Philosophiae Doctor - PhD / Tuberculosis (TB) is an infectious disease that, despite all efforts devoted towards its eradication, remains a threat to many countries including South Africa. Current diagnostic assays do offer better performance than the conventional sputum smear microscopy and tuberculin skin tests. However, these assays have been proven to be affected by various factors including the condition of an individual's immune system and vaccination history. By far, electrochemical biosensors are amongst the currently investigated techniques to address the shortcomings associated with these diagnostics. / 2020-08-31

Une percée majeure aura lieu dans le domaine de la santé lorsque les patients pourront surveiller les molécules indicatives de leurs conditions médicales dans le confort de leur salon. L’efficacité d’une telle stratégie a déjà été validée par des millions de patients diabétiques via l’utilisation du glucomètre. Toutefois, des technologies de détection similaires restent à être développées pour améliorer le traitement de d’autres maladies chroniques. Les capteurs électrochimiques à base d’ADN (capteurs eDNA) ont récemment attiré beaucoup d’attention grâce à leur capacité à détecter plusieurs marqueurs moléculaires dans le sang tout en utilisant un dispositif bon marché et facile d’utilisation. Dans ce type de capteurs, l’ADN est typiquement employé comme élément de reconnaissance ou pour concevoir le mécanisme de signalisation permettant de capturer des cibles moléculaires spécifiques et traduire cet événement de liaison en un signal électrochimique. Des défis particuliers, toutefois, limitent toujours la commercialisation des capteurs eDNA. Par exemple, la plupart de ces capteurs produisent encore d’importantes variations non spécifiques du courant électrique lorsque plongés dans un échantillon de sang. De plus, ces capteurs demeurent sensibles au processus de fabrication et au vieillissement, et nécessitent des modifications chimiques complexes et un long processus d’optimisation pour leur mise au point. L’objectif principal de ma thèse consiste à régler ces limitations via le développement de nouveaux mécanismes de signalisation plus performants. Dans le chapitre 2, nous introduisons un nouveau type de capteurs eDNA basé sur l’hybridation d’ADN que nous avons nommé « essaie d’hybridation électrochimique par encombrement stérique et inhibition rédox (eSHRI) ». Ce mécanisme de signalisation potentiellement universel intègre trois niveaux d’encombrement stérique et un nouveau mécanisme d’inhibition rédox par contact. Nous avons démontré que le eSHRI peut détecter et quantifier de faibles concentrations (nanomolaire) de protéines dans une goutte de sang en moins de 3 min via une diminution de signal électrique allant jusqu’à -93.6 ± 1.36 % du signal initial. De plus, l’essai d’hybridation eSHRI demeure essentiellement indépendant de la densité du brin de capture à la surface de l’électrode et donc insensible aux variations lors de la fabrication et du vieillissement du capteur. Malgré ses caractéristiques impressionnantes, le eSHRI requiert généralement des modifications chimiques complexes pour attacher l’élément de reconnaissance et l’élément rédox à la même extrémité du brin d’ADN. Ainsi, dans le chapitre 3, nous avons développé un nouveau mécanisme de signalisation potentiellement universel, l’essaie de barrière moléculaire, qui nécessite uniquement une modification par brin d’ADN. Dans cet essai, l’élément de reconnaissance et l’élément rédox sont respectivement conjugués à l’ADN de capture (surface de l’électrode) et l’ADN de signalisation (libre en solution). L’essai fonctionne via la formation d’une barrière moléculaire utilisant l’analyte à détecter, une protéine. Lorsque cette dernière se lie à la surface du capteur, cela réduit l’efficacité d’hybridation entre l’ADN de signalisation et l’ADN de capture. En utilisant ce nouveau capteur, nous avons démontré la détection de deux protéines, la streptavidine et un anticorps, directement dans une goutte de sang. Ces dernières années, les anticorps à base d’ADN, nommés aptamères, ont considérablement augmenté notre capacité à détecter des analytes cliniquement pertinents. Toutefois, les capteurs eDNA à base d’aptamères nécessitent un long processus de développement et d’optimisation, et demeurent très dépendants de la densité de surface tout en présentant d’importantes variations de signal lorsqu'ils sont déployés dans le sang. Dans le chapitre 4, nous introduisons un essai simple, hautement modulable et universel qui emploie une chimie dynamique constitutionnelle (CDC) cinétiquement programmée. Cet essai fonctionne en programmant la cinétique