Nos hospedeiros mamíferos, os parasitas do gênero Leishmania vivem nos macrófagos se evadindo de mecanismos microbicidas dessas células, tais como a produção de óxido nítrico (NO). A produção de NO pela enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nos macrófagos requer L-arginina como substrato, o mesmo aminoácido utilizado pela arginase para produzir ornitina e uréia. Logo, a arginase pode atuar na sobrevivência de Leishmania no hospedeiro competindo com a iNOS, reduzindo a produção de NO, além de seu papel na via de poliaminas, essencial para a replicação dessas células. Com isso, o objetivo desse estudo é elucidar o papel da arginase de L. (L.) amazonensis durante o ciclo de vida do parasita, particularmente, sua função no estabelecimento e na manutenção da infecção da célula hospedeira, e como esse papel seria exercido. Nesse sentido, obtivemos soros policlonais anti-arginase, a partir da arginase recombinante de L. (L.) amazonensis purificada, e esses soros foram utilizados na imunomarcação da enzima em preparações com formas promastigotas e macrófagos infectados com amastigotas de L. (L.) amazonensis. Assim, determinamos a compartimentalização da arginase nos glicossomos tanto na forma promastigota do parasita como na forma amastigota, durante a infecção. Além disso, obtivemos diversos mutantes com a expressão de arginase modificada quanto à quantidade e localização que nos permitiram avaliar a importância da compartimentalização dessa enzima nos glicossomos. Entre esses mutantes temos: superexpressores de arginase, com e sem sinal de endereçamento para glicossomo; parasitas com um alelo de arginase nocauteado e o outro substituído pelo cassete contendo o segmento ddFKBP-ARG, que teriam a expressão de arginase regulada pelo domínio ddFKB sendo nocautes funcionais de arginase; e finalmente, também obtivemos parasitas nocaute nulo de arginase. A análise desses mutantes permitiu conclusões importantes para o conhecimento da fisiologia do parasita e sua relação com o macrófago, revelando que o papel da arginase de Leishmania parece ser muito mais complexo do que o inicialmente postulado, participando na regulação de outras vias metabólicas do próprio parasita e da célula hospedeira. Paralelamente, também determinamos que o sistema ddFKBP é funcional em L. (L.) amazonensis, e assim pode ser utilizado no estudo funcional de outras proteínas importantes para esses parasitas. / In the mammal host, Leishmania parasites live inside macrophages escaping from their microbicidal mechanisms, such as the nitric oxide (NO) production. The macrophage NO production by inducible nitric oxide synthase (iNOS) requires L-arginine as substrate, the same amino acid required by arginase to generate ornithine and urea. So, arginase may play a dual role in Leishmania survival reducing the NO by competing with iNOS, and participating in the polyamines pathway, which is essential for the cells replication. Considering this, the aim of this study is to elucidate the role of L. (L.) amazonensis arginase during the parasite life cycle, mainly its function for the establishment and maintenance of the host cell infection, besides to elucidate the way that this enzyme plays its role. With this in mind, we obtained polyclonal anti-arginase sera using purified recombinant L. (L.) amazonensis arginase, these sera were used in immunolabelling assays of L. (L.) amazonensis promastigotes and macrophages infected with L. (L.) amazonensis amastigotes. These experiments determined that arginase is compartmentalized in the glycosomes of both promastigotes and amastigotes, during infection. Besides, we obtained several mutants with altered arginase expression, modified in terms of quantity and location, which permitted us to evaluate the importance of glycosome arginase compartmentalization. Among these mutants are: overexpressors of arginase, with and without glycosomal addressing signal; parasites with one arginase allele knocked out and the other one replaced by a sequence containing the ddFKBP-ARG fusion that would allow us to regulate arginase expression, working like a functional arginase knockout; and finally, we also obtained arginase null knockouts parasites. The mutants analyses lead us to important conclusions for the knowledge of the parasite physiology and its relationship with the host macrophage, revealing that the Leishmania arginase role appears to be more complex than previously thought, playing an important role in the regulation of other metabolic pathways, of the own parasite and of the host cell. In the other hand, we also determined that the ddFKBP system is functional in L. (L.) amazonensis, and then can be used for functional studies of other important parasite´s proteins.

