individual proteins and protein complexes at sub-cellular resolution.

Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Eignung bakterieller Hüllproteine als Bindungsmatrix für die Kopplung funktionaler Moleküle mit dem Ziel, sensorische Schichten zu erzeugen. Bakterielle Hüllproteine sind biologische SAMs, anderen Oberfläche sich modifizierbare COOH-, NH2- und OH-Gruppen befinden. Die Ausbildung polymerer Strukturen erfolgt dabei in wässrigen Systemen und auf Oberflächen. Im Zuge der boomenden Entwicklung von Biosensoren werden insbesondere Biotemplate gesucht, die zwischen biologischer Komponente und Sensoroberfläche vermitteln. Bakterielle Hüllproteine stellen eine solche Zwischenschicht dar. Als Anwendungsbeispiel wurden die Proteine daher mit einem FRET-Paar und Thrombin und Kanamycin-Aptameren modifiziert. Hierbei wurden das FRET-Paar H488 und H555 an die bakteriellen Hüllproteine der beiden Haldenisolate A12 und B53 mittels EDC mit einer Modifizierungsrate von 0,54 molFarbstoff/molProtein kovalent gebunden. Bei der vorhandenen p4-Symmetrie bedeutet dies, dass ein FRET-Paar pro Einheitszelle vorhanden war. Der Nachweis eines Energietransfers zwischen den beiden am Protein gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen H488 und H555 erfolgte mittels statischer und zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Energietransfer nur möglich war, wenn die Proteine in polymerer Form vorlagen, unabhängig davon, ob sich die Proteine immobilisiert an einer Oberfläche oder in wässriger Lösung befanden. Mittels Variieren des Donor-Akzeptor-Verhältnisses konnte ein maximaler Energietransfer von 40 % generiert werden, wenn das Verhältnis der Fluoreszenzfarbstoffe von Donor und Akzeptor 4 betrug. Die Fluoreszenzintensität der Fluorophore wurde durch die Bindung an die Proteine nicht verringert oder gelöscht. Dies legt nahe, dass die Farbstoffe in den hydrophoben Poren immobilisiert wurden und die Poren die Fluoreszenzfarbstoffe schützen. Um weitere Aussagen über die Lage der gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe zu erhalten, wurden die bakteriellen Hüllproteine der Stämme A12 und B53 enzymatisch verdaut und die Fragmente mittels SEC und SDS-PAGE untersucht. Dabei zeigten sich je nach Enzym und Protein unterschiedliche Bandenmuster bezüglich modifizierter und nativer Hüllproteine. Dies belegt, dass die Fluoreszenzfarbstoffe an NH2-und COOH-Gruppen der Proteine gebunden wurden und so teilweise den enzymatischen Verdau hinderten. Die SEC deutet an, dass die Fluoreszenzfarbstoffe an verschiedenen Stellen am Protein gebunden wurden. In einem zweiten Beispiel wurde das bakterielle Hüllprotein von A12 mit einem Aptamer modifiziert. Aptamere sind kurze einzelsträngige Oligonukleotide, die u.a. mittels ihrer ausgebildeten 3D-Struktur spezifisch Zielstrukturen reversibel binden können. Die hier verwendeten Aptamere binden spezifisch Thrombin und Kanamycin. Die Aptamere wurden mit Hilfe einer der beiden Vernetzer PMPI oder Sulfo-SMCC an die bakteriellen Hüllproteine kovalent gebunden. Nach dem Modifizieren der Proteine wurden diese auf entsprechenden Sensorchips immobilisiert und die Aktivität des gekoppelten Aptamers mittels Affinitätsmessungen, SPR-Spektroskopie und QCM-D-Messungen analysiert. Die Funktion des gebundenen Thrombinaptamers konnte mittels Affinitätsmessungen und QCM-D nachgewiesen werden und entspricht in beiden Fällen einer Bindung von 2 nmol Thrombin pro Quadratzentimeter. Die Funktionalität des Kanamycinaptamers sollte mittels SPR bestimmt werden, jedoch konnte keine Funktionalität des gekoppelten Kanamycinaptamers nachgewiesen werden. Alle Messungen bestätigten jedoch, dass die Bindungsmatrix aus bakteriellen Hüllproteinen keinerlei oder nur ein sehr geringes Hintergrundsignal liefert. Werden nun beide Komponenten, FRET-Paar und Aptamere, an das Protein gebunden, ist es möglich, eine sensorische Schicht zu erzeugen. Die Zielstruktur, welche detektiert werden soll, wird an das Aptamer gebunden und so in räumliche Nähe zur Sensorfläche gebracht. Stell die Zielstruktur einen Fluoreszenzlöscher dar, so wird der Energietransfer durch die räumliche Nähe des Fluoreszenzlöscher gestört. Die Detektion des Zielmoleküls erfolgt nun über die Änderung von Fluoreszenzintensitäten. Die hier vorgelegte Arbeit soll einen Grundstein legen für die Entwicklung eines solchen Sensors und insbesondere die Detektion eines Energietransfers optimieren und Schwachstellen in der Detektion nachweisen. Die systematische Untersuchung der Fluoreszenzfarbstoffe auf dem Protein ermöglichen es, in zukünftigen Arbeiten einen FRET zweifelsfrei zu detektieren. Die Modifizierung von bakteriellen Hüllproteinen von A12 mit Aptameren und die Detektion der Funktionalität der Aptamere mittels verschiedener Methoden zeigte auf, dass die bakteriellen Hüllproteine als universelle Bindungsmatrix für sensorische Moleküle dienen können, bei denen Affinitätsmessungen, SPR- oder QCM-D-Messungen genutzt werden. Besonders hervorzuheben ist, dass bakterielle Hüllproteine nahezu kein Hintergrundsignal liefern und aufgrund ihrer dünnen Monolage von etwa 6 - 9 nm die Sensitivität der Messungen nur gering beeinträchtigen.