de trois réactions concurrentes permettant la détection moléculaire directement dans une goutte de sang. Nous avons démontré que cet essai est potentiellement universel en détectant quantitativement quatre marqueurs moléculaires : la quinine, l’ATP, la thrombine et la PDGF. Nous avons également démontré le potentiel de ce nouveau capteur en exécutant un suivi direct de la quinine dans le sang de souris vivantes. En sommes, nous croyons que ces nouveaux mécanismes de signalisation permettent de résoudre les principales limitations des capteurs eDNA actuels et présentent toutes les caractéristiques pour être développés en dispositifs commercialisables analogues aux glucomètres. / A breakthrough will occur in the healthcare system when patients are allowed to monitor blood molecules indicative of their condition in the comfort of their home. Such an objective has already been realized for diabetic patients through the development of the glucometer. Similar sensors urgently need to be developed to improve the monitoring and treatment of other chronic conditions. Electrochemical DNA-based sensors (eDNA sensors) have recently attracted increasing attention due to their ability to detect multiple blood markers using low-cost and easy-to-use devices. In eDNA sensors, DNA is typically employed either as a recognition element or to design a signaling mechanism that captures specific target molecules and transduces this binding event into an electrochemical signal. Specific challenges, however, limit the commercialization process of eDNA sensors. For example, most eDNA sensors exhibit strong baseline drift when employed in blood, remain sensitive to fabrication processes and aging, and require complex chemical modification and time-consuming optimization processes. The main objective of my Ph.D. project was to solve these limitations through the development of novel improved signaling mechanisms. Chapter 2 introduces a novel hybridization-based eDNA sensing architecture called electrochemical steric hindrance and redox inhibition (eSHRI) hybridization assay. This potentially universal signaling mechanism integrates three levels of steric hindrance and a novel contact redox inhibition mechanism. We have shown that eSHRI can detect low nanomolar concentrations of protein analytes in a drop of blood in less than 3 min with up to -93.6 ± 1.36 % in signal gain. Moreover, the eSHRI hybridization assay remains primarily independent of the sensor density on the surface of the electrode and thus insensitive towards variations in fabrication or aging time. Despite its impressive characteristics, eSHRI may see its universality limited by the complicated chemical modifications required to attach both the recognition element and the redox molecule on the same extremity of a DNA strand. In response, in chapter 3, we develop a novel, potentially universal signaling mechanism, the molecular barrier-based assay, that only requires a single modification of its DNA strands. In this assay, the recognition element and redox molecule are conjugated to the surface-attached capturing DNA and the free-moving signaling DNA. The assay works by having the protein analytes create a molecular barrier upon binding to the sensor surface, reducing the hybridization efficiency between the capturing DNA and the signaling DNA. Using this novel sensor, we have demonstrated the detection of two proteins, streptavidin and antibody, directly in a drop of blood. DNA-based antibodies, called aptamers, have drastically expanded our ability to detect a large proportion of clinically relevant analytes in recent years. However, the development of aptamer-based eDNA sensors still requires a long optimization process, remains highly dependent on specific surface densities, and displays significant signal drift when deployed in the blood. In response, we present in chapter 4 a simple, highly modular, universal assay that employs kinetically programmed constitutional dynamical chemistry (CDC). This assay works by programming the kinetics of three competing reactions to enable molecular detection directly in a drop of blood. We show that this assay is potentially universal by demonstrating the quantitative detection of four molecular markers: quinine, adenosine triphosphate (ATP), thrombin, and platelet-derived growth factor (PDGF). We further show the point-of-care potential of this new sensor by performing direct quinine monitoring in living mouse blood. Overall, we believe that these new sensing mechanisms solve the main weaknesses of current eDNA sensors and display all the characteristics required for the development of commercialized devices analogous to glucose meters.