Nos hospedeiros mamíferos, os parasitas do gênero Leishmania vivem nos macrófagos se evadindo de mecanismos microbicidas dessas células, tais como a produção de óxido nítrico (NO). A produção de NO pela enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nos macrófagos requer L-arginina como substrato, o mesmo aminoácido utilizado pela arginase para produzir ornitina e uréia. Logo, a arginase pode atuar na sobrevivência de Leishmania no hospedeiro competindo com a iNOS, reduzindo a produção de NO, além de seu papel na via de poliaminas, essencial para a replicação dessas células. Com isso, o objetivo desse estudo é elucidar o papel da arginase de L. (L.) amazonensis durante o ciclo de vida do parasita, particularmente, sua função no estabelecimento e na manutenção da infecção da célula hospedeira, e como esse papel seria exercido. Nesse sentido, obtivemos soros policlonais anti-arginase, a partir da arginase recombinante de L. (L.) amazonensis purificada, e esses soros foram utilizados na imunomarcação da enzima em preparações com formas promastigotas e macrófagos infectados com amastigotas de L. (L.) amazonensis. Assim, determinamos a compartimentalização da arginase nos glicossomos tanto na forma promastigota do parasita como na forma amastigota, durante a infecção. Além disso, obtivemos diversos mutantes com a expressão de arginase modificada quanto à quantidade e localização que nos permitiram avaliar a importância da compartimentalização dessa enzima nos glicossomos. Entre esses mutantes temos: superexpressores de arginase, com e sem sinal de endereçamento para glicossomo; parasitas com um alelo de arginase nocauteado e o outro substituído pelo cassete contendo o segmento ddFKBP-ARG, que teriam a expressão de arginase regulada pelo domínio ddFKB sendo nocautes funcionais de arginase; e finalmente, também obtivemos parasitas nocaute nulo de arginase. A análise desses mutantes permitiu conclusões importantes para o conhecimento da fisiologia do parasita e sua relação com o macrófago, revelando que o papel da arginase de Leishmania parece ser muito mais complexo do que o inicialmente postulado, participando na regulação de outras vias metabólicas do próprio parasita e da célula hospedeira. Paralelamente, também determinamos que o sistema ddFKBP é funcional em L. (L.) amazonensis, e assim pode ser utilizado no estudo funcional de outras proteínas importantes para esses parasitas. / In the mammal host, Leishmania parasites live inside macrophages escaping from their microbicidal mechanisms, such as the nitric oxide (NO) production. The macrophage NO production by inducible nitric oxide synthase (iNOS) requires L-arginine as substrate, the same amino acid required by arginase to generate ornithine and urea. So, arginase may play a dual role in Leishmania survival reducing the NO by competing with iNOS, and participating in the polyamines pathway, which is essential for the cells replication. Considering this, the aim of this study is to elucidate the role of L. (L.) amazonensis arginase during the parasite life cycle, mainly its function for the establishment and maintenance of the host cell infection, besides to elucidate the way that this enzyme plays its role. With this in mind, we obtained polyclonal anti-arginase sera using purified recombinant L. (L.) amazonensis arginase, these sera were used in immunolabelling assays of L. (L.) amazonensis promastigotes and macrophages infected with L. (L.) amazonensis amastigotes. These experiments determined that arginase is compartmentalized in the glycosomes of both promastigotes and amastigotes, during infection. Besides, we obtained several mutants with altered arginase expression, modified in terms of quantity and location, which permitted us to evaluate the importance of glycosome arginase compartmentalization. Among these mutants are: overexpressors of arginase, with and without glycosomal addressing signal; parasites with one arginase allele knocked out and the other one replaced by a sequence containing the ddFKBP-ARG fusion that would allow us to regulate arginase expression, working like a functional arginase knockout; and finally, we also obtained arginase null knockouts parasites. The mutants analyses lead us to important conclusions for the knowledge of the parasite physiology and its relationship with the host macrophage, revealing that the Leishmania arginase role appears to be more complex than previously thought, playing an important role in the regulation of other metabolic pathways, of the own parasite and of the host cell. In the other hand, we also determined that the ddFKBP system is functional in L. (L.) amazonensis, and then can be used for functional studies of other important parasite´s proteins.

