Muitos fatores, como variações sazonais, tipos de tecido vegetal, cultivares e espécies de hospedeiro, tipo de solo, interação com microrganismos benéficos ou patógenos entre outros, afetam a estrutura e a composição da comunidade bacteriana das plantas. A introdução de plantas geneticamente modificadas (PGM) foi somada ao conjunto desses fatores, podendo acarretar efeitos diretos e indiretos sobre a comunidade bacteriana. Cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância no Brasil; a área de cultivo está em expansão devido aos incentivos para a produção de álcool. Uma bactéria potencialmente importante para a cultura de cana-de-açúcar é a Methylobacterium, um importante endófito de diversas culturas de interesse econômico e que, em cana-de-açúcar, pode melhorar a germinação de sementes, promover um aumento do peso da planta e da área foliar, além do número de internódios. Dessa forma, o trabalho teve como objetivos: i) avaliar os efeitos da canade- açúcar transgênica resistente a insetos e a herbicida sobre a comunidade bacteriana associada; ii) avaliar se o suposto efeito causado pela cana-de-açúcar transgênica resistente a herbicida deriva diretamente do transgene ou dos tratos culturais diferenciados aos quais a planta transgênica é submetida; iii) avaliar a interação entre Methylobacterium spp. e cana-de-açúcar. Analisando a densidade bacteriana das plantas de cana-de-açúcar convencionais e transgênicas não foi possível constatar diferenças relacionadas à introdução dessas plantas. Analisando somente quanto ao manejo de ambos os experimentos, foi possível observar que diferenças em trato cultural ou manejo de plantas, decorrentes ou não da transgenia, podem influenciar a comunidade bacteriana. Por meio de ARDRA, foi possível observar distribuição diferenciada dos ribotipos com a introdução das PGMs. No experimento realizado somente com plantas transgênicas para resistência a Imazapyr, foi possível notar que, em 17 meses, a presença da planta transgênica e a aplicação do herbicida Imazapyr podem ter resultado na redução da densidade bacteriana associada à rizosfera de cana-de-açúcar. Por meio de DGGE, foi visto que o estado fisiológico da planta foi a maior fonte de variação. Novamente por meio de ARDRA, foram observados ribotipos cuja presença foi afetada pelo cultivo da planta transgênica. Esses ribotipos diferentemente distribuídos poderiam resultar em alterações na atividade bacteriana dessas plantas, uma vez que esses ribotipos podem representar grupos funcionais importantes. A colonização de Methylobacterium spp. em cana-de-açúcar foi analisada por meio de microscopia eletrônica de varredura, reisolamento e microscopia óptica de fluorescência. Foi visto que as linhagens utilizadas colonizam cana-de-açúcar, sendo que os pontos de maior colonização são os flanges cuticulares e as regiões pilosas da raiz. Outros estudos são necessários para o melhor aproveitamento dessa bactéria na cultura de cana-de-açúcar. / Many factors, such as seasonal variations, kinds of vegetal tissue, cultivares and host species, kind of soil, interaction with beneficial or pathogen microorganisms, among others, affect the structure and composition of plants bacterial community. The introduction of genetically modified plants (GMP) was added to the set of these factors, making it possible to cause direct and indirect effects on the bacterial community. Sugarcane is a very important crop in Brazil; the cultivation area is expanding due to incentives to alcohol production. A potentially important bacterium for sugar cane cultivation is the Methylobacterium, which is an important endophyte for several cultures of economic interest and which can improve seed germination in sugar cane, promote an increase of plant weight and foliar area, and also the internodes. Thus, the work had as objectives: i) to assess the effects of transgenic sugarcane resistant to insects and herbicide on the associated bacterial community; ii) to assess if the presumed effect caused by transgenic sugarcane resistant to herbicides derives directly from the transgene or differentiated cultural handlings to which the genetically modified plant is undertaken; iii) to assess the interaction between Methylobacterium ssp. and sugarcane. Analyzing the bacterial density of conventional and transgenic sugarcane plants it was not possible to see differences related to the introduction of these plants. Analyzing only in relation to the handling of both experiments, it was possible to see that differences in cultural wielding or handling of plants derived or not from transgenia can influence the bacterial community. By means of ARDRA, it was possible to see a differentiated distribution of ribotypes with the introduction of GMPs. In the experiment made only with transgenic plants for Imazapyr resistance, it was possible to see that in 17 months, the presence of the transgenic plant and the application of Imazapyr herbicide can bring result regarding the bacterial density reduction associated to sugarcane rizosphere. By means of DGGE, it was seen that the physiological status of the plant was the greatest variation source. Again, by means of ARDRA, ribotypes whose presence was affected by transgenic plant cultivation were observed. If distributed differently, these ribotypes can represent important functional groups. The Methylobacterium ssp. Colonization in sugarcane was analyzed and by means of scanning electronic microscopy, re-isolation, and fluorescence optical microscopy. It was observed that the utilized lineages colonize sugarcane being cuticle flange and perilous regions of root the highest colonization points. Other studies are needed to a better good use of this bacterium in sugarcane culture.

