ColQ est un collagène spécifique qui ancre l’acétylcholinestérase (AChE) dans la fente synaptique de la jonction neuromusculaire (JNM). L'importance du complexe AChE-ColQ dans la physiologie humaine de cette synapse est soulignée par l’identification de mutations dans le gène codant pour ColQ qui conduisent à un syndrome myasthénique congénital (SMC) associé à une déficience en AChE. Le déficit en AChE a, jusqu’à présent, été considéré comme l’unique facteur responsable des symptômes observés chez les patients ainsi que des défauts de la JMN chez le modèle de souris SMC (souris déficiente pour ColQ). Toutefois, ces symptômes sont complexes et l’absence d’AChE ne peut probablement pas expliquer tous les symptômes. Nous avons montré auparavant que ColQ participait à la formation de la synapse ce qui expliquerait les symptômes observés chez les patients et la souris modèle. En effet, nous avons pu montrer que ColQ contrôle l’agrégation du récepteur à l’acétylcholine (RACh) et de l’expression de gènes spécifiques de la synapse. En particulier, nous avons montré in vitro et in vivo, que l’absence de ColQ induit une augmentation du niveau des ARNm codant pour toutes les sous-unités de RACh et une expression réduite du niveau de leurs protéines. Des résultats préliminaires indiquent que cette augmentation de ces ARNm n’est pas transcriptionnelle. L’objectif de cette thèse est d’expliquer les mécanismes qui induisent l’augmentation du niveau des ARNm de AChR en l’absence de ColQ et les voies de signalisation qui relient ColQ au métabolisme des ARN du RACh. Notre hypothèse de travail a été que l'absence de ColQ stimule la stabilisation post-transcriptionnelle des ARNm codant pour les sous-unités du RACh via la protéine HuR. HuR est une protéine qui stabilise les ARNm quand elle se fixe sur les AU-richelement (ARE) dans la séquence 3’UTR. HuR est une protéine clé dans la myogenèse et la formation de la JNM parce qu’elle stabilise de manière post-transcriptionnelle de nombreux transcrits tels que myogénine, MyoD et AChE. Dans cette étude, nous montrons pour la première fois qu’un mécanisme post-transcriptionnel de stabilisation des ARNm est responsable de l’augmentation du niveau des ARNm du RACh via ColQ. De plus, nous constatons qu’en absence de ColQ, il y a une augmentation aux niveaux d’ARNm et de protéine de HuR. HuR est également capable de se lier au domaine ARE dans le 3’UTR des ARNm des sous-unités de AChR. De plus, l’interaction entre HuR et les ARNm du RACh augmente la stabilité et par conséquence les niveaux des transcrits du RACh. Trois conclusions importantes ressortent de ma thèse : nous démontrons que (1) en plus de la régulation transcriptionnelle, il existe des mécanismes de régulation post-transcriptionnlle du RACh (2) ColQ régule la stabilité des ARNm RACh via HuR médiée par MuSK (3) la voie de signalisation p38 contrôle les niveaux de HuR de manière dépendante de ColQ. Ensemble, ces résultats donnent un aperçu des voies de signalisation du muscle qui sont affectées par les mutations de ColQ conduisant à des SMC avec une déficience en AChE. Nos résultats mettront en évidence des nouvelles cibles moléculaires spécifiques qui peuvent conduire au développement des interventions thérapeutiques dans le cadre de myasthénies congénitales. / ColQ is a specific collagen that anchors acetylcholinesterase (AChE) in the synaptic cleft of the neuromuscular junction (NMJ). The importance of AChE-ColQ complex in the physiology of this synapse has been highlighted by the identification of COLQ mutations in the human gene, leading to a congenital myasthenic syndrome (CMS) with AChE deficiency. The lack of AChE has been incriminated for the symptoms observed in patients along with NMJ defects in the CMS mouse model (ColQ-deficient). However, symptoms observed in the patients and mouse model of CMS with AChE deficiency are complex and AChE deficiency cannot account for all of them. We have demonstrated that ColQ could play a role per se in synapse formation which would explain some of the defects observed in patients and model mice. Indeed, we have shown that ColQ controls the clustering of Acetylcholine Receptors (AChR) and the expression of a number of specific synaptic genes. The most striking effect of the absence of ColQ is an upregulation of all AChR subunit mRNAs correlated by an increase in their protein levels. Preliminary results indicate that AChR mRNA upregulation is not transcriptional. This thesis deciphers the mechanisms that drive AChR mRNA upregulation in the absence of ColQ and the pathways that connect ColQ to the AChR RNA metabolism. Accordingly, we hypothesize that the absence of ColQ induces an upregulation of the stabilization of AChR subunit mRNAs, a post-transcriptional mechanism mediated by HuR. HuR is an RNA binding protein which stabilizes its target transcript by binding AU-rich elements (AREs) in their 3’UTR. HuR is critical during skeletal myogenesis and post-synaptic NMJ formation due to its stabilization of such transcripts as myogenin, MyoD and AChE. In this study, we show for the first time that a post-transcriptional mechanism of AChR mRNA stabilization is responsible for the ColQ mediated increase of AChR mRNAs. In support of these findings, the absence of ColQ also increased HuR mRNA and protein levels. We demonstrate that HuR is capable of binding to conserved ARE elements in the 3’UTR of AChR subunit mRNA. HuR’s interaction with AChR mRNA increased the stability of the transcripts, resulting in an increase in mRNA levels. Three major conclusions emerge from my thesis: we provide evidence that (1) in addition to transcriptional and assembly regulation of AChR, post-transcriptional mechanisms of AChR mRNA exist (2) ColQ regulates HuR mediated AChR stability through MuSK and (3) the p38 signalling pathway controls the levels of HuR in a ColQ dependent manner. Collectively, our data provides insight into the muscle signaling pathways which are affected by ColQ mutations leading to CMS with AChE deficiency. Thus, we have identified specific new molecular targets that may become important for the development of therapeutic interventions for patients with CMS.