Mémoire par article / Hypothèse : L’incorporation dans des liposomes d’aptamères spécifiques à un principe actif permet d’obtenir une encapsulation active du principe actif et de modifier les profils de libération sans diminuer l’efficacité thérapeutique. Méthode : Une série d’aptamères d’affinité variable a été incorporée dans la préparation de liposomes cationiques. Ces lipoplexes ainsi formés ont été caractérisés en taille par diffusion dynamique de la lumière et par la mesure du potentiel de surface zêta. Ils ont été optimisés en matière de complexation maximale des aptamères, puis incubés avec la doxorubicine, choisie comme principe actif modèle. L’efficacité d’encapsulation de la doxorubicine a été comparée avec et sans aptamères, et contre la méthode d’encapsulation active offerte commercialement. Les meilleures formulations ont été étudiées sur le plan de la cinétique de libération et l’efficacité de celles-ci a été évaluée pour leur cytotoxicité sur des cellules cancéreuses de type HeLa. Résultats : Les vecteurs cationiques optimisés permettent la complexation d’au moins 94% des aptamères. Trois des quatre aptamères ont démontré de l’encapsulation active de la doxorubicine, avec des efficacités d’encapsulation allant jusqu’à 85%. De ces trois formulations, différents profils de libération ont été obtenus, permettant tous une libération plus importante qu’une formulation ressemblant aux liposomes commerciaux de doxorubicine (Doxil®). L’efficacité des trois formulations testées sur les cellules HeLa s'est avérée équivalente ou supérieure au standard similaire du Doxil®. / Hypothesis : Incorporation in some liposomes of specific aptamers for a drug allowed the obtaining of active encapsulation of that drug and allowed the modification of their drug release profiles, without negatively impacting its therapeutic efficacy. Methods : A series of aptamers of various affinity were incorporated in the preparation of cationic liposomes. The resulting lipoplexes were characterized for their size by dynamic light scattering method and their surface potential were analysed by zeta potential measurement. Lipoplexes were optimized in terms of highest aptamer complexation and they were incubated with doxorubicin, a model drug that was chosen. The encapsulation efficiency of doxorubicin was compared with and without the presence of aptamers, and with the commercially available active loading method. The best formulations were studied for their doxorubicin’s release kinetic, with the different aptamers, and they were tested for their cytotoxicity on HeLa cancer cells. Results : Cationic liposomes were optimized to allow a minimum aptamer complexation of 94%. Three out of the four tested aptamers were able to demonstrate active loading capabilities, with up to 85% encapsulation efficiencies. Out of these three formulations, very different release profiles were found, all allowing more initial content release of the commercially-like available doxorubicin’s liposomes (Doxil®). The efficacy of those three formulations on HeLa cancer cells demonstrated equivalent or higher cytotoxicity than the similar standard of Doxil®.

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These are the abstracts of the oral presentations of the 8th PhD conference held on 7 June 2024 in Freiberg.

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[ES] La capacidad de las células madre para proliferar formando distintas células especializadas les otorga la potencialidad de servir de base para terapias efectivas para patologías cuyo tratamiento era inimaginable hasta hace apenas dos décadas. Sin embargo, esta capacidad se encuentra mediada por estímulos fisiológicos, químicos, y eléctricos, específicos y complejos, que dificultan su traslación a la rutina clínica. Por ello, las células madre representan un campo de estudio en el que se invierten amplios esfuerzos por parte de la comunidad científica. En el ámbito de la regeneración nerviosa, para modular su desarrollo y diferenciación el tratamiento farmacológico, la electroestimulación, y la estimulación optogenética son técnicas que están consiguiendo prometedores resultados. Es por ello por lo que en la presente tesis se ha desarrollado un conjunto de sistemas electrónicos para permitir la aplicación combinada de estas técnicas in vitro, con perspectiva a su aplicación in vivo. Hemos diseñado una novedosa tecnología para la liberación eléctricamente controlada de fármacos. Esta tecnología está basada en nanopartículas de sílice mesoporosa y puertas moleculares de bipiridina-heparina. Las puertas moleculares son electroquímicamente reactivas, y encierran los fármacos en el interior de las nanopartículas, liberándolos ante un estímulo eléctrico. Hemos caracterizado esta tecnología, y la hemos validado mediante la liberación controlada de rodamina en cultivos celulares de HeLa. Para la combinación de liberación controlada de fármacos y electroestimulación hemos desarrollado dispositivos que permiten aplicar los estímulos