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As leishmanioses constituem um complexo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania. São transmitidas pela picada de fêmeas parasitadas do gênero Phlebotomus e/ou Lutzomyia. A leishmaniose é uma doença zoonótica que afeta mais de 12 milhões de pessoas no mundo, e constituem uma preocupação para a saúde pública. A arginase de Leishmania é a primeira enzima da via das poliaminas e constitui um importante alvo terapêutico devido ao seu papel ativo na sobrevivência do parasita no hospedeiro. Neste trabalho, 78 moléculas sintéticas e naturais de diferentes grupos químicos foram testadas com objetivo de determinar a sua capacidade de inibição da enzima arginase recombinante de Leishmania (L.) amazonensis (ARG-LA). Foram considerados inibidores da ARG-LA os compostos que apresentaram uma inibição ≥ 70% a 100 µM. Os resultados revelaram 28,2 % de compostos com elevado potencial de inibição da ARG-LA, exibindo valores de IC50 na faixa micromolar. A cinética de inibição foi determinada pelo método de Dixon e Cornish-Bowden e revelou diferentes mecanismos de inibição enzimática. As moléculas sintéticas com potencial inibitório da ARG-LA correspondem aos ésteres e cinamidas biosintéticos, cinamidas derivados do ácido cafeico e pirazolopirimidinas. Além disso, foram testados 4 compostos naturais estruturalmente relacionados ao ácido caféico: piceatannol e 3 ácidos salvianólicos (A, B e D). Os resultados poderão servir de ponto de partida para o planejamento e síntese de novos fármacos para tratamento da leishmaniose, baseado na inibição da ARG-LA. / Leishmaniasis is a complex of diseases caused by Leishmania protozoa. They are transmitted by the bite of parasitized females of the Phlebotomus and/or Lutzomyia genus. Leishmaniasis is essentially a zoonotic disease, affecting more than 12 million people in the world and are a public health concern. Leishmania arginase is the first enzyme in the polyamine pathway and constitutes an important therapeutic target due to its active role in the parasite\'s survival in the host. In this work 78 compounds (synthetic and natural) of different chemical groups were tested to determine their ability to inhibit the recombinant Leishmania (L.) amazonensis arginase (LA-ARG). The IC50 and Ki were determined to the compounds that showed inhibition ≥ 70% at 100 µM. The results indicated that 28.2% of the compounds have a high potential for LA-ARG inhibition, with IC50 values in the micromolar range and different enzymatic inhibition mechanisms. The main synthetic groups with the high inhibitory potential of the enzyme corresponding to the caffeic acid derivatives, pyrazolopyrimidines, and the natural compounds piceatannol and salvianolic acids. These results indicate a potential for the synthesis of new drugs for the treatment of leishmaniasis, based on parasite arginase inhibition.

The outcome of infection with Leishmania major depends in part on the balance between arginase and inducible nitric oxide synthase in macrophages. These enzymes compete for the substrate L-arginine. Leishmania major also encodes an arginase gene but, the role of this parasite-derived enzyme in infection remains unclear. We hypothesize that parasite-derived arginase influences parasite survival and host immune response to L. major. To examine this hypothesis, we employed an arginase deficient null mutant L. major in in vitro and in vivo experiments. Our results show that deficiency of parasite-derived arginase impaired parasite proliferation and disease pathogenesis. Increased arginase activity however neither affected nitric oxide production, nor did it correlate with IL-4 production. Primary infection of normally resistant hosts causes a chronic infection and does not protect them against re-infection. Thus, parasite-derived arginase is of nutritional importance to L. major, but is not a feasible therapeutic drug target.

The outcome of infection with Leishmania major depends in part on the balance between arginase and inducible nitric oxide synthase in macrophages. These enzymes compete for the substrate L-arginine. Leishmania major also encodes an arginase gene but, the role of this parasite-derived enzyme in infection remains unclear. We hypothesize that parasite-derived arginase influences parasite survival and host immune response to L. major. To examine this hypothesis, we employed an arginase deficient null mutant L. major in in vitro and in vivo experiments. Our results show that deficiency of parasite-derived arginase impaired parasite proliferation and disease pathogenesis. Increased arginase activity however neither affected nitric oxide production, nor did it correlate with IL-4 production. Primary infection of normally resistant hosts causes a chronic infection and does not protect them against re-infection. Thus, parasite-derived arginase is of nutritional importance to L. major, but is not a feasible therapeutic drug target.