Le choc septique reste une pathologie grave, associée à des taux de mortalité et d'infections nosocomiales (IN) secondaires élevés. La prédiction du pronostic est de la plus haute importance pour sélectionner les patients qui pourraient bénéficier de traitements visant à moduler la réponse immunitaire. Le système immunitaire, classiquement active par des agents externes, peut également être activé par des médiateurs endogènes exprimés à la suite d'une agression d'origine septique ou non. Les protéines S100 font partie de ces signaux de danger endogènes (ou alarmines). Le but de ce travail est d'évaluer la capacité de l'ARNm de S100A9 mesuré dans le sang total de patients en choc septique à prédire la survie et la survenue d'IN. Nous avons également étudié la régulation de l'expression des ARN messagers de S100A8 et S100A9 dans un modèle ex vivo de tolérance à l'endotoxine qui reproduit partiellement les dysfonctions de l'immunité innée induites par le sepsis. L'ARNm de S100A9 est surexprimé dans le sang des patients en choc septique. Un taux élevé entre le 7eme et le 10eme jour du début du choc septique est associé à la survenue d'IN secondaires. Ex vivo, l'expression des ARNm de S100A8 et S100A9 est augmentée durant le phénomène de tolérance à l'endotoxine. Le blocage de l IL-10 et l'administration d'IFN-γ réduisent l'augmentation de ces ARNm dans ce modèle. Apres confirmation dans des études cliniques, ces résultats préliminaires suggèrent que l'expression des ARNm de S100A8 et S100A9 puisse être utilisée comme marqueur du phénomène de tolérance à l'endotoxine et comme outils pour évaluer la dysfonction immunitaire des patients en choc septique. Ces patients pourraient alors bénéficier de thérapies visant à restaurer leurs fonctions immunitaires / Septic shock remains a serious disease with high mortality and increased risk of hospital-acquired infection. The prediction of outcome is of the utmost importance for selecting patients for therapeutic strategies aiming to modify the immune response. Immune system, typically activated by external agents, can also be activated by endogenous mediators induced by various types of stress (trauma, infection, burns). S100 proteins are part of the alarmins family. The aim of this study was to assess the capability of S100A9 messenger RNA in whole blood from patients with septic shock to predict survival and the occurrence of hospital-acquired infection. We also investigate the regulation of S100A8 and S100A9 mRNA expressions in an ex vivo model of endotoxin tolerance which partially reproduces sepsis-induced innate immune alterations. S100A9 messenger RNA is increased in septic shock and its delayed overexpression is associated with the occurrence of secondary hospital-acquired infection. Ex vivo, S100A8 and S100A9 mRNA expressions are increased during endotoxin tolerance. IL-10 blockade and rIFN-γ treatment partially abrogated S100A8/A9 mRNA increases in this model. Pending confirmation in larger, independent clinical studies, these preliminary results suggest that S100A8 and S100A9 mRNA levels might be used as surrogate markers of endotoxin tolerance and as evaluation tools for immune dysfunctions in septic shock patients. These patients could be selected for therapeutic aiming to restore immune functions

Les protéines sont responsables de pratiquement toutes les fonctions performées au sein du corps cellulaire et de ses alentours. Le contrôle de l’expression génique détermine l’abondance, la localisation et le moment de la production de protéines dans la cellule. Il s’agit de l’un des processus centraux à la régulation de la physiologie et du fonctionnement cellulaire. La moindre perte de balance dans ce complexe système engendre des conséquences majeures sur l’intégrité cellulaire, menant au développement de plusieurs maladies parfois incurables. La traduction de l’ARN messager en produit protéique constitue la dernière étape de l’expression génique. Elle est régulée de plusieurs façons, intrinsèques et extrinsèques à la séquence. Il s’agit également du processus cellulaire le plus coûteux en termes d’énergie. Le profilage des ribosomes (Ribo-Seq) figure parmi les récentes et prometteuses technologies ayant permis une meilleure étude des mécanismes de régulation de la traduction. Ces résultats contiennent toutefois la présence de variabilité et de bruits de nature infondée. Ce travail présente la mise en place d’une stratégie permettant la dissociation de signaux d’origine biologique de ceux ayant une origine technique. Ceci est effectué au travers de la mise en place de profiles consensus de densité ribosomale extrait d’une analyse comparative de plusieurs expériences de Ribo-Seq chez la levure (Saccharomyces cerevisiae). Les signaux biologiques dérivés par les profils consensus correspondent avec les signatures de pauses ribosomales connues, telles que les scores de repliements de l’ARNm et la charge des acides aminés. Épatamment, notre stratégie a également permis l’identification de séquences différentiellement transcrites (DT). Ces dernières jouent un rôle sur la cinétique de la phase d’élongation de la traduction, elles comportent notamment une surreprésentation de codons associés aux modifications des ARNs de transfert (tRNAs). Elles se retrouvent d’ailleurs impliquées dans le maintien de l’homéostase cellulaire, ayant une présence marquée chez des gènes prenants part aux mécanismes de biosynthèse de la macromolécule ribosomale ainsi que chez les ARNms aux sublocalisations cellulaires précises, notamment chez les mitochondries et le réticulum endoplasmique (ER). En plus de démontrer les possibilités de découvertes offertes par la technique du Ribo-Seq, cette étude présente une évidence de la nature dynamique et hétérogène du processus de traduction chez la cellule eucaryote. Elle démontre également le rôle de l’information directement encodée dans la séquence dans l’optimisation générale de l’homéostasie cellulaire. / Proteins are responsible for virtually all functions performed within and in the surroundings of a cell. The control of gene expression, which determines the amount, localisation and timing of protein production in the cell, is the central processes in the regulation of cellular physiology and function. Any disturbance in this complex system can generate important consequences on cellular integrity, sometimes leading to incurable diseases. The translation of messenger RNA into a protein product is the last step of the gene expression mechanism. It can be regulated in manifold ways, both intrinsically and extrinsically to the transcript sequence. It is also the costliest cellular process in terms of energy. Ribosome profiling (Ribo-Seq) is one of the recent and promising technologies making it possible to better study the mechanisms of translation regulation. Its results have however been shown to display variability in reproducibility and to contain noise of uncharted sources. This work presents the implementation of a strategy for dissociating signals of biological origin from those of technical origin. This is performed by the computation of a consensus profile of ribosomal density derived from a comparative analysis of several Ribo-Seq experiments in yeast (Saccharomyces cerevisiae). The biological signals derived by the consensus profiles correspond with signatures of known ribosomal pauses, such as mRNA folding strength and amino acid charges. Amazingly, our strategy also enabled the identification of differentially transcribed (DT) sequences. The latter have shown an over-representation of codons associated with modifications of transfer RNAs (tRNAs). They are also involved in the control of cellular homeostasis, exhibiting a marked presence in genes involved in ribosome biosynthesis as well as in mRNAs with precise translation sub-localization, particularly in mitochondria and the endoplasmic reticulum (ER). In addition to demonstrating the possibilities of discovery offered by the Ribo-Seq technique, this study also presents evidence of the dynamic and heterogeneous nature of the translation process in the eukaryotic cell. It also showcases its diverse regulatory mechanisms and the role of information directly encoded in the sequence in the general optimization of cellular homeostasis.