eléctricos de forma configurable desde una interfaz gráfica de usuario. Además, hemos diseñado un módulo de expansión que permite multiplexar las señales eléctricas a diferentes cultivos celulares. Además, hemos diseñado un dispositivo de estimulación optogenética. Este tipo de estimulación consiste en la modificación genética de las células para que sean sensibles a la radiación lumínica de determinada longitud de onda. En el ámbito de la regeneración de tejido mediante células precursoras neurales, es de interés poder inducir ondas de calcio, favoreciendo su diferenciación en neuronas y la formación de circuitos sinápticos. El dispositivo diseñado permite obtener imágenes en tiempo real mediante microscopía confocal de las respuestas transitorias de las células al ser irradiadas. El dispositivo se ha validado irradiando neuronas modificadas con luz pulsada de 100 ms. También hemos diseñado un dispositivo electrónico complementario de medida de irradiancia con el doble fin de permitir la calibración del equipo de irradiancia y medir la irradiancia en tiempo real durante los experimentos in vitro. Los resultados del uso de los bioactuadores en procesos complejos y dinámicos, como la regeneración de tejido nervioso, son limitados en lazo abierto. Uno de los principales aspectos analizados es el desarrollo de biosensores que permitiesen la cuantización de ciertas biomoléculas para ajustar la estimulación suministrada en tiempo real. Por ejemplo, la segregación de serotonina es una respuesta identificada en la elongación de células precursoras neurales, pero hay otras biomoléculas de interés para la implementación de un control en lazo cerrado. Entre las tecnologías en el estado del arte, los biosensores basados en transistores de efecto de campo (FET) funcionalizados con aptámeros son realmente prometedores para esta aplicación. Sin embargo, esta tecnología no permitía la medición simultánea de más de una biomolécula objetivo en un volumen reducido debido a las interferencias entre los distintos FETs, cuyos terminales se encuentran inmersos en la solución. Por ello, hemos desarrollado instrumentación electrónica capaz de medir simultáneamente varios de estos biosensores, y la hemos validado mediante la medición simultánea de pH y la detección preliminar de serotonina y glutamato. / [CA] La capacitat de les cèl·lules mare per a proliferar formant diferents cèl·lules especialitzades els atorga la potencialitat de servir de base per a teràpies efectives per a patologies el tractament de les quals era inimaginable fins fa a penes dues dècades. No obstant això, aquesta capacitat es troba mediada per estímuls fisiològics, químics, i elèctrics, específics i complexos, que dificulten la seua translació a la rutina clínica. Per això, les cèl·lules mare representen un camp d'estudi en el qual s'inverteixen amplis esforços per part de la comunitat científica. En l'àmbit de la regeneració nerviosa, per a modular el seu desenvolupament i diferenciació el tractament farmacològic, l'electroestimulació, i l'estimulació optogenética són tècniques que estan aconseguint prometedors resultats. És per això que en la present tesi s'ha desenvolupat un conjunt de sistemes electrònics per a permetre l'aplicació combinada d'aquestes tècniques in vitro, amb perspectiva a la seua aplicació in vivo. Hem dissenyat una nova tecnologia per a l'alliberament elèctricament controlat de fàrmacs. Aquesta tecnologia està basada en nanopartícules de sílice mesoporosa i portes moleculars de bipiridina-heparina. Les portes moleculars són electroquímicament reactives, i tanquen els fàrmacs a l'interior de les nanopartícules, alliberant-los davant un estímul elèctric. Hem caracteritzat aquesta tecnologia, i l'hem validada mitjançant l'alliberament controlat de rodamina en cultius cel·lulars de HeLa. Per a la combinació d'alliberament controlat de fàrmacs i electroestimulació hem desenvolupat dispositius que permeten aplicar els estímuls elèctrics de manera configurable des d'una interfície gràfica d'usuari. A més, hem dissenyat un mòdul d'expansió que permet multiplexar els senyals elèctrics a diferents cultius cel·lulars. A més, hem dissenyat un dispositiu d'estimulació optogenètica. Aquest tipus d'estimulació consisteix en la modificació genètica de les cèl·lules perquè siguen sensibles a la radiació lumínica de determinada longitud d'ona. En l'àmbit de la regeneració de teixit mitjançant cèl·lules precursores neurals, és d'interés poder induir ones de calci, afavorint la seua diferenciació en neurones i la formació de circuits sinàptics. El dispositiu dissenyat permet obtindré imatges en temps real mitjançant microscòpia confocal de les respostes transitòries de les cèl·lules en ser irradiades. El dispositiu s'ha validat irradiant neurones modificades amb llum polsada de 100 ms. També hem dissenyat un dispositiu electrònic complementari de mesura d'irradiància amb el doble fi de permetre el calibratge de l'equip d'irradiància i mesurar la irradiància en temps real durant els