Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juillet 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1997. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Memoria para optar el título de Bioquímico / Las neuronas de la corteza cerebral se generan a partir de los progenitores ubicados en la pared dorsal de las vesículas telencefálicas. Este proceso implica la salida del ciclo proliferativo de los progenitores, un cambio en el patrón de expresión génica y la migración radial desde los centros neurogénicos (zona ventrícular-subventricular), hacia la posición final de las neuronas en la placa cortical. Se han definido muchos factores transcripcionales que son responsables de mantener la pluripotencialidad de los progenitores, y otros que comienzan a expresarse cuando la célula adquiere el destino neural. Se ha visto que además de los reguladores de la transcripción hay otros mecanismos importantes que controlan el desarrollo cortical y que recientemente se están estudiando. Entre ellos se encuentra el posible papel de los microRNAs en el desarrollo cortical. Los microRNA (miRNA o miR-s) son pequeñas hebras simples de RNA (21-23 nucleótidos) que regulan post-transcripcionalmente la expresión de ciertos RNA mensajeros por complementariedad de bases. Se ha demostrado que un mismo miRNA es capaz de controlar a cientos de mRNA en un contexto altamente definido temporal y espacialmente. El miR-124a es el más abundante en tejido neural de roedores y que su expresión comienza en E12.5, es decir, junto con el comienzo de la neurogénesis en la corteza. Se han descrito varios mRNAs que son controlados por el miR-124a tanto en progenitores como en neuronas, pero su papel en la neurogénesis aún no se ha caracterizado. La presente memoria explora el papel del miR-124a en el desarrollo de la morfología y en la generación de neuronas piramidales corticales. Se realizaron experimentos de pérdida y ganancia de función tanto en neuronas corticales in vitro, como en la corteza en desarrollo mediante electroporación in utero. La pérdida de función del miR-124a generó una rápida disminución de las dendritas primarias, que se recuperó a los 5 días in vitro (DIV). La sobre-expresión del miR-124a generó un aumento rápido (a los 3 DIV) del largo de las dendritas y de la complejidad del árbol dendrítico, pero este efecto se perdió a los 5 DIV. A la inversa, el largo axonal aumentó cuando se elevaron los niveles del miR-124a, a los 5 DIV pero no a tiempos más cortos. La manipulación de los niveles del miR-124a en la corteza en desarrollo, en tanto, no mostró alteración de la dinámica de migración radial en la corteza, ni de la proporción de progenitores basales, ni de la morfología de las neuronas que alcanzan la placa cortical. Este trabajo indica que el miR-124a contribuye a la elongación de dendritas y axones de neuronas en cultivo, mientras que en la corteza in vivo, el miR-124a parece ser una consecuencia propia del sistema y la variación de sus niveles no afecta ninguno de los procesos que determinan la generación de la corteza cerebral

Doctor en Bioquímica / El alcoholismo es una enfermedad multifactorial que genera una serie de trastornos personales, sociales y de salud pública. Según estimaciones del Ministerio de Salud de Chile el abuso en el consumo de alcohol y el alcoholismo causa pérdidas al país por US$3.000 millones anuales. Luego de la oxidación hepática del etanol, el acetaldehído generado es metabolizado a acetato por la deshidrogenasa aldehídica 2 (ALDH2*1). En la población Asiática existen individuos que poseen una variante de la ALDH2 con baja actividad (ALDH2*2) los que experimentan un marcado aumento del acetaldehído sanguíneo después de una ingesta alcohólica. Este incremento del acetaldehído causa diversos efectos tales como el enrojecimiento facial, palpitaciones, hipotensión, cefaleas y náuseas (conocido como “fenotipo asiático”) los que producen un rechazo al consumo del alcohol. Los heterocigotos (ALDH2*1/ALDH2*2) beben moderadamente, mientras que los homocigotos (ALDH2*2/ALDH2*2) son abstemios. El tratamiento farmacológico del alcoholismo se basa en el uso