Arginase has been found to occur in the tentacles, gut, and body wall of Pista pacifica Berkeley_ Partially purified arginase from the intestine has a molecular weight of 200,000, a Km of about 155 mM, an arginase/canavanase ratio of 22, a pH optimum of 10.5, and a temperature optimum of 60°C. In addition, P. pacifica arginase is competitively inhibited by ornithine but is not inhibited by high arginine concentrations, nor by sulfhydryl reagents. The enzyme is not stimulated by exogenous manganese and breaks down into an active subunit under harsh treatment. The subunit has a KID of about 118 mM and is also unaffected by exogenous manganese. Polychaete arginase shows most of the properties characteristic of arginases from other animal and plant species. However, none of the characteristics observed to date can be correlated with a particular mode of nitrotelism.

No description available.

Interleukin-13 (IL-13) has been implicated as a critical inducer of a number of features of allergy and asthma including the induction of nonspecific airway hyperresponsiveness (AHR), eosinophilic inflammatory response, eotaxin production, excess mucus formation, and fibrosis. Determining the mechanism(s) of AHR, a hallmark of asthma, is crucial to our understanding of both the pathogenesis and successful treatment of asthma. After carrying out initial experiments to determine the effect of IL-13-induced AHR on murine and rat tracheal rings, mice tissues were chosen for subsequent experiments due to their consistent results and the fact that the mouse genetic map was completed in 1996, which will enable subsequent gene therapy work. Human and mouse share a high percentage of their genes with an average of 85% homology. Numerous IL-13 signalling studies have concentrated on the JAK/STAT6 pathway. IL-13 also activates phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and downstream effector molecules. In experiments presented in this thesis pharmacological and genetic approaches implicate the involvement of PI3K and its individual isoform PI3Kδ in IL-13 induced AHR in vitro and this involvement was confirmed using a small interference RNA (siRNA) technology approach. However, IL-13 induced an early activation of PI3K, whereas increased responsiveness was not observed until overnight incubation. Arginase I induction was demonstrated to be another PI3K-dependent potential mechanism of IL-13-induced hyperresponsiveness. The epithelium is also implicated in IL-13-induced hyperresponsiveness, however, the induction of arginase I was demonstrated in both intact and denuded epithelium tracheal rings. The siRNA approach was also employed in 9HTEo-, A549 and BEAS-2B cell lines using different transfecting agents. From these findings, it is concluded that class IA p110δ could be a useful target for the treatment of asthma by preventing IL-13-induced airway smooth muscle hyperresponsiveness and also that arginase I may be involved in IL-13-induced hyperresponsiveness through PI3K- and epithelial-dependent pathways.

Causada por protozoários do gênero Leishmania, a leishmaniose é uma doença infecciosa que afeta milhões de pessoas em todos os continentes. São grandes os desafios no tratamento da leishmaniose porque os fármacos atualmente disponíveis apresentam alta toxicidade, efeitos colaterais, alto custo e resistência parasitária. Sendo assim, faz-se necessário o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da doença de maneira mais eficiente. A investigação de novas alternativas terapêuticas, novos alvos bioquímicos, em particular a arginase em de Leishmania (L) amazonensis, é considerada um alvo interessante na busca de novos compostos leishmanicidas. A via bioquímica em que está envolvida a arginase é fundamental para a manutenção do ciclo de vida do parasito, sendo responsável pela hidrólise de L-arginina em L-ornitina em mamíferos. Muitos compostos oriundos de produtos naturais tem sido relatados como inibidores da arginase de L. (L.) amazonensis e a presença de grupos hidroxila em suas estruturas mostraram ser importantes na atividade inibidora da enzima. O objetivo desse trabaho estudar a interação bioquímica entre a enzima arginase de L. (L.) amazonensis, extratos vegetais, flavonoides e derivados do ácido cafeico. O extrato acetônico de folhas de Qualea grandiflora apresentou maior capacidade inibitória da arginase (IC50 = 1,7 ± 01 µg/mL) dentre os extratos analisados. Dentre os flavonoides, o composto mais potente foi