In this presentation it is demonstrated that the unique magnetic properties of superparamagnetic cobalt-spinel ferrite nanoparticles can be employed in several novel applications. A method to selectively capture and remove pathogens from infected organisms to improve longevity is presented. Evidence is provided to show that automated methods using modified forms of hemofiltration or peritoneal dialysis could be used to eliminate the particle/pathogen or particle/infected cell conjugates from the organism postoperatively. It is shown that disparately functionalized nanoparticles can be used in concert as drug carrier and release mechanisms. Lastly, we provide preliminary evidence to support the use of magnetic nanoparticles for controlling reaction kinetics.

The work described here details the experimental progress toward an improved means of HIV-1 diagnosis and an explanation of the experimental approaches taken to advance a previously developed HIV-1 reverse transcriptase detection assay using RNA aptamers for protein capture. After characterization of the identity and function of the aptamer samples to be used, we first set about clarifying the nature of the assay and pinning down sources of variability inherent in the original Aptamer Antibody Sandwich Assay (AASA) such that through the course of this work we might bring the assay to a point of high reproducibility. In doing so, we devised a set of criteria for data analysis and filtration and established a process to examine whether modifications to the method resulted in measurable improvement. Two new methods were tested in the hope that they might later be extended to our ultimate project goal of distinguishing binding affinity variations among HIV-1 reverse transcriptase protein and its mutant variants. Both method modifications involved the addition of a fluorescently labeled Cy5 probe to the immobilized aptamer construct. The addition of a fluorescent label to each printed aptamer allowed for detection of aptamer presence in addition to protein binding, essentially serving as a simple internal control for aptamer-protein binding. After optimizing the AASA aptamer construct and experimental procedure, the AASA was extended to a multiplexed array format. Using four groups of aptamers selected against two HIV-1 RT variants (wild-type and mutant 3) we tested the hypothesis that immobilized anti-HIV-1 aptamers might be capable of binding HIV-1 RT variants and regardless of their selective target. The experiments described here are the first example of these aptamers being used in a multiplexed array format, and the results are not only a clear exemplification of the capacity of RNA aptamers for detection in this novel, immobilized assay format, but also an indicator of the utility and flexibility of RNA aptamer functionality. The promising results described in these preliminary studies are the starting block from which several interesting aptamer-protein interaction and drug-competition studies have begun. / text

In this doctoral thesis we study novel analogues based on R06 aptamers and targeting TAR hairpins of the HIV virus by means of surface plasmon resonance biosensor, which allows for sensitive and real-time monitoring of molecular interactions. We investigate seven different modifications placed at nine different positions on the R06 aptamer in order to find out their applicability in the construction of efficient and stable anti-TAR oligonucleotides. We also determine which positions are suitable for substitutions with a modification and interpret the results in the context of the local nucleotide geometries and interactions in the TAR/anti-TAR complex. In this doctoral thesis we further develop a new fluidic system. This fluidic system eliminates sample dispersion and intermixing effects and thus enables accurate monitoring of molecular interactions on the surface of an SPR chip. We also characterize experimental conditions on the surface of an oligonucleotide chip and their relations towards bio-molecular assays. Specifically, we study the shielding effect of monovalent and divalent cations, which are crucial for the interaction of negatively charged oligonucleotides.