de diversos medicamentos como la naltrexona y el acamprosato que actúan en el sistema nervioso central bloqueando los receptores de endorfinas y NMDA, inhibiendo la sensación de placer asociada al alcohol o disminuyendo los síntomas de la abstinencia alcohólica. Otro fármaco utilizado es el disulfiram, un modificador químico de grupos sulfhidrilos, que inhibe la ALDH2 produciendo un aumento en el nivel de acetaldehído cuando el paciente bebe alcohol, emulando el fenotipo asiático. Estos fármacos requieren administración diaria lo que a causa de la baja adhesión a los tratamientos farmacológicos, reduce su eficacia terapéutica. Un nuevo fármaco de efecto prolongado, que emule el fenotipo asiático sin los efectos secundarios del disulfiram, sería de gran ayuda en el campo del alcoholismo. En esta tesis se evaluó la utilidad de dos algoritmos para diseñar racionalmente siRNAs eficientes que disminuyan la actividad de la ALDH2, mediante la degradación selectiva de su mensajero. El objetivo final fue generar un siRNA como herramienta genética en el campo del alcoholismo o como posible fármaco para su tratamiento. Se diseñaron y estudiaron tres RNAs interferentes dirigidos a distintos sitios del RNA mensajero de la ALDH2 de rata. Dos de ellos disminuyen en 60-70% la actividad de la ALDH2 en células humanas HEK-293 que expresan el gen de la enzima de rata. Empleando la secuencia del RNA interferente más prometedor (siRNA2) se diseñaron y probaron tres genes que, estando bajo el control del promotor del RNA U6 humano, dan origen a horquillas de RNA (shRNA a, b y c) precursoras del siRNA2. El shRNAc, codificado en un plásmido, disminuyó en 50% la actividad de la ALDH2 en células HEK-293. La reducción de actividad concuerda con el 60% de disminución de su mensajero. Esta disminución es específica, puesto que el mensajero de la β-actina y el de IFITM-1 se mantuvieron constantes. La transducción de células de hepatoma de rata H4-II-E-C3 con un vector adenoviral de 1ra generación que codifica la misma horquilla (AdV-shRNAc) disminuyó en 10-15% la actividad de la ALDH2 endógena. La pérdida de eficiencia probablemente se debe a la inhibición de exportina 5 y Dicer, por acción del RNA VAI codificado en los adenovirus. Finalmente, los algoritmos permitieron diseñar siRNAs que reducen la actividad de la ALDH2 por sobre el 50%. La transfección de células humanas (HEK-293) con dos de los tres siRNAs sintetizados químicamente o con un plásmido que codifica un shRNA, redujeron significativamente la actividad de la ALDH2 en células humanas, estableciendo que la interferencia por RNA es una estrategia de silenciamiento génico de utilidad para disminuir la actividad de la ALDH2.

Pour s’adaptater à l’environnement et répondre aux besoins énergétiques, tous les organismes doivent pouvoir contrôler l’expression de certains gènes. La trancription constitue le premier échelon de cette régulation en déterminant le niveau d’ARNm produit au cours du temps. Chez les procaryotes, une seule ARNp est responsable de la synthèse de l’ensemble des ARN de la cellule et celle-ci est soumise à différents types de régulation. Ce contrôle peut s’effectuer à tous les niveaux par des processus faisant intervenir bon nombre de facteurs externes ou intrinsèques à la transcription comme les pauses de l’ARNp. Les riborégulateurs sont des ARN structurés majoritairement retrouvés dans la région 5’ non traduite des ARNm bactériens qui vont réguler l’expression du gène situé en aval. Suite à la liaison d’un métabolite particulier, appelé ligand, le riborégulateur change de conformation induisant une réponse directe qui déterminera si un gène est exprimé ou non. Au cours de mes travaux j’ai établi le lien qu’il existait entre les pauses de l’ARNp au cours de la transcription et la structure des riborégulateurs. En prenant pour modèles deux riborégulateurs liant le TPP, j’ai identifié une conformation des riborégulateurs qui est réfractaire à la liaison du ligand. Cette structure appelée «Anti-P1» se forme lorsque l’ARNp pause à la fin du riborégulateur, ce qui détermine une fenêtre de liaison cotranscriptionnelle du ligand.