a taxifolina (IC50 = 1,7 ± 0,2 µM). O verbascosídeo foi o derivado do ácido cafeico com maior potencial de inibição da arginase (IC50 = 0,5 ± 0,2 µM). As estruturas desses compostos podem servir como referência no desenvolvimento de novas drogas para o controle da leishmaniose, que tenham como alvo a arginase. / Caused by protozoa of the genus Leishmania, leishmaniosis is an infectious disease that affects millions of people on all continents. The currently available drugs are highly toxic, expensive, have side effects and parasitic resistance and for these reasons there is a need of developing new drugs to more effective treatment of the disease. The research of new therapeutic alternatives, new biochemical targets, in particular the arginase of Leishmania (Leishmania) amazonensis is considered an interesting target in the search for new compounds leishmanicidal. The biochemistry of arginase pathway is essential for the survival of the parasite, is also responsible for hydrolysis of L- arginine to L- ornithine in mammals. Many compounds from natural products has been reported as inhibitors of arginase L. (L.) amazonensis, and the presence of hydroxyl groups in their structures shown to be important for inhibitory activity of the enzyme. This work studies the biochemical interaction between the arginase enzyme, plant extracts, flavonoids and derivatives of caffeic acid. The acetone extract of Qualea grandiflora leaves showed higher inhibitory capacity of arginase (IC50 = 1.7 ± 01 µg/mL) from the analyzed extracts. Among the flavonoids, the most potent compound was taxifolin (IC50 = 1.7 ± 0.2 µM). The verbascosideo was the derivative of caffeic acid with greater potential for arginase inhibition (IC50 = 0.5 ± 0.2 µM) The structures of these compounds can serve as a reference in developing new drugs for the control of leishmaniosis, which target arginase.

La prévalence de la maladie asthmatique est en constante augmentation à travers le monde. Au cours de la vie dun asthmatique, la fonction pulmonaire diminue plus fortement comparativement aux sujets normaux. Ceci est lié à linflammation et au remodelage des voies aériennes. Les caractéristiques principales du remodelage bronchique consistent en des dommages épithéliaux, une hyperplasie des cellules musculaires lisses, une hyperplasie glandulaire, et une fibrose sous-épithéliale incluant un dépôt de collagène dans la lamina reticularis de lépithélium bronchique. Les traitements actuels de lasthme ne sont pas efficaces dans le contrôle du remodelage bronchique et ne permettent pas de contrôler efficacement la maladie dun point de vue clinique. Pour cette raison, le développement de nouveaux agents thérapeutiques semble nécessaire afin de permettre un contrôle de linflammation aigue, de lhyperréactivité et du remodelage bronchiques. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps, mis au point un modèle murin permettant létude de la réponse inflammatoire aigue mais également du remodelage bronchique. Grâce au développement de ce modèle murin, nous avons pu détecter par analyse transcriptomique de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour la maladie asthmatique telles que lAgr2, le Cd209e, le Col6 et le C1qa. Dautres gènes préalablement décrits comme surexprimés dans lasthme ont également été étudiés afin de valider notre modèle (MMP-12, Fcgr2b, Ccl8, chi3l3 et Arg1). Suite à cela, nous avons décidé dinvestiguer le rôle de la MMP-12 dans la pathologie asthmatique car bien que ce gène soit connu pour être surexprimé dans la maladie, son rôle exact dans la pathologie asthmatique nétait pas encore clair. La MMP-12, également appelée métalloélastase du macrophage, est une pro-enzyme de 54 kDa qui est clivée en deux formes actives de 45 kDa et de 22 kDa. Elle est exprimée principalement par les macrophages alvéolaires mais également par les cellules épithéliales bronchiques, les cellules dendritiques et les cellules musculaires lisses. Le substrat principal de cette enzyme est lélastine qui représente environ 2.5% du poids sec des poumons. En plus de son activité élastolytique, la MMP-12 peut dégrader dautres composants de la matrice extracellulaire comme le collagène de type IV, la fibronectine, la laminine, la vitronectine, les protéoglycans, etc. Elle a également la capacité dactiver la pro-MMP-2 et la pro-MMP-3 qui peuvent à leur tour activer la pro-MMP-9 et la pro-MMP-1. Cette cascade protéolytique explique comment la MMP-12 peut provoquer une