Enfermer le porteur de l’information génétique dans le noyau a obligée la cellule a créé un système de transport complexe, qui permet l’export d’un ARNm du noyau au cytoplasme. Le mécanisme général de l’export des ARNm est encore mal connu, même si les facteurs principaux ont été découverts il y a longtemps. De récents progrès en microscopie nous ont permis d’étudier directement le comportement des ARNm durant le processus d’export. Durant ma maitrise, nous avons été capables de localiser et suivre des ARNm en temps réel pour la première fois chez Saccharomyces cerevisiae. Nous avons créé un gène rapporteur en mettant le gène GLT1 sous le contrôle du promoteur GAL1. Nous avons aussi marqué l’ARNm de GLT1 avec plusieurs boucles PP7. L’ARNm sera visible après l’attachement de plusieurs protéines PP7-GFP aux boucles. En utilisant la technique d’imagerie en cellules vivantes, nous sommes capable de visualiser et suivre chaque ARNm, depuis son relâchement du site de transcription jusqu’à l’export. Une fois relâché du site de transcription, l’ARNm diffuse librement dans le nucléoplasme, mais une fois à la périphérie nucléaire, il commence à « scanner » l’enveloppe nucléaire avant d’être exporté. Nous avons trouvé que le « scanning » dépend de la présence des Myosin Like Proteins (Mlp1p et Mlp2p), protéines qui forment le panier nucléaire, car suite à la délétion de MLP1 et MLP2, les ARNm n’étaient plus capable de « scanner ». Nous avons également trouvé que la partie C-terminale de Mlp1p était nécessaire au « scanning ». De plus, suite à la délétion du gène TOM1, gène codant pour une ubiquitine ligase, les ARNm ont un comportement similaire aux ARNm d’une souche ∆mlp1/mlp2, suggérant que le « scanning » permet à Tom1p d’ubiquitiner Yra1p, ce qui causera son relâchement de l’ARNm. Également, nous avons montré que les ARNm endogènes MDN1 et CBL2 scannent aussi la périphérie nucléaire. Ensemble, nos résultats suggèrent que le scanning est un processus par lequel passent tout les ARNm nucléaire lorsqu’ils se retrouvent à la périphérie du noyau, pour initier plusieurs étapes de réarrangements nécessaires à leurs export. De plus, nous avons examiné le rôle de Yhr127p, une protéine nouvellement identifiée qui se lie à l’ARN. Après avoir marqué cette protéine avec la GFP, nous avons montré qu’elle forme des foci dans le noyau et que ces derniers vont disparaitre suite à l’arrêt de la transcription. La délétion de YHR127 à conduit à une augmentation de la transcription de quelques gènes spécifiques, mais n’affecte pas la capacité de la cellule à exporter les ARNm. Nos résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle dans la régulation de la transcription et/ou dans la stabilité de l’ARNm. / In eukaryotic cells, the processes of RNA and protein synthesis are spatially separated into two distinct compartments. With this division, a complex pathway of nucleocytoplasmic RNA export has evolved, which to date remains poorly understood. Recent advances in single-molecule microscopy have enabled direct studies focused on investigating the dynamics and kinetics of RNA export. In this Master thesis, we present the first real time visualization of mRNA export in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We first generated a GLT1 reporter under the control of the inducible GAL1 promoter, in which the GLT1 mRNA was tagged with an array of PP7 repeats and detected by exogenous PP7-GFP binding protein. Using a single-molecule live cell imaging approach, we were able to visualize and track the behavior of individual mRNAs from the site of transcription to the point of export. Interestingly, we found that once released from the transcription site, single mRNAs diffuse freely in the nucleoplasm, but once they reach the nuclear periphery, they scan the periphery before being exported to the cytoplasm. This scanning behavior was dependent on Myosin Like Proteins (Mlp1p and Mlp2p), which form the basket of the Nuclear Pore Complex (NPC), as mRNAs were not retained at the periphery and were rapidly released into the nucleoplasm in mlp1p/mlp2p double mutant cells. Specifically, we found that the C-terminal part of Mlp1p was important for scanning. Furthermore, mRNAs from cells depleted of the E3 ubiquitin ligase TOM1 had a similar phenotype to mRNAs in mlp1p/mlp2p double mutant cells, suggesting a role for scanning in the Tom1p-mediated release of Yra1p from the RNA. Lastly, we confirmed that endogenous MDN1 and CBL2 mRNAs also exhibit scanning behaviour. Taken together, our results suggest that mRNAs scanning the nuclear periphery is a general behaviour for all mRNAs to initiate the mRNA export process, allowing mRNP arrangement required for export to occur at the nuclear periphery. In addition, we investigated the role of YHR127, a newly identified RNA binding protein, in RNA biogenesis. Notably, we show that GFP-tagged YHR127p formed distinct foci in the nucleus, which were lost upon transcription arrest. Deletion of YHR127 led to an increase in transcript levels of specific genes, but not to a global accumulation of mRNAs in the nucleus, suggesting a role for this protein in regulating transcription and/or mRNA stability.