L’objectif de ma thèse a été de développer de nouvelles sondes utilisables en imagerie biomédicale, basées sur l’utilisation d’aptamères, pour la détection de deux types de tumeurs : les glioblastomes et les mélanomes. Les traceurs développés ont pour objectif de cibler la protéine matricielle hMMP-9. Lors d’une thèse précédente, un aptamère anti hMMP-9 noté F3B a été obtenu. Afin de transformer cet aptamère en une sonde pour l’imagerie biomédicale, différents conjugués F3B ont été préparés: Cy5, DOTA ou MAG3. L’affinité des nouveaux conjugués pour l’hMMP-9 a été évaluée par SPR et sur coupes de tumeurs. Des études de biodistribution des conjugués F3B-DOTA et F3B-MAG3 ont été réalisées sur des souris portant le mélanome, les résultats ont montré que les deux aptamères marqués détectent spécifiquement l’hMMP-9. De plus, la détection de la protéine hMMP-9 par le conjugué F3B-CY5 a été confirmée par imagerie de fluorescence. Afin d’améliorer la sensibilité de détection des tumeurs, deux types de modifications ont été envisagées, développer des structures multimériques de F3B et élaborer d’un système bi-fonctionnel. Pour ces deux approches, nous avons synthétisé un dendrimère à point focal, pouvant donner accès à une imagerie multi-modale. Ce dendrimère porte deux ou trois bras espaceur porteurs d’un groupement azoture utilisé pour le couplage avec les aptamères par la chimie «click». Le dendrimère porte au point focal une fonction amine NH2 utilisée pour fixer une biotine, afin de déterminer l'affinité Kd de cette nouvelle sonde par SPR. Par la suite un ligand DOTA sera fixé afin de pouvoir visualiser ce traceur en TEMP. / The aim of my thesis was to develop new probes that can be used in biomedical imaging, based on the use of aptamers for the detection of two types of tumors: glioblastomas and melanomas. Tracers have been developed with the aim to target the matrix protein hMMP-9. In a thesis, an aptamer anti-hMMP-9 noted F3B was obtained. Based on this compound, different derivatives were prepared for using in biomedical imaging: F3B-Cy5, F3B-DOTA or F3B-MAG3. The affinity of the new conjugates for hMMP-9 was evaluated by SPR and on sections of human melanomas. Biodistribution studies of F3B-DOTA conjugates and F3B-MAG3 were performed at on melanoma bearing mice, the results showed that both radiolabeled aptamers specifically detected the hMMP-9. In addition, optical fluorescence imaging confirmed the binding to hMMP-9 by F3B-CY5. In order to improve tumor detection sensitivity, two types of modifications were investigated: developing of F3B multimeric structures and a bi-functional system. For both these approaches, we synthesized a dendrimer with a focal point, which could give access to a multi-modal imaging. This dendrimer has two or three spacers bearing an azide group used for coupling with aptamers by "click" chemistry. The dendrimer carrying at the focal point an amine function NH2 used for fixing biotin in order to determine the affinity Kd of this new probe by using SPR. A DOTA ligand will be fixed later in order to view this tracer in SPECT.

Les séquences riches en guanines, qu’elles soient ADN ou ARN, peuvent former des structures non canoniques à quatre brins appelées quadruplexes de guanines ou G-quadruplexes. Ces structures reposent sur la formation et l’empilement de quartets de guanines ; elles peuvent être trouvées dans de nombreuses régions du génome. Des motifs G-quadruplexes apparaissent fréquemment lors de la sélection d'aptamères par SELEX : on constate un biais dans la proportion de guanines par rapport aux autres nucléotides dans les bases de données regroupant les séquences d'aptamères connus. Nous avons entrepris une analyse systématique, in silico puis in vitro, de motifs aptamères décrits dans la littérature. Nous avons utilisé un algorithme de prédiction actuellement développé au sein du laboratoire dans le but de déterminer quelles sont les séquences susceptibles de former des G-quadruplexes in silico. Afin de vérifier ces prédictions, un test biophysique permettant de cribler rapidement de nombreuses séquences a été mis en place. Nos résultats démontrent que de nombreux aptamères publiés sont susceptibles de se replier en G-quadruplexe. Un autre volet de ce travail concernait la mise en pratique du SELEX avec deux objectifs distincts. Nous avons d'abord effectué une sélection in vitro contre un ligand de G-quadruplexes, afin de préciser quels motifs nucléiques peuvent interagir avec cette molécule. Nous avons réalisé ensuite des expérience de SELEX contre plusieurs G-quadruplexes ADN ou ARN biologiquement pertinents (motif télomérique humain, répétitions minisatellites et séquences présentes dans les UTR de différents ARNm), dans le but d'obtenir des sondes spécifiques de ces conformations. / Guanine-rich DNA or RNA sequences can adopt non-canonical structures composed of four strands called guanines quadruplexes or G-quadruplexes. These structures are made by the formation and stacking of guanine quartets; they can be found in various region of the genome. G-quadruplexes motifs are frequently found during the selection of aptamers by the so-called SELEX method: a bias exists in the proportion of guanines in comparison with other nucleotides in a database gathering together known aptamers sequences. We did an in silico then in vitro systematic analysis of aptameric motifs described in the literature. We used a prediction algorithm currently developed in the laboratory to determine which sequences car form G-quadruplexes in silico. In order to check those predictions, a biophysical test allowing to quickly assay a lot of sequences was set up. Our results demonstrate that a lot of published aptamers are able to fold into G-quadruplexes. Another part of this work is related to the use of the SELEX with two different goals. First of all we did an in vitro selection against a G-quadruplexes ligand, in order to tell exactly which nucleic motifs can interact with this molecule. We then carried out SELEX experiments against several DNA or RNA biologically relevant G-quadruplexes (human telomeric motifs, minisatellite repetitions and sequences from UTR of mRNA), with the aim of getting specific probes for these conformations.