experiments in vitro. Els resultats de l'ús dels bioactuadors en processos complexos i dinàmics, com la regeneració de teixit nerviós, són limitats en llaç obert. Un dels principals aspectes analitzats és el desenvolupament de biosensors que permeteren la quantització de certes biomolècules per a ajustar l'estimulació subministrada en temps real. Per exemple, la segregació de serotonina és una resposta identificada amb l'elongació de les cèl·lules precursores neurals, però hi ha altres biomolècules d'interés per a la implementació d'un control en llaç tancat. Entre les tecnologies en l'estat de l'art, els biosensors basats en transistors d'efecte de camp (FET) funcionalitzats amb aptàmers són realment prometedors per a aquesta aplicació. No obstant això, aquesta tecnologia no permetia el mesurament simultani de més d'una biomolècula objectiu en un volum reduït a causa de les interferències entre els diferents FETs, els terminals dels quals es troben immersos en la solució. Per això, hem desenvolupat instrumentació electrònica capaç de mesurar simultàniament diversos d'aquests biosensors i els hem validat amb mesurament simultani del pH i la detecció preliminar de serotonina i glutamat. / [EN] The stem cells' ability to proliferate to form different specialized cells gives them the potential to serve as the basis for effective therapies for pathologies whose treatment was unimaginable until just two decades ago. However, this capacity is mediated by specific and complex physiological, chemical, and electrical stimuli that complicate their translation to clinical routine. For this reason, stem cells represent a field of study in which the scientific community is investing a great deal of effort. In the field of nerve regeneration, to modulate their development and differentiation, pharmacological treatment, electrostimulation, and optogenetic stimulation are techniques that are achieving promising results. For this reason, we have developed a set of electronic systems to allow the combined application of these techniques in vitro, with a view to their application in vivo. We have designed a novel technology for the electrically controlled release of drugs. This technology is based on mesoporous silica nanoparticles and bipyridine-heparin molecular gates. The molecular gates are electrochemically reactive and entrap the drugs inside the nanoparticles, releasing them upon electrical stimulus. We have characterized this technology and validated it by controlled release of rhodamine in HeLa cell cultures. For combining electrostimulation and controlled drug release we have developed devices that allow applying the different electrical stimuli in a configurable way from a graphical user interface. In addition, we have designed an expansion module that allows multiplexing electrical signals to different cell cultures. In addition, we have designed an optogenetic stimulation device. This type of stimulation consists of genetically modifying cells to make them sensitive to light radiation of a specific wavelength. In tissue regeneration using neural precursor cells, it is interesting to be able to induce calcium waves, favoring the cell differentiation into neurons and the formation of synaptic circuits. The designed device enable the obtention of real-time images through confocal microscopy of the transient responses of cells upon irradiation. The device has been validated by irradiating modified neurons with 100 ms pulsed light stimulation. We have also designed a complementary electronic irradiance measurement device to allow calibration of the irradiator equipment and measuring irradiance in real time during in vitro experiments. The results of using bioactuators in complex and dynamic processes, such as nerve tissue regeneration, are limited in an open loop. One of the main aspects analyzed is the development of biosensors that would allow quantifying of specific biomolecules to adjust the stimulation provided in real time. For instance, serotonin secretion is an identified response of neural precursor cells elongation, among other biomolecules of interest for the implementation of a closed-loop control. Among the state-of-the-art technologies, biosensors based on field effect transistors (FETs) functionalized with aptamers are promising for this application. However, this technology did not allow the simultaneous measurement of more than one target biomolecule in a small volume due to interferences between the different FETs, whose terminals are immersed in the solution. This is why we have developed electronic instrumentation capable of simultaneously measuring several of these biosensors, and we have validated it with the simultaneous pH measurement and the preliminary detection of serotonin and glutamate. / Monreal Trigo, J. (2023). Electronic Devices for the Combination of Electrically Controlled Drug Release, Electrostimulation, and Optogenetic Stimulation for Nerve Tissue Regeneration [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193841