dégradation exagérée dune grande variété de composant de la matrice extracellulaire. La MMP-12 est également capable de dégrader dautres substrats non liés à la matrice extracellulaire. Une régulation anormale de lexpression de la MMP-12 est rencontrée dans différentes pathologies telles que les maladies inflammatoires de la peau, lanévrisme de laorte, le cancer et lemphysème pulmonaire. Afin détudier plus avant le rôle de la MMP-12 dans linflammation allergique et dans le remodelage bronchique, nous avons appliqué notre modèle murin à des souris déficientes pour le gène de la MMP-12 ainsi quaux souris wild-type correspondantes. A la fin de chaque protocole expérimental, la résistance bronchique mesurée à laide du système Flexivent est moins importante chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène lorsquon les compare aux souris de type sauvage correspondantes. Les pourcentages déosinophiles présents dans le lavage bronchoalvéolaire des souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène sont significativement moins importants que ceux présents chez les souris de type sauvage correspondantes et ce quelque soit le temps dexposition. Les mêmes différences ont été observées pour le score inflammatoire et pour linfiltration des éosinophiles au sein des parois bronchiques. Le pourcentage de cellules caliciformes présentes dans lépithélium bronchique est significativement moins important chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène durant 1 et 5 semaines comparativement aux souris de type sauvage correspondantes mais plus aucune différence na pu être observée après 10 semaines dexposition. Le nombre de mastocyte est significativement moins important chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène durant 5 et 10 semaines comparativement aux souris sauvages correspondantes. Aucune différence na pu être observée après 1 semaine dexposition. Enfin, lépaisseur de la couche de muscle lisse est significativement moins importante chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lovalbumine durant 5 et 10 semaines comparativement aux souris de type sauvage correspondantes. Suite à ces résultats, nous avons montré que le MMP-12 était une cible thérapeutique potentielle pour lasthme. Nous avons également montré que les principales modifications dues au déficit de ce gène survenaient dès la première semaine dexposition. Nous avons donc décidé de tester les effets de linstillation dun siRNA ciblant la MMP-12 dans notre modèle murin dinflammation aigue. Un western blot et une PCR spécifiques de la MMP-12 ont été réalisés afin de sassurer que le siRNA permettait bien de diminuer lexpression de ce gène. Linstillation de siRNA ciblant la MMP-12 entraine bien une diminution de lexpression de ce gène tant au niveau de lARNm quau niveau protéique. Le pourcentage déosinophiles présents dans le lavage bronchoalvéolaire des souris exposées à lallergène ayant été instillées avec le siRNA ciblant la MMP-12 est significativement diminué par rapport à celui des souris exposées à lallergène ayant été instillées avec du PBS ou avec un siRNA scramble. De plus, cette diminution dépend de la dose de siRNA utilisée. Les mêmes observations ont pu être réalisées en ce qui concerne linfiltration des éosinophiles au sein des parois bronchiques ainsi que pour le pourcentage de cellules à mucus présentes dans lépithélium bronchique. Linstillation du siRNA chez les souris exposées à lallergène entraine une diminution du score inflammatoire par rapport aux souris ayant été instillées avec du PBS ou avec le siRNA scramble mais cette diminution semble moins dépendre de la dose de siRNA utilisé. Les niveaux dexpression de CCL-11 et de lIL-13 mesurés par ELISA sont diminués suite au traitement avec le siRNA ciblant lARNm de la MMP-12 comparativement aux souris contrôles. De même, les niveaux dexpression du TNF-α et de larginase I mesurés par western blot sont diminués après linstillation du siRNA ciblant la MMP-12. Au terme de ce travail, nous pouvons donc conclure que le MMP-12 joue un rôle important dans la pathologie asthmatique et que ladministration de siRNA ciblant ce gène permet de diminuer linflammation à éosinophiles ainsi que lhyperplasie des cellules à mucus. Ceci permet de penser que la MMP-12 est une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour le traitement de lasthme.