Les aptamères peptidiques sont des protéines combinatoires capables de moduler spécifiquement une fonction de leur cible. Une sélection fonctionelle d’aptamères peptidiques capables d’inhiber la mort cellulaire Bax-dependante chez la levure et en cellules mammaifères a été effectuée. Deux aptamères peptidiques ont été sélectionnés (Apta-32 et Apta-34). L’objectif de ce travail de thèse a été de caractériser ces deux aptamères peptidiques et leur(s) cible(s) dans le contexte de la mort cellulaire Bax-dependante. La première partie est l’étude de l’Apta-34 qui cible une protéine (C34) contenant un domaine de mort et ayant des fonctions pro-apoptotiques. Nous avons montré que lors de l’induction de l’apoptose, C34 est transloquée du noyau (sa localisation principale) au cytoplasme. Dans les mêmes conditions, Apta-34 co-localise avec C34 dans le noyau, empêchant, ou du moins retardant, sa sortie du noyau. De plus nous avons identifié le site de liaison d’Apta-34 sur C34, qui est localisé dans les 215 amino acides en N-terminale de la protéine, une région qui contient un site prédictif d’export nucléaire. Finalement, nous avons montré que la délétion de l’homologue de C34 protège contre la mort induite par hBax en levure. La seconde partie est l’étude d’Apta-32 qui cible deux paralogues (C32a et b) d’une famille de protéine impliquée dans le traffic membranaire dans les voies de l’endocytose. Nous avons montré qu’Apta-32 se lie à un domaine fonctionnel de C32. Des études in silico de docking ont permis d’identifier trois sites distincts de liaison d’Apta-32 sur ce domaine. Le site dominant est composé d’acides aminés qui partagent des propriétés physico-chimiques communes entre les différents interacteurs d’Apta-32 (C32a, C32b et l’homologue levure) mais pas avec des homologues qui ne lient pas Apta-32. De plus un screening double hybride d’une banque de cDNA levure a permis d’identifier des cibles mevure d’Apta-32. Finalement, des études préliminaires chez l’embryons de drosophile, permettent de suggérer que l’expression d’Apta-32 peut entraîner un défaut de la phagocytose. Cette étude a permis d’identifier des régulateurs de la mort cellulaires impliqués dans deux processus cellulaires distincts. / Peptide aptamers are small combinatorial proteins able to specifically modulate a function of their target. A functional selection of peptide aptamers able to inhibit Bax-dependent cell death in yeast and mammalian systems has been performed. Two peptide aptamers have been selected (Apta-32 and Apta-34). The aim of this thesis project was to characterize those two inhibitory peptide aptamers and their targets in order to understand their function in the Bax-dependent cell death. The first part focuses on Apta-34 that targets a Death Domain-containing protein (T34) that has pro-apoptotic functions. We showed that during the induction of apoptosis T34 translocates from nucleus (its major localization site) to the cytoplasm. In the same conditions, Apta-34 co-localizes with T34 in the nucleus, inhibiting or at least delaying its exit from the nucleus. Moreover we identified that Apta-34 binds to the well conserved 215 N-terminal amino acids of T34 that contains a putative Nuclear Export Signal. Finally we showed that the deletion of its homologue prevents hBax-induced cell death in yeast. The second part focuses on Apta-32 that targets two paralogues (T32a and b) of a family of proteins involved in the endocytotic membrane trafficking. We showed that Apta-32 is binding to a functional domain of T32. By in silico docking studies we identified 3 distinct binding sites of Apta-32 on this domain. The dominant binding site is composed by amino acid that share physico-chemical properties between binders of Apta-32 (T32a, T32b and a yeast homologue) but not with homologues that do not bind Apta-32. Moreover we identified yeast targets of Apta-32 by yeast two hybrid yeast cDNA library screening. Finally preliminary observations on drosophila embryos expressing Apta-32 suggest that Apta-32 expression could lead to a defect on phagocytosis. This study leads to the identification of regulators of the cell death acting on two distinct pathways.