Staphylococcus aureus, pathogène opportuniste de l’Homme, est un réel problème de santé publique du fait de l’émergence de souches virulentes résistantes à différentes classes d’antibiotiques. La compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans sa virulence est indispensable pour la mise au point de nouveaux agents anti-infectieux. Il est apparu récemment que certains ARN régulateurs (ARNrég) de S. aureus sont impliqués dans l’expression de facteurs de virulence. Mon projet de thèse a porté sur l’étude d’un ARNrég de fonction inconnue, SprB. Des expériences préliminaires à ce travail ont montré une variation du niveau d’expression de la protéine SasG en absence de l’ARN SprB. Dans une première partie de ce travail, j’ai cherché à confirmer expérimentalement le lien entre l’ARN SprB et la protéine SasG. Les niveaux d’expression de la protéine SasG ont été observés dans différents contextes génétiques mutants pour SprB et/ou différents facteurs de régulation de S. aureus. L’ensemble des résultats obtenus suggère le rôle indirect de SprB sur l’expression de SasG. SprB semble impliqué dans un réseau global de régulations qui gouverne l’expression de la protéine SasG. La deuxième partie de cette étude qui porte sur l’identification des cibles directes de SprB a été appréhendée à l’aide d’outils prédictifs. Parmi les cibles potentielles révélées par ce criblage in silico, notre intérêt s’est porté sur la sous-unité Opp4F du transporteur ABC Opp4. J’ai montré que l’ARN SprB empêche, in vitro, la fixation du ribosome sur l’ARN Opp4F et diminuerait potentiellement la synthèse de la sous unité Opp4F. Cela pourrait avoir un impact dans la régulation du métabolisme énergétique de S. aureus. L’ensemble de ces résultats suggère une implication de l’ARN SprB dans plusieurs processus physiologiques de S. aureus aussi cruciaux que la régulation de l’expression de gènes de virulence et le métabolisme énergétique de la bactérie. / Staphylococcus aureus is a major human opportunist pathogen causing a wide spectrum of nosocomial and community-associated infections. The emergence of strains resistant to most currently available antibiotics presents a serious public health threat. Therefore, there is an urgent need for new treatment. The development of such arsenal requires the elucidation of the molecular mechanisms involved in bacterial virulence. sRNA, represent a new and promising field of investigation, because of its implication in main cellular processes such as virulence factor regulation. My PhD thesis focused on the study of SprB : a small regulatory RNA (sRNA) of unknown function. Preliminary results have shown that the absence of SprB leads to differences in the of SasG protein level. First, I investigate the link between SprB RNA and SasG protein. Therefore, SasG protein levels have been studied in several genetic backgrounds, parental or mutant for SprB and/or global regulation factors. Taken together, our findings suggest an indirect effect of SprB on SasG regulation. In addition, SprB seems to be implicated in global bacterial regulation network which governs SasG protein expression. In the second part of my thesis, we tried to identify direct targets of SprB through in silico screening. Among a list of the potential targets revealed, we focused on Opp4F, sub-unit of the ABC transporter Opp4. We demonstrated, in vitro, that SprB RNA is able to inhibit the binding of the ribosome on Opp4F mRNA, potentially decreasing the synthesis of Opp4F sub-unit. Therefore, Opp4F is not or less produced which could have serious impact on the regulation of energetic metabolism. Altogether, the results obtained highlighted the potential role of SprB in several crucial physiological processes such as regulation of energetic metabolism and regulation of bacterial virulence.