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-07T17:54:24Z No. of bitstreams: 1 Romulo Carvalho Santiago A relação arginase-óxido nítrico na infecção experimental...pdf: 2942021 bytes, checksum: 81ffaf4770b56567bb2217f9add6a63b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-07T17:54:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Romulo Carvalho Santiago A relação arginase-óxido nítrico na infecção experimental...pdf: 2942021 bytes, checksum: 81ffaf4770b56567bb2217f9add6a63b (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A arginase é uma importante enzima envolvida no processo de desintoxicação, eliminando amônia via ciclo da ureia, hidrolisando a L-arginina à L-ornitina e ureia. L-ornitina pode ser metabolizada pela ornitina descarboxilase (ODC), dando origem a poliaminas, que são importantes para divisão e proliferação celular. A L. major usa esta via metabólica para proliferar dentro do macrófago durante a infecção. Por outro lado, a óxido nítrico sintase (NOS) oxida a L-arginina à citrulina e óxido nítrico, participando, desta forma, da eliminação do parasita. Estas enzimas podem ser moduladas na presença de citocinas. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre arginase e óxido nítrico durante a infecção experimental causada por L. braziliensis. No modelo cutâneo de infecção por L. braziliensis, camundongos BALB/c desenvolvem uma lesão que cura espontaneamente na décima semana após infecção. Os parasitas, no entanto, persistem no linfonodo de drenagem (LNd) até 6 meses após a infecção. Camundongos BALB/c foram infectados com L. braziliensis, na derme da orelha, e o desenvolvimento da lesão, a carga parasitária, a atividade da arginase e a produção de óxido nítrico (NO) foram avaliados, assim como a produção de citocinas. A atividade da arginase na orelha aumenta com o desenvolvimento da lesão e diminui com a cura da mesma. No LNd, a atividade da arginase foi detectada junto com a persistência do parasita. A presença de NO na orelha foi maior no pico de desenvolvimento da lesão, acompanhando a presença de IFN-g, no LNd. Com a cura da clínica, houve redução dos níveis de NO na orelha, acompanhado de aumento na produção de TGF-b no LNd. A inibição da arginase, utilizando Nor-NOHA, reduziu significativamente o tamanho da lesão e a carga parasitária na orelha e no LNd. Curiosamente, este efeito foi associado a uma maior produção de IL-4 e IL-10. Por outro lado, a suplementação com L-arginina, o substrato comum para as enzimas iNOS e arginase exacerbou o tamanho da lesão e elevou a carga parasitária. Nossos dados sugerem que a arginase está envolvida com a multiplicação de L. braziliensis, causando a lesão na orelha e, posteriormente, está envolvida com a persistência do parasita no LNd. / Arginase is an important enzyme involved in the detoxification process, eliminating ammonia via the urea cycle, hydrolyzing L-arginine to L-ornithine and urea. L-ornithine can be metabolized by ornithine decarboxylase (ODC) to give polyamines, which are important for cellular division and proliferation. It has been demonstrated that L. major uses this pathway to proliferate within macrophages during infection. On the other hand, nitric oxide synthase (iNOS) oxidizes L-arginine to citrulline and nitric oxide, participating in the elimination of parasites. These enzymes can be modulated in presence of cytokines. The aim of this work was to study the relationship between arginase and nitric oxide during the experimental infection caused by L. braziliensis. In the cutaneous model of infection with L. braziliensis, there is a development of a lesion that heals spontaneously in the second month of infection. The parasites, however, persist in draining lymph nodes (dLN) until 6 months after infection. BALB/c mice were infected with L. braziliensis in the ear dermis and the lesion development, parasite load, arginase activity and the nitric oxide (NO) production were evaluated, as well as cytokine production. Arginase activity in the ear increased with lesion development and decreased at the time of lesion healing. In dLNs, arginase activity was detected in parallel to the persisting parasites. The presence of NO in the ear was higher at the peak of lesion development, accompanying the presence of IFN-g in dLNs. With clinical cure, decreased NO levels were detected in the ear parallaled by an increase in the production of TGF-b in the dLNs. The competitive inhibition of arginase, using Nor-NOHA, significantly reduced lesion size and parasite load in the ear and in dLNs. Interestingly, this effect was associated with increased production of IL-4 and IL-10. Furthermore, supplementation with L-arginine, the common substrate for both enzymes, iNOS and arginase, exacerbated lesion size and the parasite load. Our data suggest that arginase is involved with the multiplication of L. braziliensis, causing injury in the ear and it is involved with the persistence of the parasite in the dLN.