Thesis (M.S.)--University of Wisconsin--Madison, 1971. / eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T21:03:45Z No. of bitstreams: 1 Ebenézer de Mello Cruz Inibição da arginase de Leishmania 2009.pdf: 2063950 bytes, checksum: 15d7234f96fe97bc8cfe6618e9985787 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T21:03:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ebenézer de Mello Cruz Inibição da arginase de Leishmania 2009.pdf: 2063950 bytes, checksum: 15d7234f96fe97bc8cfe6618e9985787 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leishmaniose atinge cerca de 12 milhões de pessoas no mundo com aproximadamente 60 mil mortes por ano. Os fármacos utilizados são ineficazes e apresentam graves efeitos colaterais, tornado necessária a busca por novos fármacos. A busca por princípios bioativos torna-se mais eficaz quando direcionada pelo fracionamento guiado por bioensaios específicos. Um alvo promissor para busca por novos fármacos é a enzima arginase, pois a Leishmania deficiente em arginase é incapaz de produzir poliaminas, que são essenciais para a proliferação, diferenciação e síntese de macromoléculas, sendo assim o alvo selecionado para direcionar o fracionamento do extrato etanólico de Cecropia pachystachya, visto que já foi relatada a inibição da arginase de Leishmania (L.) amazonensis por extratos desta espécie vegetal. Neste trabalho foi demonstrado que o extrato acetato de etila apresentou uma forte inibição da arginase de L. (L.) amazonensis, uma leve inibição da arginase de Rattus norvegicus e não apresentou toxicidade em esplenócitos. Com a análise ultraestrutural foi possível inferir que a inibição da arginase poderia estar provocando estresse oxidativo, visível com a formação de concreção eletrondensa na matriz mitocondrial e desorganização do k- DNA, possivelmente devido à inibição da arginase e conseqüente diminuição da biossíntese de poliaminas e tripanotiona. Em análise computacional, as prováveis substâncias presentes no extrato acetato de etila (catequina, ácido clorogênico, epicatequina, isoorientina, isoquercetrina, isovitexina, orientina e procianidina B2) interagem com os aminoácidos ao redor do sítio ativo da arginase de L. (L.) amazonensis impedindo a entrada do substrato ou a saída dos produtos resultantes da reação o que acarretaria diminuição na velocidade máxima da reação. As frações da CLC03 parecem interferir em um outro mecanismo que promova a morte do parasito além da inibição da arginase. Após os fracionamentos realizados, as amostras analisadas ainda se mostravam como misturas quando analisadas por CLAE e RMN de 1H. A diminuição do crescimento das formas promastigotas de L. (L.) amazonensis pode também promover a diminuição da infecção em macrófagos, mediado pela produção de NO. / Leishmaniasis affects approximately 12 million people worldwide with approximately 60,000 deaths per year. The drugs used are ineffective and have severe side effects, creating to need of the search for new drugs. The search for bioactive principles becomes more effective when directed by fractionation guided by specific bioassays. A promising target to search for new drugs is the enzyme arginase, because a arginase deficient Leishmania is unable to produce polyamines, which are essential for the proliferation, differentiation and synthesis of macromolecules, thus becoming the target used to direct fractionation of the extract of Cecropia pachyatachya, as it has been reported on the inhibition of arginase L. (L.) amazonensis. The ethyl acetate extract showed a strong inhibition of arginase L. (L.) amazonensis, a low inhibition of arginase Rattus novergicus and didn’t show toxicity to splenocytes. By ultrastructural analysis was possible to infer that the inhibition of arginase could be causing an oxidative stress, visible with the formation of electrondense deposits in the mitochondrial matrix and disorganization of k-DNA, possibly due to inhibition of arginase and consequent decrease of polyamines and trypanothione biosynthesis. In computer analysis, the possible compounds present in the ethyl acetate extract (catechin, chlorogenic acid, epicatechin, isoorientin, isoquercetrin, isovitexin, orientin and procyanidin B2) interact with the amino acids surrounding the active site of L. (L.) amazonensis arginase preventing the entry of the substrate or the release of the reaction products which would result in a decrease in of velocity reaction. The fractions of CLC03 seem to interfere with another mechanism that promotes the death of the parasite besides the arginase inhibition. After the fractionations performed, the samples were still mixtures when as determined by HPLC and 1H NMR. The reduced growth of promastigotes of L. (L.) amazonensis may be associated to the reduction of infection in macrophages, mediated by NO production.