Cotutelle - Mélanie Dieudé / L’ischémie-reperfusion inhérente à toute transplantation d’organe solide induit l’apoptose des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales apoptotiques sécrètent des vésicules extracellulaires apoptotiques de type exosome (ApoExo). L’internalisation des ApoExo par les cellules endothéliales (CE) adjacentes conduit à des changements fonctionnels importants dont le dysfonctionnement endothélial. Cependant, les mécanismes d’internalisation des ApoExo par les CE sont méconnus. Des marqueurs fluorescents spécifiques aux protéines et à l’ARN ont été utilisés afin de marquer spécifiquement les ApoExo et étudier leur internalisation par microscopie confocale et cytométrie de flux. Les ApoExo ont été internalisés par les CE en fonction du temps et de la concentration. L’inhibition des voies classiques d’endocytose à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’interférence par ARN n’a pas réduit les niveaux d’internalisation des ApoExo. Le blocage de la phosphatidylsérine des ApoExo avec l’annexine-V a réduit leur internalisation. L’analyse ultrastructurelle par microscopie électronique des CE a révélé la présence de structures lamellipodes importantes pour la macropinocytose dont l’inhibition a diminué le transfert d’ARN et de protéines dans les CE. L’analyse par RT-qPCR a révélé que l’ARNm PCSK5, le plus enrichi dans les ApoExo, est augmenté dans les CE traitées aux ApoExo. Cette augmentation est abolie avec ApoExo exempts d’ARNm PCSK5. Ces résultats démontrent que les ApoExo sont activement internalisés par macropinocytose dépendante de la phosphatidylsérine, favorisant leur internalisation en augmentant l’activité macropinocytique des CE. Les ApoExo transfèrent ainsi des ARN fonctionnels capables de moduler le protéome des CE. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes pour la prévention de l’internalisation des ApoExo, et donc de la dysfonction endothéliale. / Ischemia-reperfusion injury inherent to solid organ transplantation induces endothelial apoptosis, releasing apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) which in turn induce endothelial dysfunction. We showed that ApoExo modulates gene expression, functions, and morphology of endothelial cells (EC) towards endothelial dysfunction. However, the mechanism by which EC internalize ApoExo remains unclear. Fluorescent probes specifically targeting proteins and RNA were used to track ApoExo uptake in EC by flow cytometry and confocal microscopy. Pharmacological inhibitors and gene silencing were used to probe uptake mechanisms. RNA and protein expression were quantified using Taqman RT-qPCR and immunoblot, respectively. Uptake of ApoExo by EC was observed in a time- and concentration-dependent manner. Inhibition of clathrin- and caveolae-dependent endocytosis did not decrease ApoExo internalization by EC. Blocking phosphatidylserine on ApoExo surface with annexin-V decreased ApoExo uptake. Ultrastructural analysis of serum-starved EC via electron microscopy revealed lamellipodia-like structures, hallmark of macropinocytosis, whose number increased following ApoExo exposure. Inhibition of macropinocytosis abrogated both RNA and protein transfers from ApoExo to EC. The most enriched mRNA in ApoExo, coding for PCSK5, showed enhanced levels in ApoExo-treated EC along with increased PCSK5 protein levels. This was abrogated by both macropinocytosis inhibition and depletion of PCSK5 mRNA in ApoExo. These results demonstrate that EC actively internalize ApoExo through phosphatidylserine-dependent macropinocytosis, and moreover, that ApoExo further increase macropinocytosis. These findings also show that functional RNAs can be delivered to EC through ApoExo. These results open new avenues for preventing ApoExo internalization and counteracting the development of endothelial dysfunction.

La localisation de l'ARNm est un mécanisme post-transcriptionnel régulant l'expression des gènes qui donne un contrôle précis sur la production spatiale et temporelle des protéines. Des milliers de transcrits dans un large éventail d'organismes ou de types cellulaires se sont avérés localisés dans un compartiment sous-cellulaire spécifique. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est l'un des organismes modèle les plus étudiés pour comprendre le processus de localisation de l'ARNm. Plus de trente ARNm sont activement transportés et localisés à l'extrémité du bourgeon de la levure bourgeonnante. Dans cet organisme, la localisation des transcrits à l'extrémité du bourgeon, tels que l'ARNm ASH1, dépend de la protéine de liaison à l'ARN She2, qui interagit directement avec les éléments de localisation dans ces ARNm durant leur transcription. She2 est une protéine liant l’ARN non-canonique, qui s’assemble en tétramère pour pouvoir lier l’ARN. Lorsque le complexe ARNm-She2 est exporté vers le cytoplasme, celui-ci interagit avec la protéine She3 et la myosine Myo4, qui transportent le complexe vers le bourgeon. Une fois qu'un ARNm est correctement localisé, sa traduction est activée pour permettre la synthèse locale de sa protéine. Les mécanismes régulant la localisation des ARNm sont encore très peu connus. Cependant, plusieurs évidences suggèrent que la machinerie de localisation peut être régulée par des modifications post-traductionnelles. Dans notre étude, en utilisant une colonne de purification de phosphoprotéines, nous