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-09-04T18:17:28Z No. of bitstreams: 1 Wendell Vilas Boas Santos Metabolismo da arginina e moléculas....pdf: 3424976 bytes, checksum: 754d4fef738c69d02fff1ba7595f9dfc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-04T18:17:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wendell Vilas Boas Santos Metabolismo da arginina e moléculas....pdf: 3424976 bytes, checksum: 754d4fef738c69d02fff1ba7595f9dfc (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A anemia falciforme (AF) é uma doença genética com prevalência mundial elevada, sendo considerada uma doença multisistêmica, uma vez que é caracterizada por manifestações clínicas agudas e crônicas e pelo comprometimento progressivo de órgãos e sistemas. A AF é caracterizada por uma disfunção endotelial acentuada que pode ser decorrente de vários fatores. Os distúrbios no metabolismo da arginina estão relacionados ao estado inflamatório crônico apresentado pelos pacientes com AF e a homocysteína (Hcy) pode também estar relacionada, cujo aumento plasmático está associado a ativação endotelial e o estado inflamatório em diferentes patologias. Estão inclusos nesta tese o conjunto de três manuscritos com o objetivo de investigar moléculas associadas à ativação endotelial em pacientes com AF, com ênfase para as moléculas envolvidas no metabolismo do óxido nítrico (NO), como a arginase; Hcy, citocinas Th17, moléculas de adesão solúveis (sVCAM-1 e sICAM-1) e marcadores hemolíticos. Foram estudados indivíduos com AF em estado estávelNossos resultados mostraram que a arginase plasmática e a citocina IL-17 estão elevada em pacientes com AF. Além disso, a citocina TGF-beta está positivamente associada a arginase nos mesmos pacientes. A Hcy foi associada com a ativação endotelial, uma vez que a Hcy esteve correlacionada positivamente com sVCAM e as citocinas IL-17 e TGF-beta. Os níveis diminuídos da citocina IL-18 foram relacionados a ocorrência de seqüestro esplênico. O papel de novos marcadores de inflamação vascular pode ajudar no entendimento da complexidade da fisiopatologia da AF, principalmente o relacionado ao metabolismo da arginina e NO, moléculas cruciais na manutenção vascular. Nossos dados mostram alvos importantes, como a arginase, Hcy e a IL17, que podem ser explorados como fatores adicionais na inflamação, ativação endotelial e vaso-oclusão na AF. / Sickle-cell disease is one of the most common severe monogenic disorders worldwide. It is consider a multisystem disease, associated with episodes of acute illness and progressive organ damage. Sickle Cell Anemia (SCA) is characterized by a marked endothelial dysfunction, owing to many factors. Dysregulated arginine metabolism can be related to the inflammatory chronic state presented by patients and homocysteine (Hcy) can be also related to inflammatory state, once its increase serum levels can enhance the endothelial activation and inflammation state in several pathologies. It was included in this thesis a set of three manuscripts that aim to investigate molecules implicated in the endothelial activation in SCA patients, emphasizing molecules involved on Nitric Oxide (NO) metabolism, such as arginase, Hcy, Th17, cytokines, soluble adhesion molecules (sVCAM-1 e sICAM-1) and hemolytic markers. We studied sickle cell anemia patients in stead state. Our results showed a rising arginase levels and IL-17 cytokine in the SCA patients. Moreover, the cytokine TGF-beta is associated with higher arginase levels in the same sickle cell patients. The Hcy was related to endothelial activation, since the Hcy was positively associated with sVCAM, IL-17 and TGF-beta. Patients who had a splenic sequestration event had low IL-18 levels. The role of novel inflammation markers can help to understand the complexity of pathofisiology in the SCA, mainly related to arginine and NO metabolism that is essential to vascular maintenance. Our data show important targets, such as arginase, Hcy and IL-17, that can be explored as an additional risk factor to endothelial inflammation and activation and vaso-occlusion in SCD.