Au sein des cellules, les voies enzymatiques sont souvent organisées spatialement sous forme de complexes, sur des structures protéiques ou dans des micro-compartiments. Cette organisation spatiale aide au déroulement optimal des réactions enzymatiques en limitant les pertes d’intermédiaires métaboliques, en isolant les voies de signalisations et en augmentant le rendement des réactions enzymatiques. Dans ce travail de thèse nous avons étudié la possibilité de créer des outils permettant de contrôler et optimiser de novo l’organisation spatiale de voies métaboliques in vivo.Nous avons dessiné et assemblé des structures d’ARN non codants utilisées comme support pour organiser le métabolisme bactérien. Ces ARN s’assemblent spontanément in vivo en des structures à une ou deux dimensions avec des sites distincts d’attachement protéique. Nous démontrons l’utilité de cette approche via l’optimisation d’une voie enzymatique de synthèse de biohydrogène et démocratisons l’utilisation de ces structures d’ARN en développant un protocole simplifié. Nous étendons cette étude à d’autres stratégies d’organisation, notamment via l’ingénierie des cellules spécialisées dans la fixation de l’azote atmosphérique de la cyanobactérie Anabaena PCC7120, les hétérocystes. Ce travail de thèse ouvre de nouvelles portes à la biologie de synthèse à la biologie structurale et aux nanotechnologies / In cells bio-enzymatic pathways are often spatially organized into complexes, into organelles or onto protein scaffolds. Spatial organization limits diffusion and helps channels substrates between enzymatic cores, limiting competing reactions, insulating and increasing yields of sequential metabolic reactions. In this PhD thesis work, we engineered new tools to control the precise spatial organization of enzymes and increase the titer of specific pathways. We design and engineer “artificial organelles” made of assembling RNA nanostructures. These scaffolds are made out of assembling non-coding RNA molecules we specifically design to polymerize into multi-dimensional nanostructures inside bacterial cells. These structures have docking sites to target enzymes onto them and control their respective distance and stochiometry. We demonstrate the validity of our approach by optimizing and improving the production of biohydrogen and designing a protocol to simplify and standardize the use of RNA scaffold. Moreover, we develop a new synthetic biology “chassis” by developing strategies to engineer AnabaenaPCC7120 and control the spatial localization of metabolic pathway at the cellular level. By targeting specific enzymes into oxygen-depleting heterocysts, metabolic engineers can now implement oxygen-sensitive pathways into oxygen evolving cyanobacteria. This PhD work opens the door to an array of new applications spanning synthetic biology, structural biology to nanotechnology

La respuesta estricta (RE) es una respuesta celular conservada frente al estrés ambiental. En la RE, se produce ppGpp y se genera la reducción de los RNA estables (rRNA y tRNA). Estudios in vitro muestran que el ppGpp reduce de la velocidad de transcripción de la RNA polimerasa (RNAP) en los complejos de elongación (CTE) de Escherichia coli. Sin embargo, hasta la fecha, no se conoce el mecanismo básico de su accionar. Los estudios de moléculas individuales muestran que la RNAP polimeriza un RNA (estados dentro de la vía de actividad u on-pathway) interrumpido por pausas (estados fuera de la vía u off-pathway). En el presente estudio se evaluó el efecto del ppGpp en la elongación de los CTE por la microscopía de pinzas ópticas, en tiempo real y a nivel individual. Se observó que el ppGpp duplica la velocidad libre de pausas (11 a 20 nt/s) y mantiene la naturaleza difusiva de las pausas (off-pathway). Además, se deduce una ecuación para calcular la energía media de activación en pausas (ε) y se presenta un esquema general (unificación de una cadena Markov y la cinética de Cleland) para el análisis cinético de cualquier reacción enzimática. Gracias a esto se observó que el ppGpp triplica el factor pre-exponencial de la difusión de la RNAP sobre el DNA (24 a 67 s-1); mantiene el número de estados del on-pathway, el valor de la constante de catálisis (k_cat≈17 s-1) y la energía de activación en pausas (ε ≈ 4 KBT). Este estudio nos muestra el mecanismo básico de acción del ppGpp en la transcripción: aumento de la tasa de difusión de la RNAP sobre el DNA en una dimensión. Ya que la RE es conservada en bacterias, este conocimiento es de gran interés para el entendimiento del mecanismo de virulencia y resistencia de patógenos como Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, entre otros. / Tesis