The phylum Chaetognatha is a mysterious group of organisms that has eluded scientists for more than a century because of their unique morphology and developmental characteristics, i.e. protostome (mouth develops from blastopore; e.g. mollusks, annelids, arthropods) versus deuterostome (anus develops from blastopore; e.g. echinoderms and chordates) offer few clues to their evolutionary origins. Some early morphological studies argued that chaetognaths were derived mollusks or nematodes according to gross ultrastructural data, while other studies focused on the coelomic cavity. 33 Although 18S rRNA is widely used in molecular phylogeny studies, it has limits such as long- branch chain attractions and a slow rate of evolutionary change. Long-branch chain attractions are a phenomenon in phylogenetic analyses when rapidly evolving lineages are inferred to be closely related, regardless of their true evolutionary relationships. Hence other genes are used in this study to complement the 18S rRNA such as the cytochrome oxidase genes. The cytochrome oxidase genes are highly conserved throughout all eukaryotic organisms and they are less ambiguous to align as compared to the ribosomal genes, making them better phylogenetic markers as compared to the 18S rRNA gene. This study focuses on using a molecular approach (ARDRA, PCR, phylogenetic tree reconstruction) to determine the phylogeny of pelagic chaetognaths found on Pelican Island, Galveston, Texas. 18S rRNA, Cytochrome Oxidase I and Cytochrome Oxidase II genes were used to help decipher the phylogeny of this group. All analyzed genes in this study (18S rRNA, COI, and COII) grouped the Pelican Island chaetognaths with the protostomes. The maximum parsimony bootstrap tree for the 18S rRNA gene, grouped the samples closest to the arthropods (protostome). For the COI and COII genes, the minimum evolution bootstrap tree grouped the 8 collected samples more closely to two other protostome phyla: the mollusks and annelids (COI) while bootstrapping with the COII grouped the samples with the nematodes (with >66 percent bootstrap). My findings are significant because they reveal phylogenetic results of a protostome lineage for the Chaetognatha using 3 genes, one of which (COII) has not been greatly studied for the Chaetognatha.

Lactic acid bacteria are associated with preservation of foods, including milk, meat and vegetables. Yoghurt is produced by the cooperative action of two starter bacteria / S. thermophilus and L. delbrueckii subsp. bulgaricus. In this study, identification and typing of yoghurt starter bacteria were aimed. Traditional home made yoghurts were collected from different areas of Turkey, identification of those isolates at species and subspecies level and typing at strain level were achieved using PCR based methods. In our study, identification of yogurt starter bacteria was studied using species specific primers and ARDRA. These methods were inefficient in identification of yoghurt starter bacteria, at species and subspecies level. Consequently, a reliable and quick method for accurate identification of yoghurt starter bacteria was developed. The new method focuses on amplification of methionine biosynthesis genes, for selective identification of yoghurt starter bacteria together with some cheese starters. Further discrimination by ARDRA enabled differentiation of yoghurt starter bacteria from cheese starters. Confirmation of the proposed method has been accomplished by partial sequencing of the 16S rRNA gene. After correct identification of starter bacteria had been achieved, the strains were typed at strain level using RAPD-PCR and MLST. RAPD-PCR with primer 1254 resulted better fingerprints, compared to primer M13 at strain level. Comparisons of the two typing methods showed that RAPD-PCR revealed strain diversity better than MLST, however MLST was a more robust and reliable method and resulted in clustering of the strains depending on the isolation source.

Muitos fatores, como variações sazonais, tipos de tecido vegetal, cultivares e espécies de hospedeiro, tipo de solo, interação com microrganismos benéficos ou patógenos entre outros, afetam a estrutura e a composição da comunidade bacteriana das plantas. A introdução de plantas geneticamente modificadas (PGM) foi somada ao conjunto desses fatores, podendo acarretar efeitos diretos e indiretos sobre a comunidade bacteriana. Cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância no Brasil; a área de cultivo está em expansão devido aos incentivos para a produção de álcool. Uma bactéria potencialmente importante para a cultura de cana-de-açúcar é a Methylobacterium, um importante endófito de diversas culturas de interesse econômico e que, em cana-de-açúcar, pode melhorar a germinação de sementes, promover um aumento do peso da planta e da área foliar, além do número de internódios. Dessa forma, o trabalho teve como objetivos: i) avaliar os efeitos da canade- açúcar transgênica resistente a insetos e a herbicida sobre a comunidade bacteriana associada; ii) avaliar se o suposto efeito causado pela cana-de-açúcar transgênica resistente a herbicida deriva diretamente do transgene ou dos tratos culturais diferenciados aos quais a planta transgênica é submetida; iii) avaliar a interação entre Methylobacterium spp. e cana-de-açúcar. Analisando a densidade bacteriana das plantas de cana-de-açúcar convencionais e transgênicas não foi possível constatar diferenças relacionadas à introdução dessas plantas. Analisando somente quanto ao manejo de ambos os experimentos, foi possível observar que diferenças em trato cultural ou manejo de plantas, decorrentes ou não da transgenia, podem influenciar a comunidade bacteriana. Por meio de ARDRA, foi possível observar distribuição diferenciada dos ribotipos com a introdução das PGMs. No experimento realizado somente com plantas transgênicas para resistência a Imazapyr, foi possível notar que, em 17 meses, a presença da planta transgênica e a aplicação do herbicida Imazapyr podem ter resultado na redução da densidade bacteriana associada à rizosfera de cana-de-açúcar. Por meio de DGGE, foi visto que o estado fisiológico da planta foi a maior fonte de variação. Novamente por meio de ARDRA, foram observados ribotipos cuja presença foi afetada pelo cultivo da planta transgênica. Esses ribotipos diferentemente distribuídos poderiam resultar em alterações na atividade bacteriana dessas plantas, uma vez que esses ribotipos podem representar grupos funcionais importantes. A colonização de Methylobacterium spp. em cana-de-açúcar foi analisada por meio de microscopia eletrônica de varredura, reisolamento e microscopia óptica de fluorescência. Foi visto que as linhagens utilizadas colonizam cana-de-açúcar, sendo que os pontos de maior colonização são os flanges cuticulares e as regiões pilosas da raiz. Outros estudos são necessários para o melhor aproveitamento dessa bactéria na cultura de cana-de-açúcar. / Many factors, such as seasonal variations, kinds of vegetal tissue, cultivares and host species, kind of soil, interaction with beneficial or pathogen microorganisms, among others, affect the structure and composition of plants bacterial community. The introduction of genetically modified plants (GMP) was added to the set of these factors, making it possible to cause direct and indirect effects on the bacterial community. Sugarcane is a very important crop in Brazil; the cultivation area is expanding due to incentives to alcohol