avons constaté que She2 est une phosphoprotéine. Nous avons utilisé une approche de phosphoprotéomique pour identifier les résidus phosphorylés dans She2 in vivo. Nous avons identifié plusieurs nouveaux phosphosites qui affectent la capacité de She2 à favoriser l'accumulation asymétrique de la protéine Ash1. Fait intéressant, plusieurs phosphosites sont présents aux interfaces de dimérisation et de tétramérisation de She2. En nous concentrant sur la position T109, nous montrons qu'un mutant phosphomimétique T109D inhibe l'interaction She2-She2 et diminue l'interaction de She2 avec ses cofacteurs Srp1, She3 et l’ARNm ASH1. Fait intéressant, la mutation T109D réduit considérablement l'expression de She2 et perturbe la localisation de l'ARNm ASH1. Nos résultats montrent que le contrôle de l'oligomérisation de She2 par phosphorylation représente un mécanisme qui régule la localisation de l'ARNm dans la levure bourgeonnante. Dans le but d’identifier la ou les kinases impliquées dans la phosphorylation de She2, nous avons recherché des motifs de reconnaissance de kinases connues parmi les phosphosites que nous avons identifiés. Nous avons trouvé que les résidus T109, S217 et S224 font partie de sites putatifs de la Caséine kinase II (CKII), suggérant que ces positions seraient susceptibles d'être phosphorylés par cette kinase. Un essai de phosphorylation in vitro a révélé que She2 est phosphorylée par CKII au niveau des résidus S217 et S224, mais pas au résidu T109. Nous avons montré que la phosphorylation de la forme monomérique de She2 par CKII in vitro est augmentée par rapport à la forme sauvage tétramérique. De plus, nous avons observé que le domaine C-terminal de She2, qui contient sa séquence de localisation nucléaire (NLS) est phosphorylé par CKII. Cependant, le rôle de la phosphorylation dans le NLS de She2 demeure inconnu. Dans l'ensemble, nos résultats montrent que les modifications post-traductionnelles sur She2 régulent la localisation de l'ARNm chez la levure. Cette étude permettra d'élucider les mécanismes de contrôle de la localisation de l'ARNm chez la levure et comment des modifications post-traductionnelles sur She2 régulent ce processus. / mRNA localization is a post-transcriptional mechanism regulating gene expression that gives precise control over the spatial and temporal production of proteins. Thousands of transcripts in a wide array of organisms or cell types were shown to localize to specific subcellular compartments. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae serves as one of the best model organisms to study the mechanisms of mRNA localization. Over thirty transcripts are actively transported and localized at the bud tip of the budding yeast. In this organism, localization of transcripts to the bud tip, such as the ASH1 mRNA, depends on the RNA-binding protein She2, which is responsible for recognizing localization elements in these mRNAs during transcription. She2 is a non-canonical RNA-binding protein which assembles as a tetramer in order to bind RNA. When the mRNA-She2 complex is exported to the cytoplasm, the protein She3 and myosin Myo4 join the complex to transport it to the bud. Once an mRNA is properly localized, its translation is generally activated to allow the local synthesis of its protein. The mechanisms regulating the localization of mRNAs are still poorly known. Still, several pieces of evidence suggest that post-translational modifications may regulate the localization machinery. Using a phosphoprotein purification column, we found that She2 is a phosphoprotein. We used a phosphoproteomic analysis to identify the phosphorylated residues in She2 in vivo. We identified several new phosphosites that impact the capacity of She2 to promote the asymmetric accumulation of Ash1. Interestingly, several of these phosphosites are present at the dimerization and tetramerization interfaces of She2. Focusing on T109, we show that a phosphomimetic mutant T109D inhibits She2-She2 interaction and decreases the interaction of She2 with its co-interactors Srp1, She3 and ASH1 mRNA. Interestingly, the T109D mutation significantly reduces the expression of She2 and disrupts ASH1 mRNA localization. Altogether, our results show that the control of She2 oligomerization by phosphorylation represents a mechanism that regulates mRNA localization in budding yeast. In order to identify which kinase(s) are involved in She2 phosphorylation, we searched for known kinases recognition motifs among the identified phosphosites. We found that T109, S217 and S224 are putative Casein kinase II (CKII) sites, suggesting that this kinase may phosphorylate these residues. Indeed, an in vitro phosphorylation assay revealed that She2 is phosphorylated by CKII at S217 and S224 but not at T109. We found that the phosphorylation of a monomeric She2 mutant by CKII in vitro is increased compared to the wild-type tetrameric protein. Furthermore, we found that the C-terminal domain of She2, which contains its nuclear localization signal (NLS), is phosphorylated by CKII. However, the biological function of the phosphorylation in the NLS is still unknown. Altogether, our results show that post-translational modifications in She2 regulate mRNA localization in yeast. This study will help elucidate the mechanisms that control mRNA localization in yeast and how post-translational modifications in She2 regulate this process.