L'interférence à l'ARN est un phénomène impliqué dans plusieurs processus biologiques, notamment dans l'intégrité génomique et le développement, qui est conservé dans l'évolution. Ce phénomène est induit par la présence d'un long ARNdb qui mène à la production de siARN (short-interfering ARN) d'environ 22 nucléotides de long qui sont parfaitement complémentaires à un ARNm cible. Ces siARN servent de guide aux protéines Argonautes qui utilisent leur activité catalytique pour cliver l'ARNm et ainsi diminuer son expression. Chez plusieurs organismes, notamment Caenorhabditis elegans, l'exposition à de l'ARN double-brin exogène permet la production de siARN. Par la suite, le signal de dégradation de l'ARNm ciblé se transmet de générations en générations sans que ces dernières n'aient été exposées à la molécule initiatrice par un mécanisme peu compris. Différentes études antérieures ont tenté de déterminer quels sont les facteurs physiques qui sont transmis aux générations subséquentes, mais ces études utilisent des transgènes comme cibles, ces derniers ayant été démontrés comme étant réprimés par des mécanismes indépendants de l'interférence à l'ARN induit par de l'ARN double-brin exogène. Le but du projet est donc de développer une méthode qui permet d'étudier ce phénomène dans un contexte endogène et de l'utiliser afin de déterminer quels facteurs moléculaires peuvent être transmis à la descendance selon le type de gamète (mâle ou femelle) et le type de tissu (somatique ou germinal) touché. En utilisant la méthode développée qui utilise comme cible un ARNm endogène qui possède une délétion silencieuse, l'étude a permis de déterminer que l'ARNm cible a besoin d'être présent chez le géniteur pour induire le processus de transmission de l'interférence à l'ARN à la descendance. De plus, l'étude a permis de déterminer qu'une accumulation de siARN double-brin chez le parent peut mener à une transmission à la descendance du signal de dégradation de l'ARNm et que cette transmission ne peut s'effectuer que si le parent hermaphrodite est exposé à la molécule d'ARN double-brin. En bref, cette étude a permis d'améliorer la compréhension de ce mécanisme épigénétique qu'est la transmission entre générations de l'interférence à l'ARN. / RNA interference is a phenomenon implicated in many biological processes, including genomic integrity and development, and it is conserved in evolution. This phenomenon is induced by the presence of double stranded RNA leading to the production of siRNAs (short-interfering RNAs) of about 22 nucleotides long that are perfectly complementary to a target mRNA. Those siRNAs guide Argonaute proteins to the target mRNA and use their catalytic activity to cleave the target and decrease its expression. In many organisms, including Caenorhabditis elegans, production of siRNAs by exposing cells to exogenous dsRNA induce a transmission of RNAi signal between generation without exposing progeny to initiator molecules by a poorly understood mechanism. Different studies have already tried to determine which physical factors can be transmitted to the next generation, but these studies have used transgenes as a mRNA target, who have been shown to be also repressed by a mechanism independent of RNA interference induced by a double-stranded RNA. Therefore the main purpose of the project is to develop a method who can be used to study this phenomenon in an endogenous context and to determine which molecular factors can be transmitted between generations depending on the gamete type (male or female) and the tissue type (somatic or germline tissue) targeted. Using the developed method which uses a mRNA that carries a silenced deletion mutation, the study has determined that the target mRNA must be present in the parent to induce transmission of RNA interference through generations. Also, the data has shown that a double-stranded RNA accumulation can lead to a transmission to the progeny of the mRNA degradation signal, but this transmission can only occur if the hermaphrodite parent is exposed to the double-stranded RNA. In short, this study helped to increase the understanding of this epigenetic mechanism that is the transmission between generations of RNA interference.