Hipótese do estudo: O presente estudo parte do pressuposto de que a terapia periodontal não cirúrgica é eficaz no tratamento da doença periodontal. Objetivos: este estudo de intervenção avaliou a eficácia dos procedimentos de raspagem e aplainamento radicular utilizando como ferramenta de validação parâmetros clínicos, microbianos e salivares em indivíduos diagnosticados com gengivite e periodontite comparando-os a controles saudáveis. Método: Foram alocados no presente estudo 89 indivíduos assim caracterizados: 31 periodontalmente saudáveis (K), 27 com gengivite (G) e 31 com periodontite crônica (P). Avaliou-se os seguintes parâmetros clínicos: índice de placa, índice de sangramento, profundidade de sondagem e nível de inserção clínica. Avaliou-se ainda a presença dos periodontopatógenos Campylobacter rectus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia, Treponema denticola e Prevotella intermedia por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Finalmente, a presença salivar de arginase e proteína total por meio de espectrofotometria foi também considerada. Todos estes parâmetros foram mensurados em pré e pós terapia periodontal. Tratamento estatístico dos dados intragrupo foi realizada pelo teste de Wilcoxon, enquanto os dados intergrupos foram avaliados pelos testes Mann-Witney e Kruskal-Wallis, adotando-se significância estatística quando p<0,05. Resultados: Verificou-se melhora dos parâmetros clínicos nos grupos G e P após o tratamento (p<0,05). Houve redução da atividade de arginase e proteína total salivares nos grupos P (p<0,05) e G, equiparando-se ao grupo controle (K). T. forsythia reduziu no grupo G (p<0,05), enquanto P. gingivalis, T. denticola, P. intermedia e T. forsythia apresentaram redução no grupo P (p<0,05). Conclusão: O pressuposto apresentado neste estudo foi confirmado, tendo como validação a utilização dos parâmetros clínicos, microbiológicos e salivares. / Hypothesis of the study: the present study assumes that non-surgical periodontal therapy is efficient on the periodontal disease treatment. Aims: this interventional study evaluated the efficacy of the scaling and root planing procedures by using as a tool of validation, clinical, microbiological and salivary parameters in subjects diagnosed with gingivitis and periodontitis comparing them with healthy controls. Methods: In the present study, 89 subjects were characterized as follows: 31 periodontal healthy (K), 27 with gingivitis (G), and 31 with chronic periodontitis (P). The following parameters were evaluated: plaque index, bleeding index, probing depth, and clinical attachment level. The presence of the periodontalpathogens Campylobacter rectus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia, Treponema denticola, and Prevotella intermedia were also evaluated by polymerase chain reaction (PCR). Finally, the presence of salivary arginase and total protein by spectrophotometry were also considered. All these parameters were measured before and after periodontal treatment. Intra-group statistical analysis were performed by Wilcoxons test while the inter-group analysis were evaluated by Mann-Witney and Kruskal-Wallis tests, adopting a statistical significance when p<0,05. Results: An improvement of the clinical parameters was verified in the G and P groups after treatment (p<0,05). There was a significant reduction of the salivary arginase activity and protein content in the P and G groups compared to the control group (K). T. forsythia was diminished in the G group (p<0,05), while P. gingivalis, T. denticola, P. intermedia and T. forsythia showed a decrease in the P group (p<0,05). Conclusion: the hypothesis of the present study was confirmed being validated by clinical, microbiological and salivary parameters.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-14Bitstream added on 2014-06-13T20:00:43Z : No. of bitstreams: 1 tumitan_arp_dr_arafcf.pdf: 486259 bytes, checksum: e8184ac2899ff2bbb1e4a6c4b9f77604 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo deste estudo foi verificar a influência da infecção por Y. enterocolitica na modulação de macrófagos M1 e M2 em camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6). Camundongos de ambas as linhagens foram infectados com Y. enterocolitica O:8 WA 2707. Células do lavado peritoneal e células esplênicas foram retiradas no 1º, 3º e 5º dia pós-infecção. Em cultura de macrófagos foi verificada a atividade das enzimas iNOS e arginase, medidas por seus produtos NO/citrulina e ornitina, respectivamente, e a produção de TGFb-1. Em cultura de linfócitos foram verificadas as respostas Th1 e Th2, avaliadas pela produção das citocinas IFN-g e IL-4. No 1º e 3º dia após infecção com Y. enterocolitica, os macrófagos de camundongos C57BL/6 aumentaram a produção de NO/citrulina e não produziram TGFb-1; enquanto que os macrófagos de BALB/c aumentaram a produção de ornitina e de TGFb-1. Os linfócitos de C57BL/6 aumentaram a produção de IFN-g e não produziram IL-4, enquanto que os BALB/c apresentaram um aumento mais discreto nos níveis de IFN-g e produziram IL-4 no 5º dia pós-infecção. / The objective of this study was to verify the modulation of Y. enterocolitica infection in M1 and M2 macrophage modulation in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice. Both strains of mice were infected with Y. enterocolitica O:8 WA 2707. Peritoneal macrophages and spleen cells were obtained on days 1, 3 and 5 post-infection. We verified the iNOS and the arginase activities in macrophage cultures, measured by their NO/citruline and ornithine products, respectively. The TGF b-1 production was also measured in supernatants of macrophage cultures. The Th1 and Th2 responses were evaluated in supernatants of lymphocyte cultures, by IFNg and IL-4 production. In the 1st and 3rd day after infection with Y. enterocolitica, macrophages from C57BL/6 mice increased their NO/citruline production and they didn't produce TGF b-1 ; while macrophages from BALB/c mice increased their ornithine and TGF b-1 production. The lymphocytes from C57BL/6 mice increased their IFNg production and didn't produce IL-4, while BALB/c showed a discreet increase in the IFNg levels and produced IL-4 in the 5th day post-infection.