Causada por protozoários do gênero Leishmania, a leishmaniose é uma doença infecciosa que afeta milhões de pessoas em todos os continentes. São grandes os desafios no tratamento da leishmaniose porque os fármacos atualmente disponíveis apresentam alta toxicidade, efeitos colaterais, alto custo e resistência parasitária. Sendo assim, faz-se necessário o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da doença de maneira mais eficiente. A investigação de novas alternativas terapêuticas, novos alvos bioquímicos, em particular a arginase em de Leishmania (L) amazonensis, é considerada um alvo interessante na busca de novos compostos leishmanicidas. A via bioquímica em que está envolvida a arginase é fundamental para a manutenção do ciclo de vida do parasito, sendo responsável pela hidrólise de L-arginina em L-ornitina em mamíferos. Muitos compostos oriundos de produtos naturais tem sido relatados como inibidores da arginase de L. (L.) amazonensis e a presença de grupos hidroxila em suas estruturas mostraram ser importantes na atividade inibidora da enzima. O objetivo desse trabaho estudar a interação bioquímica entre a enzima arginase de L. (L.) amazonensis, extratos vegetais, flavonoides e derivados do ácido cafeico. O extrato acetônico de folhas de Qualea grandiflora apresentou maior capacidade inibitória da arginase (IC50 = 1,7 ± 01 µg/mL) dentre os extratos analisados. Dentre os flavonoides, o composto mais potente foi a taxifolina (IC50 = 1,7 ± 0,2 µM). O verbascosídeo foi o derivado do ácido cafeico com maior potencial de inibição da arginase (IC50 = 0,5 ± 0,2 µM). As estruturas desses compostos podem servir como referência no desenvolvimento de novas drogas para o controle da leishmaniose, que tenham como alvo a arginase. / Caused by protozoa of the genus Leishmania, leishmaniosis is an infectious disease that affects millions of people on all continents. The currently available drugs are highly toxic, expensive, have side effects and parasitic resistance and for these reasons there is a need of developing new drugs to more effective treatment of the disease. The research of new therapeutic alternatives, new biochemical targets, in particular the arginase of Leishmania (Leishmania) amazonensis is considered an interesting target in the search for new compounds leishmanicidal. The biochemistry of arginase pathway is essential for the survival of the parasite, is also responsible for hydrolysis of L- arginine to L- ornithine in mammals. Many compounds from natural products has been reported as inhibitors of arginase L. (L.) amazonensis, and the presence of hydroxyl groups in their structures shown to be important for inhibitory activity of the enzyme. This work studies the biochemical interaction between the arginase enzyme, plant extracts, flavonoids and derivatives of caffeic acid. The acetone extract of Qualea grandiflora leaves showed higher inhibitory capacity of arginase (IC50 = 1.7 ± 01 µg/mL) from the analyzed extracts. Among the flavonoids, the most potent compound was taxifolin (IC50 = 1.7 ± 0.2 µM). The verbascosideo was the derivative of caffeic acid with greater potential for arginase inhibition (IC50 = 0.5 ± 0.2 µM) The structures of these compounds can serve as a reference in developing new drugs for the control of leishmaniosis, which target arginase.