Dans ce travail, deux aptacapteurs électrochimiques ont été développés pour une détection sélective de la tétracycline (TET) et ses dérivés dans les environnements aquatiques. Les deux outils analytiques sont basés sur l’immobilisation d’oligonucléotides d’ADN sur des électrodes de carbone sérigraphiées : le premier est un capteur impédimétrique utilisant un aptamère de 8 nucléotides, tandis que le deuxième est un capteur voltammétrique basé sur l’inhibition de l’électroactivité intrinsèque d’un aptamère de 76 nucléotides. Une telle électroactivité n’ayant jamais été observée précédemment, une étude a été menée afin d’identifier la partie de la séquence responsable de cette activité et de déterminer en parallèle les sites de reconnaissance de la TET. Un autre volet du travail exploite cette électroactivité afin de cartographier par microscopie électrochimique à balayage la répartition des aptamères immobilisés sur l’électrode. / In this work, two electrochemical aptasensors were developed for selective detection of tetracycline (TET) and its derivatives in aquatic environments. The two analytical tools are based on the immobilization of DNA oligonucleotides on screen-printed carbon electrodes: the first is an impedimetric sensor involving an aptamer of 8 nucleotides, while the second is based on a voltammetric sensor based on the inhibition of the intrinsic electroactivity of an aptamer of 76 nucleotides. Since such electroactivity has never been observed previously, a study was conducted to identify the part of the sequence responsible for this activity and to determine in parallel the TET recognition sites. Another part of the work exploits this electroactivity to map the distribution of aptamers immobilized on the electrode by scanning electrochemical microscopy.

>Magister Scientiae - MSc / Prostate cancer, commonly referred to as adenocarcinoma of the prostate, is the leading cause of cancer death in men in 46 countries, and it was estimated that by the end of 2018 there would approximately be 1.3 million new cases of prostate cancer worldwide. Currently, the Food and Drug Administration (FDA) approved biomarker for prostate cancer disease diagnostics Prostate Specific Antigen (PSA) is not specific to the disease itself but extends to other cases such as Benign Prostate Hyperplasia (BPH) a condition in which the prostate grows uncontrollably. This biomarker is then detected in blood samples via conventional methods which require a qualified individual to operate and are often time consuming. Examples of these methods are spectrophotometry and High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Hence, a more efficient biomarker and method of detection is needed for prostate cancer disease diagnostics, as early detection of the disease means early treatment, which could ultimately save lives. Currently, an emerging biomarker for prostate cancer known as Alpha-Methyl CoA Racemase (AMACR) has shown to be more specific to the disease with advantages such as being a non-invasive biomarker. AMACR has been reported to be present in urine, and thus may be detected via a non-invasive method. This study proposed an economical, non-invasive electrochemical biosensor for the rapid detection of AMACR based on mercaptosuccinic acid capped tungsten telluride (MSA-WTe3) quantum dots (QDs). Nanomaterial has shown promise in terms of increasing the sensitivity and specificity of sensors. MSA-WTe3 QDs was successfully synthesized using easy, inexpensive method and was studied by various techniques such as High Resolution Transmission Electron Microscopy (HR-TEM) where the size was confirmed to be within the nanometer scale and was reported to be 2.65 nm with a good crystallinity. X-ray diffraction (XRD) confirmed the structural properties and chemical composition of the QDs and it is reported that the QDs are rich in both tellurium and tungsten and comprise of a hexagonal structure. Scanning Electron Microscopy (SEM) confirmed the successful immobilization of aptamer sequence specific to AMACR onto the electrode surface by showing a distinct conformational change when aptamers were introduced to the QDs under study. This study reports the successful detection of AMACR using an MSA-WTe3 QDs based aptasensor immobilized onto a screen printed glassy carbon electrode, with a detection limit of 0.35651 ng/mL and a limit of quantification calculated to be 1.08033 ng/mL.