production. A potentially important bacterium for sugar cane cultivation is the Methylobacterium, which is an important endophyte for several cultures of economic interest and which can improve seed germination in sugar cane, promote an increase of plant weight and foliar area, and also the internodes. Thus, the work had as objectives: i) to assess the effects of transgenic sugarcane resistant to insects and herbicide on the associated bacterial community; ii) to assess if the presumed effect caused by transgenic sugarcane resistant to herbicides derives directly from the transgene or differentiated cultural handlings to which the genetically modified plant is undertaken; iii) to assess the interaction between Methylobacterium ssp. and sugarcane. Analyzing the bacterial density of conventional and transgenic sugarcane plants it was not possible to see differences related to the introduction of these plants. Analyzing only in relation to the handling of both experiments, it was possible to see that differences in cultural wielding or handling of plants derived or not from transgenia can influence the bacterial community. By means of ARDRA, it was possible to see a differentiated distribution of ribotypes with the introduction of GMPs. In the experiment made only with transgenic plants for Imazapyr resistance, it was possible to see that in 17 months, the presence of the transgenic plant and the application of Imazapyr herbicide can bring result regarding the bacterial density reduction associated to sugarcane rizosphere. By means of DGGE, it was seen that the physiological status of the plant was the greatest variation source. Again, by means of ARDRA, ribotypes whose presence was affected by transgenic plant cultivation were observed. If distributed differently, these ribotypes can represent important functional groups. The Methylobacterium ssp. Colonization in sugarcane was analyzed and by means of scanning electronic microscopy, re-isolation, and fluorescence optical microscopy. It was observed that the utilized lineages colonize sugarcane being cuticle flange and perilous regions of root the highest colonization points. Other studies are needed to a better good use of this bacterium in sugarcane culture.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é a causa de doenças extra-intestinais em aves, que se manifestam na forma de doenças localizadas ou infecções sistêmicas, gerando grandes perdas econômicas para a indústria aviária. O objetivo desse trabalho foi estudar isolados de APEC do sul do Brasil em relação à resistência a agentes antimicrobianos; a prevalência de fatores associados à virulência; a tipagem filogenética e o perfil filogenético. Na avicultura, os agentes antimicrobianos são muito utilizados na prevenção de infecções e na forma de promotores de crescimento. Foram utilizadas 41 isolados de E. coli obtidos de infecções sistêmicas e 144 isolados de celulite, utilizando o método de difusão com discos. Isolados APEC apresentaram baixos níveis de resistência, com excessão da tetraciclina e das sulfonamidas; e para isolados de colissepticemia, também foi observado uma resistência aos antimicrobianos que atuam na parede celular (ampicilina, cefalotina, bacitracina e ceftiofur). Vários fatores de virulência têm sido investigados em cepas APEC, os que têm sido mais frequentemente associados com a patogenicidade são as fímbrias de aderência F1 e Tsh (hemaglutinina sensível à temperatura); o sistema sideróforo aerobactina, a proteína iss (increased serum survival), a cápsula K e a produção de colicina V. Foram realizadas reações da polimerase em cadeia multiplex (PCR), testando um total de 33 fatores nos isolados APEC. Os fatores relacionados a adesão, sideróforos e resistência ao soro foram presentes em todas as amostras. Os fatores que apresentaram maior prevalência nas amostras foram, fimC, ompA, crlA e traT. A tipagem filogenética foi realizada através do método descrito por Clermont et al., (2000), que permite separar os isolados em 4 grupos filogenéticos principais (A, B1, B2 e D). Observamos a maior presença de isolados APEC pertencentes ao grupo D, tanto para celulite quanto para colissepticemia. A análise do perfil filogenético foi realizada pelo método ARDRA, que é baseado na variação da região do espaçamento intergênico (ISR) na região 16S-23S do DNA ribossômico. Os resultados foram analisados formando um dendrograma que mostra a proximidade filogenética dos isolados, indicando que não foi possível separar os clones de celulite dos de colissepticemia e não existem clones endêmicos nas regiões analisadas. Os resultados obtidos no presente estudo, fornecem um panorama geral da resistência aos agentes antimicrobianos, prevalência dos fatores de virulência, tipagem filogenética e perfil filogenético encontrados nos isolados de E. coli aviária do sul do Brasil de infecções de colissepticemia e celulite. / extra-intestinal infections in poultry, called colibacilose, and cause great economic losses to the poultry industry. The aim of this work was to examine APEC strains, isolated from avian cellulitis and colisepticemic chickens from South Brazil, for antibiotic resistance, presence of virulence-associated genes (VAGs), phylogenetic typing and phylogenetic analyses. In poultry, antibiotics are routinely used to prevent infection and promote growth. We analyzed the susceptibility to 15 antibiotics in 144 E. coli isolates collected from cellulitis lesions and in 41 isolates from septicemic chickens. APEC isolates have shown low levels of resistance excepting tetracycline and sulphonamides, and colisepticemic isolates were resistant to antibiotics that act in the cell wall, such as ampicilin, cephalotin, ceftiofur and bacitracin. The virulence factors most frequently associated with APEC pathogenicity are the adhesins F1 and Tsh (Temperature sensitive hemagglutinin), the iron acquisition system aerobactin, the protein Iss (increased serum survival), K1 capsule and production of colicin V. To investigate the presence of VAGs in the isolates, we performed multiplex polymerase chain reactions to test 33 virulence factors. Virulence factors related to adhesion, iron acquisition and serum resistance were present in almost all strains. The factors fimC, ompA, crlA and traT were the most frequent in APEC isolates. The phylogenetic typing were done using the Clermont et al. (2000) method, which classifies E. coli strains into four main phylogenetic groups (A, B1, B2, and D). Our phylogenetic typing has shown that cellulitis and colisseptisemic isolates were more related to group D. Amplified ribossomal restriction analysis (ARDRA) was performed in colissepticemic and celullitis isolates from broiler chickens from Southern Brasil. The similarity among isolates were observed with a dendrogram based on the band pattern. Our results have shown that clones of celullitis and colissepticemic isolates could not be distinguished and there is no endemic clones in regions observed analised. The results of the present work give us a panorama of the susceptibility to antibiotics, virulence factors, phylogenetic typing and phylogenetic analyses currently found in APEC isolates from severe lesions of cellulites and colibacillosis in south Brazil. Besides that, these analyses could be helpful for monitoring and preventing outbreakes of colibacilosis. Controling the first stages of the disease and detecting more prevalent clones in this region may reduce the incidence of the disease.

Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e de distribuição cosmopolita. E. coli coloniza o intestino de humanos e outros animais endotérmicos logo após o nascimento, estabelecendo-se como um importante membro da microbiota intestinal. Algumas cepas de E. coli podem adquirir fatores de virulência, assumindo assim, uma natureza patogênica, como é o caso das E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). As cepas ExPEC apresentam a capacidade de colonizar e se disseminar em diversos nichos no hospedeiro, e são divididas em UPEC (E. coli uropatogênica), NMEC (E. coli causadora de meningite neonatal) e APEC (E. coli patogênica para aves). UPEC, NMEC e APEC compartilham fatores associados à virulência. Para serem aptas a causar doença, cepas ExPEC devem apresentar pelo menos um fator associado à adesão, um fator para captação de ferro (sideróforo) e um fator de resistência ao soro, podendo, também, apresentar genes que codificam toxinas e invasinas. Embora sejam conhecidos muitos fatores de virulência associados à patogenicidade de cepas ExPEC, a regulação da expressão de tais fatores ainda não foi elucidada. Fumarato-nitrato-redutase (FNR) é uma proteína que atua como regulador global, agindo como um sensor da presença de oxigênio em bactérias gramnegativas. Já foi demonstrado que FNR está relacionada à regulação da virulência de bactérias patogênicas como Shigella flexneri e Salmonella enterica serovar Typhimurium. Este trabalho teve como objetivo a análise epidemiológica e caracterização de cepas APEC, bem como a investigação do controle da expressão de fatores associados à virulência de ExPEC pelo regulador global FNR. Os resultados da análise epidemiológica das cepas APEC mostram o perfil de resistência aos agentes antimicrobianos, a prevalência dos fatores de virulência e dos grupos filogenéticos (de acordo com a classificação EcoR) e a relação filogenética dos isolados, fornecendo um panorama da caracterização de E. coli patogênicas aviárias de lesões severas de celulite e de infecção sistêmica oriundas da região sul do Brasil. Em relação ao FNR, este estudo mostrou a influência deste regulador sobre importantes fatores associados à virulência, estando envolvido no controle de várias etapas do estabelecimento da infecção por cepas ExPEC. A deleção de fnr na cepa UPEC CFT 073 reduziu a motilidade, a expressão das fimbrias tipo I e tipo P, reduziu a expressão da hemolisina e controlou a expressão da ilha de patogenicidade do α- cetoglutarato. Além disso, a deleção de fnr fez tornou as bactérias incapazes de invadir células dos rins e da bexiga e de causar doença in vivo em camundongos de 6 semanas. FNR também foi capaz de controlar as etapas da infecção por NMEC 56. Uma vez deletado, as bactérias perderam a capacidade de causar bacteremia, de crescer no fluido cerebrospinal e de causar doença in vivo em ratos de 5 dias de idade. A deleção de fnr em APEC O1 resultou na diminuição da expressão da proteína OmpT plasmidial, da fímbria do tipo I e do auto-transportador AatA. A principal contribuição deste trabalho foi demonstrar que FNR atua na regulação da expressão de importantes fatores associados à virulência de cepas ExPEC (UPEC, NMEC e APEC), sendo importante para o estabelecimento da infecção por essas cepas. Neste trabalho, verificamos que, além da função já conhecida de regular os genes envolvidos na manutenção de um meio anaeróbico, FNR também atua no controle de genes associados à virulência de cepas ExPEC, refletindo na capacidade de causar doença que tais cepas apresentam. / Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, facultative anaerobic and has cosmopolitan distribution. E. coli colonizes the intestine of humans and other endothermic animals immediately after birth, establishing as an important member of the intestinal microbiota. Some strains of E. coli can acquire virulence factors thereby assuming a pathogenic nature, as in the case of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC strains have the ability to colonize and spread out in different niches of the host, and are divided into UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (newborn meningitis E. coli) and APEC (avian pathogenic E. coli). UPEC, NMEC and APEC share virulence factors. To be able to cause disease, ExPEC strains must produce virulence factors required for adherence, for iron uptake (siderophore) and for resistance to serum and may also contain genes encoding toxins and invasins. Although many virulence factors associated with the pathogenicity of ExPEC strains are known, the regulation of the expression of these factors has not yet been fully elucidated. Fumarate nitrate reductase (FNR) is a global regulatory protein, acting as a sensor of oxygen in Gram- negative bacteria. It has been shown that FNR relates virulence of pathogenic bacteria such as Shigella flexneri and Salmonella enterica serovar Typhimurium. The aim of this study was to do an epidemiological analysis and characterization of APEC strains as well as the investigation of regulation of ExPEC’s virulence factors by the global FNR regulator. The results of epidemiological analysis of APEC strains showed the profile of antimicrobial resistance , the prevalence of virulence factors and phylogenetic groups (according to the EcoR group) and the phylogenetic relationship of the isolates, providing an overview of the characterization of avian pathogenic E. coli causing severe cellulitis lesions and systemic infection originating from southern Brazil. In relation to FNR, this study showed the influence of this important regulator of virulence factors that is involved in controlling various stages of establishment of infection by ExPEC strains. Deletion of fnr in UPEC strain CFT 073 reduced motility and expression of type I and type P fimbriae, reduced the expression of hemolysin and control the expression of the pathogenicity island of α -ketoglutarate. Furthermore, fnr mutant strains were unable to invade cells of kidney and bladder, and to colonize the urinary tract of 6 weeks-old mice. FNR was also able to control the stages of infection of NMEC 56. The fnr mutant lost its ability to cause bacteremia, grow in cerebrospinal fluid, cause disease in 5 days old rats. Deletion of fnr in APEC O1 resulted in decreased expression of genes corresponding to the plasmid encoded OmpT protein, type I fimbriae and autotransporter AatA. The main contribution of this work was to demonstrate that FNR regulates expression of important virulence factors of ExPEC strains (UPEC, NMEC and APEC), which is important for the establishment of infection by these strains. In this work, we found that, besides the already known function in regulating genes involved in maintaining an anaerobic environment, FNR also acts in the control of virulenceassociated genes of ExPEC strains, reflecting the ability of these strains to cause disease.