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:54:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cecilio_CarlaAparecida_D.pdf: 7009820 bytes, checksum: 20e3b071e5deb361ebcb1af96dff15a6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Porque as alterações dependentes de idade no sistema imune inato são pouco estudadas, no presente trabalho comparamos macrófagos de camundongos BALB/c jovens (8 semanas de idade) e velhos (72 semanas de idade) quanto às atividade de iNOS e de arginase, bem como a produção de citocinas. Avaliações iniciais realizadas em macrófagos peritoneais (M?P) naïve ou elicitados de camundongos BALB/c jovens mostraram níveis detectáveis de atividade arginase mesmo na ausência de estímulos indutores. Apenas IL-4 induziu aumento da atividade arginase nessas células, enquanto LPS e induziram atividade iNOS. O LPS inibiu a atividade de arginase induzida por IL-4 em e em macrófagos derivados de medula óssea (M?MO). A IL-4 inibiu a produção de NO em M?P naïve e em M?MO, mas não teve efeito em M?P elicitados. A fagocitose de zimosan ou de linfócitos apoptóticos, mas não de Leishmania major, resultou em aumento da atividade arginase em macrófagos elicitados e apenas a fagocitose de zimosan induziu aumento da atividade arginase nos macrófagos naïve. A fagocitose de quaisquer das partículas testadas resultou em aumento de atividade arginase quando IL4 foi adicionada em dose sub-ótima às culturas de M?P; a adição de dose sub-ótima de IFN-? resultou em aumento de atividade arginase apenas em M?P de BALB/c elicitados que fagocitaram Leishmania major. Comparativamente, M?P de camundongos C57BL/6 mostraram atividade arginase muito mais reduzida que os camundongos BALB/c após a fagocitose de qualquer das partículas testadas. A fagocitose de zimosan ou de linfócitos apoptóticos, mas não de L. major, induziu a atividade arginase em M?P elicitados de C57Bl/6 e a adição de IFN-? elevou de modo significativo a atividade arginase nessas células. Da mesma forma que em BALB/c, os M?P de C57BL/6 não mostraram atividade iNOS após a fagocitose de qualquer das partículas testadas, na presença ou ausência de estímulos inflamatórios. Nossos resultados mostram ainda que o envelhecimento altera algumas das atividades de macrófagos de camundongos BALB/c. Nesse sentido, verificamos que M?P de camundongos jovens apresentaram atividade iNOS e arginase mais elevadas do que M?P de camundongos idosos. M?MO de camundongos jovens ou velhos não diferiram significativamente na atividade iNOS, mas a atividade arginase foi mais elevada nos M?MO de animais velhos. A expressão da arginase induzida por IL-4 foi mais elevada em M?P naïve de animais jovens do que de velhos, mas foi igualmente elevada em M?P elicitados e M?MO de camundongos jovens e velhos. Não se observou diferença na expressão de iNOS induzida por IFN-? em M?P ou M?MO de BALB/c jovens ou velhos. A produção de IL-1? induzida por LPS foi mais elevada em macrófagos elicitados de camundongos velhos e a de TNF-? foi mais elevada nos macrófagos elicitados de camundongos jovens. A estimulação de M?MO com LPS resultou apenas em produção de TNF-?, cujos níveis foram mais elevados nas células de camundongos velhos. Nossos resultados apontam diferenças dependentes da idade em macrófagos teciduais e diferenciados in vitro. Com relação aos macrófagos teciduais, as alterações mais notáveis dependentes da idade foram a redução da produção de TNF-? e da atividade de iNOS. Tendo em vista a importância desses dois mediadores para a eficiente eliminação de patógenos, a sua redução em macrófagos de camundongos velhos pode contribuir para a maior susceptibilidade às infecções na velhice / Abstract: Given that the age-dependent changes in the innate immune system are poorly studied in the present study we investigated the activity of iNOS and arginase, as well as cytokine production in macrophages from BALB/c young (8 weeks old ) and old (72 weeks old). Initial assessments carried out on peritoneal macrophages (PM?) or elicited from naive BALB/c mice showed that these young phagocytes have detectable levels of arginase activity, even in the absence of inducing stimuli. Only IL-4 induced increased arginase activity in these cells, while LPS and IFN-? induced iNOS activity. LPS inhibited the arginase activity induced by IL-4 in PM? and macrophages derived from bone marrow (BMM?). IL-4 inhibited NO production in naïve PM? and BMM? in MO, but had no effect on M?P elicited. Phagocytosis of zymosan or apoptotic lymphocytes, but not from Leishmania major, resulting in increased arginase activity in elicited macrophages and only the phagocytosis of zymosan induced an increase in arginase activity in naïve macrophages. Phagocytosis of any of the tested particles resulted in an increase in arginase activity when IL4 was added to sub-optimal dose to cultures of PM?, the addition of sub-optimal dose of IFN-? resulted in increased arginase activity only in PM? of BALB/c elicited that phagocytized Leishmania major. Comparatively, PM? of C57BL/6 showed arginase activity much lower than the