La localisation des ARNm par transport dirigé joue un rôle dans le développement, la motilité cellulaire, la plasticité synaptique et la division cellulaire asymétrique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiæ, la localisation d’ARNm est un phénomène dont les mécanismes de régulation sont conservés auprès de nombreux autres organismes. Lors de la division de la levure, plus d’une trentaine de transcrits sont localisés par transport actif à l’extrémité du bourgeon de la cellule-fille. Parmi ceux-ci, l’ARNm ASH1 est le mieux caractérisé et constitue le modèle utilisé dans cette étude. Pour exercer sa fonction, la protéine Ash1 doit être produite uniquement après la localisation de l’ARNm ASH1. Pour ce faire, les mécanismes de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 empêchent son expression durant le transport. Ce projet de recherche vise à étudier les mécanismes de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 par les répresseurs traductionnels connus, soit Khd1, Puf6 et Loc1. Les études antérieures se sont penchées sur ces facteurs de manière individuelle. Cependant, dans cette étude, nous avons exploré la présence d’une collaboration entre ceux-ci. Ainsi, nous avons voulu déterminer si les répresseurs traductionnels peuvent être intégrés en une seule voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1. De plus, nous avons cherché à identifier le mécanisme de recrutement des répresseurs traductionnels sur l’ARNm ASH1, qui correspond au point initial des voies de régulations de l’ARNm ASH1. Nos résultats montrent que les répresseurs traductionnels de l’ARNm ASH1, soit Khd1 et Puf6, font partie d’une même voie de régulation de la traduction. Le rôle du facteur nucléaire Loc1 dans la voie de régulation de la traduction, quant à elle, a été examinée à partir d’expériences permettant l’étude du mécanisme de recrutement des répresseurs traductionnels dans le noyau. Ainsi, nos travaux montrent que Puf6 et Loc1 sont associés de manière ARN-dépendant avec la machinerie de transcription, notamment au facteur d’élongation de la transcription Spt4-Spt5/DSIF. Par ailleurs, notre laboratoire a précédemment montré que la localisation nucléaire de la protéine de liaison à l’ARN She2 est essentielle au recrutement des facteurs Loc1 et Puf6 sur l’ARNm ASH1. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) supportent l’hypothèse que le recrutement de Loc1 est essentiel à celui de Puf6, qui s’effectue ultérieurement. Ainsi, à partir des résultats de cette étude et des résultats publiés précédemment dans notre laboratoire, nous avons élaboré un modèle de recrutement coordonné des facteurs She2, Loc1 et Puf6 sur l’ARNm ASH1 naissant. De manière générale, cette étude a permis d’établir la présence d’une seule voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 et une meilleure connaissance du recrutement des facteurs de répression traductionnelle sur celui-ci. / Directed transport mRNA localization play a role in the development, the cell motility, the synaptic plasticity and asymmetric cellular division. In the yeast Saccharomyces cerevisiæ, this regulation mechanism is conserved among many other species. During yeast cell division, around thirty mRNA are actively localized at the bud tip in the daughter cell. ASH1 mRNA is the best known among them and constitutes the model used in this study. In this model, Ash1 expression is possible only after proper localization of its mRNA. In order to do so, ASH1 mRNA translation is repressed by translational repressors during its active transport. This project investigates the mechanism of ASH1 mRNA translational regulation that is carried out by the translational repressors Khd1, Puf6 and Loc1. Previous studies characterized the action of these factors individually. However, in this study, we now explored the possibility of a collaboration between them. Thus, we sought to determine if these translational repressors are part of the same ASH1 mRNA translational regulation pathway. In addition, we tried to identify the mechanisms of recruitment of these translational repressors on ASH1 mRNA, the molecular mechanisms that initiates this process. In this work, we show that the cytoplasmic translational repressors Khd1 and Puf6 are part of the same ASH1 mRNA translational regulation pathway. In this pathway, the role of the nuclear translational factor Loc1 was determined by the analysis of translational factors recruitment on ASH1 in the nucleus. We demonstrate that Puf6 and Loc1 interact in an RNA-dependent manner with the transcription machinery, via the transcription elongation factor Spt4-Spt5/DSIF. Finally, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays support the model that Loc1 recruitment to nascent ASH1 mRNA is essential for the subsequent recruitment of Puf6 to this transcript. With the results of this study and others previously done in the lab, we elaborated a recruitment model for the She2, Loc1 and Puf6 proteins on the nascent ASH1 mRNA. In conclusion, this study has established that the translational repressors Khd1, Puf6 and Loc1 are part of the same ASH1 mRNA translational regulation pathway and allowed a better understanding of the mechanism of recruitment of translational repressors on their target mRNA.