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é a causa de doenças extra-intestinais em aves, que se manifestam na forma de doenças localizadas ou infecções sistêmicas, gerando grandes perdas econômicas para a indústria aviária. O objetivo desse trabalho foi estudar isolados de APEC do sul do Brasil em relação à resistência a agentes antimicrobianos; a prevalência de fatores associados à virulência; a tipagem filogenética e o perfil filogenético. Na avicultura, os agentes antimicrobianos são muito utilizados na prevenção de infecções e na forma de promotores de crescimento. Foram utilizadas 41 isolados de E. coli obtidos de infecções sistêmicas e 144 isolados de celulite, utilizando o método de difusão com discos. Isolados APEC apresentaram baixos níveis de resistência, com excessão da tetraciclina e das sulfonamidas; e para isolados de colissepticemia, também foi observado uma resistência aos antimicrobianos que atuam na parede celular (ampicilina, cefalotina, bacitracina e ceftiofur). Vários fatores de virulência têm sido investigados em cepas APEC, os que têm sido mais frequentemente associados com a patogenicidade são as fímbrias de aderência F1 e Tsh (hemaglutinina sensível à temperatura); o sistema sideróforo aerobactina, a proteína iss (increased serum survival), a cápsula K e a produção de colicina V. Foram realizadas reações da polimerase em cadeia multiplex (PCR), testando um total de 33 fatores nos isolados APEC. Os fatores relacionados a adesão, sideróforos e resistência ao soro foram presentes em todas as amostras. Os fatores que apresentaram maior prevalência nas amostras foram, fimC, ompA, crlA e traT. A tipagem filogenética foi realizada através do método descrito por Clermont et al., (2000), que permite separar os isolados em 4 grupos filogenéticos principais (A, B1, B2 e D). Observamos a maior presença de isolados APEC pertencentes ao grupo D, tanto para celulite quanto para colissepticemia. A análise do perfil filogenético foi realizada pelo método ARDRA, que é baseado na variação da região do espaçamento intergênico (ISR) na região 16S-23S do DNA ribossômico. Os resultados foram analisados formando um dendrograma que mostra a proximidade filogenética dos isolados, indicando que não foi possível separar os clones de celulite dos de colissepticemia e não existem clones endêmicos nas regiões analisadas. Os resultados obtidos no presente estudo, fornecem um panorama geral da resistência aos agentes antimicrobianos, prevalência dos fatores de virulência, tipagem filogenética e perfil filogenético encontrados nos isolados de E. coli aviária do sul do Brasil de infecções de colissepticemia e celulite. / extra-intestinal infections in poultry, called colibacilose, and cause great economic losses to the poultry industry. The aim of this work was to examine APEC strains, isolated from avian cellulitis and colisepticemic chickens from South Brazil, for antibiotic resistance, presence of virulence-associated genes (VAGs), phylogenetic typing and phylogenetic analyses. In poultry, antibiotics are routinely used to prevent infection and promote growth. We analyzed the susceptibility to 15 antibiotics in 144 E. coli isolates collected from cellulitis lesions and in 41 isolates from septicemic chickens. APEC isolates have shown low levels of resistance excepting tetracycline and sulphonamides, and colisepticemic isolates were resistant to antibiotics that act in the cell wall, such as ampicilin, cephalotin, ceftiofur and bacitracin. The virulence factors most frequently associated with APEC pathogenicity are the adhesins F1 and Tsh (Temperature sensitive hemagglutinin), the iron acquisition system aerobactin, the protein Iss (increased serum survival), K1 capsule and production of colicin V. To investigate the presence of VAGs in the isolates, we performed multiplex polymerase chain reactions to test 33 virulence factors. Virulence factors related to adhesion, iron acquisition and serum resistance were present in almost all strains. The factors fimC, ompA, crlA and traT were the most frequent in APEC isolates. The phylogenetic typing were done using the Clermont et al. (2000) method, which classifies E. coli strains into four main phylogenetic groups (A, B1, B2, and D). Our phylogenetic typing has shown that cellulitis and colisseptisemic isolates were more related to group D. Amplified ribossomal restriction analysis (ARDRA) was performed in colissepticemic and celullitis isolates from broiler chickens from Southern Brasil. The similarity among isolates were observed with a dendrogram based on the band pattern. Our results have shown that clones of celullitis and colissepticemic isolates could not be distinguished and there is no endemic clones in regions observed analised. The results of the present work give us a panorama of the susceptibility to antibiotics, virulence factors, phylogenetic typing and phylogenetic analyses currently found in APEC isolates from severe lesions of cellulites and colibacillosis in south Brazil. Besides that, these analyses could be helpful for monitoring and preventing outbreakes of colibacilosis. Controling the first stages of the disease and detecting more prevalent clones in this region may reduce the incidence of the disease.

Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e de distribuição cosmopolita. E. coli coloniza o intestino de humanos e outros animais endotérmicos logo após o nascimento, estabelecendo-se como um importante membro da microbiota intestinal. Algumas cepas de E. coli podem adquirir fatores de virulência, assumindo assim, uma natureza patogênica, como é o caso das E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). As cepas ExPEC apresentam a capacidade de colonizar e se disseminar em diversos nichos no hospedeiro, e são divididas em UPEC (E. coli uropatogênica), NMEC (E. coli causadora de meningite neonatal) e APEC (E. coli patogênica para aves). UPEC, NMEC e APEC compartilham fatores associados à virulência. Para serem aptas a causar doença, cepas ExPEC devem apresentar pelo menos um fator associado à adesão, um fator para captação de ferro (sideróforo) e um fator de resistência ao soro, podendo, também, apresentar genes que codificam toxinas e invasinas. Embora sejam conhecidos muitos fatores de virulência associados à patogenicidade de cepas ExPEC, a regulação da expressão de tais fatores ainda não foi elucidada. Fumarato-nitrato-redutase (FNR) é uma proteína que atua como regulador global, agindo como um sensor da presença de oxigênio em bactérias gramnegativas. Já foi demonstrado que FNR está relacionada à regulação da virulência de bactérias patogênicas como Shigella flexneri e Salmonella enterica serovar Typhimurium. Este trabalho teve como objetivo a análise epidemiológica e caracterização de cepas APEC, bem como a investigação do controle da expressão de fatores associados à virulência de ExPEC pelo regulador global FNR. Os resultados da análise epidemiológica das cepas APEC mostram o perfil de resistência aos agentes antimicrobianos, a prevalência dos fatores de virulência e dos grupos filogenéticos (de acordo com a classificação EcoR) e a relação filogenética dos isolados, fornecendo um panorama da caracterização de E. coli patogênicas aviárias de lesões severas de celulite e de infecção sistêmica oriundas da região sul do Brasil. Em relação ao FNR, este estudo mostrou a influência deste regulador sobre importantes fatores associados à virulência, estando envolvido no controle de várias etapas do estabelecimento da infecção por cepas ExPEC. A deleção de fnr na cepa UPEC CFT 073 reduziu a motilidade, a expressão das fimbrias tipo I e tipo P, reduziu a expressão da hemolisina e controlou a expressão da ilha de patogenicidade do α- cetoglutarato. Além disso, a deleção de fnr fez tornou as bactérias incapazes de invadir células dos rins e da bexiga e de causar doença in vivo em camundongos de 6 semanas. FNR também foi capaz de controlar as etapas da infecção por NMEC 56. Uma vez deletado, as bactérias perderam a capacidade de causar bacteremia, de crescer no fluido cerebrospinal e de causar doença in vivo em ratos de 5 dias de idade. A deleção de fnr em APEC O1 resultou na diminuição da expressão da proteína OmpT plasmidial, da fímbria do tipo I e do auto-transportador AatA. A principal contribuição deste trabalho foi demonstrar que FNR atua na regulação da expressão de importantes fatores associados à virulência de cepas ExPEC (UPEC, NMEC e APEC), sendo importante para o estabelecimento da infecção por essas cepas. Neste trabalho, verificamos que, além da função já conhecida de regular os genes envolvidos na manutenção de um meio anaeróbico, FNR também atua no controle de genes associados à virulência de cepas ExPEC, refletindo na capacidade de causar doença que tais cepas apresentam. / Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, facultative anaerobic and has cosmopolitan distribution. E. coli colonizes the intestine of humans and other endothermic animals immediately after birth, establishing as an important member of the intestinal microbiota. Some strains of E. coli can acquire virulence factors thereby assuming a pathogenic nature, as in the case of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC strains have the ability to colonize and spread out in different niches of the host, and are divided into UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (newborn meningitis E. coli) and APEC (avian pathogenic E. coli). UPEC, NMEC and APEC share virulence factors. To be able to cause disease, ExPEC strains must produce virulence factors required for adherence, for iron uptake (siderophore) and for resistance to serum and may also contain genes encoding toxins and invasins. Although many virulence factors associated with the pathogenicity of ExPEC strains are known, the regulation of the expression of these factors has not yet been fully elucidated. Fumarate nitrate reductase (FNR) is a global regulatory protein, acting as a sensor of oxygen in Gram- negative bacteria. It has been shown that FNR relates virulence of pathogenic bacteria such as Shigella flexneri and Salmonella enterica serovar Typhimurium. The aim of this study was to do an epidemiological analysis and characterization of APEC strains as well as the investigation of regulation of ExPEC’s virulence factors by the global FNR regulator. The results of epidemiological analysis of APEC strains showed the profile of antimicrobial resistance , the prevalence of virulence factors and phylogenetic groups (according to the EcoR group) and the phylogenetic relationship of the isolates, providing an overview of the characterization of avian pathogenic E. coli causing severe cellulitis lesions and systemic infection originating from southern Brazil. In relation to FNR, this study showed the influence of this important regulator of virulence factors that is involved in controlling various stages of establishment of infection by ExPEC strains. Deletion of fnr in UPEC strain CFT 073 reduced motility and expression of type I and type P fimbriae, reduced the expression of hemolysin and control the expression of the pathogenicity island of α -ketoglutarate. Furthermore, fnr mutant strains were unable to invade cells of kidney and bladder, and to colonize the urinary tract of 6 weeks-old mice. FNR was also able to control the stages of infection of NMEC 56. The fnr mutant lost its ability to cause bacteremia, grow in cerebrospinal fluid, cause disease in 5 days old rats. Deletion of fnr in APEC O1 resulted in decreased expression of genes corresponding to the plasmid encoded OmpT protein, type I fimbriae and autotransporter AatA. The main contribution of this work was to demonstrate that FNR regulates expression of important virulence factors of ExPEC strains (UPEC, NMEC and APEC), which is important for the establishment of infection by these strains. In this work, we found that, besides the already known function in regulating genes involved in maintaining an anaerobic environment, FNR also acts in the control of virulenceassociated genes of ExPEC strains, reflecting the ability of these strains to cause disease.