BALB/c after the phagocytosis of any of the tested particles. Phagocytosis of zymosan or apoptotic lymphocytes, but not L. major, induced arginase activity in PM? elicited from C57BL/6 and the addition of IFN-? significantly increased arginase activity in these cells. Just as in BALB/c, PM? C57BL/6 iNOS showed no activity after phagocytosis of any particles tested either in the presence or absence of inflammatory stimuli. Our results also show that aging alters some of the activities of macrophages from BALB/c. Similarly, we found that PM? of young mice showed activities iNOS and arginase higher than PM? of old mice. BMM? of young and old mice did not differ significantly in iNOS activity, but arginase activity was higher in BMM? in older animals. The expression of arginase-induced IL-4 was higher in PM? of naïve young mice, but was also high in M?P elicited AND BMM? of young and old mice. No difference was observed in the expression of iNOS induced by IFN-? in both PM? and BMM? of BALB/c young and old. The production of IL-1 ? induced by LPS was higher in elicited macrophages from aged mice and TNF-? was higher in elicited macrophages from young mice. Stimulation of BMM? with LPS only resulted in production of TNF-?, whose levels were higher in cells of aged mice. Our results suggest age-dependent differences in tissue macrophages and differentiated in vitro. With respect to tissue macrophages, the most notable changes were the age-dependent reduction of and activity of iNOS. Given the importance of these two mediators in the efficient elimination of pathogens, the reduction in macrophages of aged mice may explain the increased susceptibility to infections in old age / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A saliva humana possui diversas enzimas que apresentam atividades específicas e algumas delas podem estar envolvidas no processo inflamatório que acometem os implantes dentários. A arginase é uma enzima hidrolítica que utiliza a L-arginina como substrato para formação da L-ornitina e uréia. Acredita-se que um aumento na produção de arginase possa levar à uma redução na produção de óxido nítrico, consequentemente aumentando a suscetibilidade à infecção bacteriana. Considerando a hipótese de que o número de implantes nos indivíduos e o fumo possam alterar a produção de arginase e que o mesmo é considerado um fator de risco para o sucesso da terapia com implantes, o presente estudo objetivou avaliar o efeito de ambas as variáveis sobre a atividade da arginase salivar (AS) em pacientes portadores de implantes dentários. Amostras de saliva de 102 indivíduos foram coletadas: 26 não-fumantes e sem implantes dentais (A), 28 pacientes com até 4 implantes dentais e não-fumantes (B), 29 pacientes com cinco ou mais implantes dentais e não-fumantes (C), dez fumantes com implantes (D) e nove fumantes sem implantes (E). Os níveis de AS foram expressos em U/mg proteína e determinados por espectrofotometria através da mensuração da L-ornitina e da proteína salivar. Houve um aumento significativo dos níveis de AS no grupo D (64.26) em relação aos grupos A (10.72, p=0), B (10.66, p=0), C (11.21, p=0) e E (13.66, p=0). Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos A, B, C e E (p>0,05). Dentro dos limites do presente estudo, pode-se concluir que a atividade da arginase salivar encontra-se elevada em indivíduos fumantes portadores de implante dentário, sugerindo um possível mecanismo pelo qual o fumo pode levar ao insucesso desta terapia reabilitadora. / Human saliva possesses many enzymes with activity and some of them might be involved in the inflammatory process of dental implants. Arginase is a hydrolytic enzyme that catalyses L- arginine into ornithine and urea. Its known that a high production of arginase can decreased the production of nitric oxide, consequently leading to bacterial infection susceptibility. To regard the hypothesis of number of implants and smoking might change the production of arginase and considering that smoking is a risk factor of implant therapy, the aim of this study was to evaluate the effect of both on the activity of arginase in saliva of subjects with dental implants. Saliva of 102 subjects were collected: 26 non-smoking and without dental implants (A), 28 with 4 dental implants or less and non-smoking (B), 29 with five dental implants or more and non-smoking (C), ten smokers with implants (D) and nine smokers and without dental implants (E). The arginase levels were expressed in U/mg and analyzed by spectophotometry and it was determined by measuring the Lornitine formation from L-arginine. The result showed that the mean values of arginase in group D (64.26) were statistically different among groups A (10.72, p=0), B (10.66, p=0), C (11.21, p=0) e D (13.66, p=0). There was no statistically difference among groups A, B, C and E (p>0,05). By the limits of the present study, it can be concluded that arginase activity shown higher in subjects smokers with dental implants, suggesting a possible mechanism that smoke may lead to unsuccess of this rehabilitation therapy.