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é a causa de doenças extra-intestinais em aves, que se manifestam na forma de doenças localizadas ou infecções sistêmicas, gerando grandes perdas econômicas para a indústria aviária. O objetivo desse trabalho foi estudar isolados de APEC do sul do Brasil em relação à resistência a agentes antimicrobianos; a prevalência de fatores associados à virulência; a tipagem filogenética e o perfil filogenético. Na avicultura, os agentes antimicrobianos são muito utilizados na prevenção de infecções e na forma de promotores de crescimento. Foram utilizadas 41 isolados de E. coli obtidos de infecções sistêmicas e 144 isolados de celulite, utilizando o método de difusão com discos. Isolados APEC apresentaram baixos níveis de resistência, com excessão da tetraciclina e das sulfonamidas; e para isolados de colissepticemia, também foi observado uma resistência aos antimicrobianos que atuam na parede celular (ampicilina, cefalotina, bacitracina e ceftiofur). Vários fatores de virulência têm sido investigados em cepas APEC, os que têm sido mais frequentemente associados com a patogenicidade são as fímbrias de aderência F1 e Tsh (hemaglutinina sensível à temperatura); o sistema sideróforo aerobactina, a proteína iss (increased serum survival), a cápsula K e a produção de colicina V. Foram realizadas reações da polimerase em cadeia multiplex (PCR), testando um total de 33 fatores nos isolados APEC. Os fatores relacionados a adesão, sideróforos e resistência ao soro foram presentes em todas as amostras. Os fatores que apresentaram maior prevalência nas amostras foram, fimC, ompA, crlA e traT. A tipagem filogenética foi realizada através do método descrito por Clermont et al., (2000), que permite separar os isolados em 4 grupos filogenéticos principais (A, B1, B2 e D). Observamos a maior presença de isolados APEC pertencentes ao grupo D, tanto para celulite quanto para colissepticemia. A análise do perfil filogenético foi realizada pelo método ARDRA, que é baseado na variação da região do espaçamento intergênico (ISR) na região 16S-23S do DNA ribossômico. Os resultados foram analisados formando um dendrograma que mostra a proximidade filogenética dos isolados, indicando que não foi possível separar os clones de celulite dos de colissepticemia e não existem clones endêmicos nas regiões analisadas. Os resultados obtidos no presente estudo, fornecem um panorama geral da resistência aos agentes antimicrobianos, prevalência dos fatores de virulência, tipagem filogenética e perfil filogenético encontrados nos isolados de E. coli aviária do sul do Brasil de infecções de colissepticemia e celulite. / extra-intestinal infections in poultry, called colibacilose, and cause great economic losses to the poultry industry. The aim of this work was to examine APEC strains, isolated from avian cellulitis and colisepticemic chickens from South Brazil, for antibiotic resistance, presence of virulence-associated genes (VAGs), phylogenetic typing and phylogenetic analyses. In poultry, antibiotics are routinely used to prevent infection and promote growth. We analyzed the susceptibility to 15 antibiotics in 144 E. coli isolates collected from cellulitis lesions and in 41 isolates from septicemic chickens. APEC isolates have shown low levels of resistance excepting tetracycline and sulphonamides, and colisepticemic isolates were resistant to antibiotics that act in the cell wall, such as ampicilin, cephalotin, ceftiofur and bacitracin. The virulence factors most frequently associated with APEC pathogenicity are the adhesins F1 and Tsh (Temperature sensitive hemagglutinin), the iron acquisition system aerobactin, the protein Iss (increased serum survival), K1 capsule and production of colicin V. To investigate the presence of VAGs in the isolates, we performed multiplex polymerase chain reactions to test 33 virulence factors. Virulence factors related to adhesion, iron acquisition and serum resistance were present in almost all strains. The factors fimC, ompA, crlA and traT were the most frequent in APEC isolates. The phylogenetic typing were done using the Clermont et al. (2000) method, which classifies E. coli strains into four main phylogenetic groups (A, B1, B2, and D). Our phylogenetic typing has shown that cellulitis and colisseptisemic isolates were more related to group D. Amplified ribossomal restriction analysis (ARDRA) was performed in colissepticemic and celullitis isolates from broiler chickens from Southern Brasil. The similarity among isolates were observed with a dendrogram based on the band pattern. Our results have shown that clones of celullitis and colissepticemic isolates could not be distinguished and there is no endemic clones in regions observed analised. The results of the present work give us a panorama of the susceptibility to antibiotics, virulence factors, phylogenetic typing and phylogenetic analyses currently found in APEC isolates from severe lesions of cellulites and colibacillosis in south Brazil. Besides that, these analyses could be helpful for monitoring and preventing outbreakes of colibacilosis. Controling the first stages of the disease and detecting more prevalent clones in this region may reduce the incidence of the disease.

Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e de distribuição cosmopolita. E. coli coloniza o intestino de humanos e outros animais endotérmicos logo após o nascimento, estabelecendo-se como um importante membro da microbiota intestinal. Algumas cepas de E. coli podem adquirir fatores de virulência, assumindo assim, uma natureza patogênica, como é o caso das E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). As cepas ExPEC apresentam a capacidade de colonizar e se disseminar em diversos nichos no hospedeiro, e são divididas em UPEC (E. coli uropatogênica), NMEC (E. coli causadora de meningite neonatal) e APEC (E. coli patogênica para aves). UPEC, NMEC e APEC compartilham fatores associados à virulência. Para serem aptas a causar doença, cepas ExPEC devem apresentar pelo menos um fator associado à adesão, um fator para captação de ferro (sideróforo) e um fator de resistência ao soro, podendo, também, apresentar genes que codificam toxinas e invasinas. Embora sejam conhecidos muitos fatores de virulência associados à patogenicidade de cepas ExPEC, a regulação da expressão de tais fatores ainda não foi elucidada. Fumarato-nitrato-redutase (FNR) é uma proteína que atua como regulador global, agindo como um sensor da presença de oxigênio em bactérias gramnegativas. Já foi demonstrado que FNR está relacionada à regulação da virulência de bactérias patogênicas como Shigella flexneri e Salmonella enterica serovar Typhimurium. Este trabalho teve como objetivo a análise epidemiológica e caracterização de cepas APEC, bem como a investigação do controle da expressão de fatores associados à virulência de ExPEC pelo regulador global FNR. Os resultados da análise epidemiológica das cepas APEC mostram o perfil de resistência aos agentes antimicrobianos, a prevalência dos fatores de virulência e dos grupos filogenéticos (de acordo com a classificação EcoR) e a relação filogenética dos isolados, fornecendo um panorama da caracterização de E. coli patogênicas aviárias de lesões severas de celulite e de infecção sistêmica oriundas da região sul do Brasil. Em relação ao FNR, este estudo mostrou a influência deste regulador sobre importantes fatores associados à virulência, estando envolvido no controle de várias etapas do estabelecimento da infecção por cepas ExPEC. A deleção de fnr na cepa UPEC CFT 073 reduziu a motilidade, a expressão das fimbrias tipo I e tipo P, reduziu a expressão da hemolisina e controlou a expressão da ilha de patogenicidade do α- cetoglutarato. Além disso, a deleção de fnr fez tornou as bactérias incapazes de invadir células dos rins e da bexiga e de causar doença in vivo em camundongos de 6 semanas. FNR também foi capaz de controlar as etapas da infecção por NMEC 56. Uma vez deletado, as bactérias perderam a capacidade de causar bacteremia, de crescer no fluido cerebrospinal e de causar doença in vivo em ratos de 5 dias de idade. A deleção de fnr em APEC O1 resultou na diminuição da expressão da proteína OmpT plasmidial, da fímbria do tipo I e do auto-transportador AatA. A principal contribuição deste trabalho foi demonstrar que FNR atua na regulação da expressão de importantes fatores associados à virulência de cepas ExPEC (UPEC, NMEC e APEC), sendo importante para o estabelecimento da infecção por essas cepas. Neste trabalho, verificamos que, além da função já conhecida de regular os genes envolvidos na manutenção de um meio anaeróbico, FNR também atua no controle de genes associados à virulência de cepas ExPEC, refletindo na capacidade de causar doença que tais cepas apresentam. / Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, facultative anaerobic and has cosmopolitan distribution. E. coli colonizes the intestine of humans and other endothermic animals immediately after birth, establishing as an important member of the intestinal microbiota. Some strains of E. coli can acquire virulence factors thereby assuming a pathogenic nature, as in the case of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC strains have the ability to colonize and spread out in different niches of the host, and are divided into UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (newborn meningitis E. coli) and APEC (avian pathogenic E. coli). UPEC, NMEC and APEC share virulence factors. To be able to cause disease, ExPEC strains must produce virulence factors required for adherence, for iron uptake (siderophore) and for resistance to serum and may also contain genes encoding toxins and invasins. Although many virulence factors associated with the pathogenicity of ExPEC strains are known, the regulation of the expression of these factors has not yet been fully elucidated. Fumarate nitrate reductase (FNR) is a global regulatory protein, acting as a sensor of oxygen in Gram- negative bacteria. It has been shown that FNR relates virulence of pathogenic bacteria such as Shigella flexneri and Salmonella enterica serovar Typhimurium. The aim of this study was to do an epidemiological analysis and characterization of APEC strains as well as the investigation of regulation of ExPEC’s virulence factors by the global FNR regulator. The results of epidemiological analysis of APEC strains showed the profile of antimicrobial resistance , the prevalence of virulence factors and phylogenetic groups (according to the EcoR group) and the phylogenetic relationship of the isolates, providing an overview of the characterization of avian pathogenic E. coli causing severe cellulitis lesions and systemic infection originating from southern Brazil. In relation to FNR, this study showed the influence of this important regulator of virulence factors that is involved in controlling various stages of establishment of infection by ExPEC strains. Deletion of fnr in UPEC strain CFT 073 reduced motility and expression of type I and type P fimbriae, reduced the expression of hemolysin and control the expression of the pathogenicity island of α -ketoglutarate. Furthermore, fnr mutant strains were unable to invade cells of kidney and bladder, and to colonize the urinary tract of 6 weeks-old mice. FNR was also able to control the stages of infection of NMEC 56. The fnr mutant lost its ability to cause bacteremia, grow in cerebrospinal fluid, cause disease in 5 days old rats. Deletion of fnr in APEC O1 resulted in decreased expression of genes corresponding to the plasmid encoded OmpT protein, type I fimbriae and autotransporter AatA. The main contribution of this work was to demonstrate that FNR regulates expression of important virulence factors of ExPEC strains (UPEC, NMEC and APEC), which is important for the establishment of infection by these strains. In this work, we found that, besides the already known function in regulating genes involved in maintaining an anaerobic environment, FNR also acts in the control of virulenceassociated genes of ExPEC strains, reflecting the ability of these strains to cause disease.