De récents travaux ont mis en évidence que des dysfonctionnements dans l’expression de gènes impliqués dans la plasticité synaptique contribuent aux déclins cognitifs qu’on observe chez les gens âgés et à la progression de la maladie d’Alzheimer. Notre étude avait comme objectif d’étudier le profil d’expression d’ARNm spécifiques impliqués dans la plasticité synaptique chez des rats jeunes et âgés et chez des souris transgéniques 3xTg et WT. Des expériences en qRT-PCR ont été effectuées dans des extraits de cortex et d’hippocampe de rats jeunes et âgés et de souris 3xTg et WT, respectivement. Les résultats ont démontré une augmentation significative de l’expression d’ARNm MAP1B, Stau2, BDNF, CREB et AGO2 principalement dans l’hippocampe (régions CA1-CA3) des souris 3xTg comparé aux souris WT. Une diminution significative a également été observée pour l’ARNm αCaMKII dans le cortex des souris 3xTg comparé aux souris WT. Contrairement à ces observations, aucun changement n’a été observé pour l’expression de gènes impliqués dans la plasticité synaptique chez les rats âgés comparé aux rats jeunes. Ces résultats démontrent qu’un dysfonctionnement existe réellement au début de la maladie d’Alzheimer dans l’expression de gènes spécifiques impliqués dans la plasticité synaptique et contribue potentiellement à la progression de la maladie en engendrant un déséquilibre entre la LTP et la LTD. De plus, les différences d’expressions sont particulièrement observées dans l’hippocampe (régions CA1-CA3) ce qui est consistant avec les études sur la progression de la maladie d’Alzheimer puisqu’il est connu que la région CA1 de l’hippocampe est la plus vulnérable à l’apparition de la maladie. Ces résultats permettent une meilleure compréhension des événements moléculaires qui deviennent dérégulés à l’apparition de la maladie d’Alzheimer. / Recent work has demonstrated that dysregulations in the expression profile of plasticity-related genes in specific brain regions contribute to age-related cognitive decline and Alzheimer’s disease. The aim of this study was to determine the expression profile of a subset of plasticity-related mRNAs in different regions of the brain of young and aged rats as well as 3xTg and wild type (WT) mice. qRT-PCR experiments were performed in extracts of cortex and hippocampus of young and aged rats and of 3xTg and WT mice, respectively. Results demonstrated significant increases in the expression of MAP1B, Stau2, CREB, BDNF, and AGO2 mRNAs, especially in the hippocampus (CA1-CA3 fields) of 3xTg mice compared to WT mice. A significant decrease was also observed in the expression of αCaMKII mRNA in the cortex of 3xTg mice compared to WT mice. On the other hand, no significant changes were observed in the expression of plasticity-related genes in the hippocampus of aged rats compared to young rats. These results confirm that alterations in gene expression occur at the onset of AD and possibly contribute to the progression of the disease by causing an imbalance between long-term potentiation and long-term depression. In addition, patterns of significant altered gene expression, especially in the hippocampus (CA1-CA3 fields) of 3xTg mice are consistent with the progression of AD whereby the hippocampus (CA1 region) is most vulnerable at the onset of the disease. These results provide a better understanding of the molecular events that first become disturbed in AD.

Dans cette thèse, l’impact du polymorphisme rs3846662 sur l’épissage alternatif de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGCR) a été investigué in vivo, chez des patients atteints d’hypercholestérolémie familiale (HF) ou de maladie d’Alzheimer (MA). Le premier manuscrit adresse la problématique de la normalisation de la quantification relative des ARNm par PCR quantitative. Les découvertes présentées dans ce manuscrit nous ont permis de déterminer avec un haut niveau de confiance les gènes de référence à utiliser pour la quantification relative des niveaux d’ARNm de l’HMGCR dans des échantillons de sang (troisième manuscrit) et de tissus cérébraux post-mortem (quatrième manuscrit). Dans le deuxième manuscrit, nous démontrons grâce à l’emploi de trois cohortes de patients distinctes, soit la population canadienne française du Québec et les deux populations nord américaines « Alzheimer’s Disease Cooperative Study (ADCS) » et « Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) », que le génotype AA au locus rs3846662 confère à ces porteurs une protection considérable contre la MA. Les femmes porteuses de ce génotype voient leur risque de MA diminuer de près de 50% et l’âge d’apparition de leurs premiers symptômes retarder de 3.6 ans. Les porteurs de l’allèle à risque APOE4 voient pour leur part leurs niveaux de plaques séniles et dégénérescences neurofibrillaires diminuer significativement en présence du génotype AA. Enfin, les individus atteints de déficit cognitif léger et porteurs à la fois de l’allèle APOE4 et du génotype protecteur AA voient leur risque de convertir vers la MA chuter de 76 à 27%. Dans le troisième manuscrit, nous constatons que les individus atteints d’HF et porteurs du génotype AA ont, contrairement au modèle établi chez les gens normaux, des niveaux plus élevés de cholestérol total et de LDL-C avant traitement comparativement aux porteurs de l’allèle G. Le fait que cette association n’est observée que chez les non porteurs de l’APOE4 et que les femmes porteuses du génotype AA présentent à la fois une augmentation des niveaux d’ARNm totaux et une résistance aux traitements par statines, nous indique que ce génotype influencerait non seulement l’épissage alternatif, mais également la transcription de l’HMGCR. Comme une revue exhaustive de la littérature ne révèle aucune étude abondant dans ce sens, nos résultats suggèrent l’existence de joueurs encore inconnus qui viennent influencer la relation entre le génotype AA, l’épissage alternatif et les niveaux d’ARNm de l’HMGCR. Dans le quatrième manuscrit, l’absence d’associations entre le génotype AA et les niveaux d’ARNm Δ13 ou de protéines HMGCR nous suggère fortement que ce polymorphisme est non fonctionnel dans le SNC affecté par la MA. Une étude approfondie de la littérature nous a permis d’étayer cette hypothèse puisque les niveaux de HNRNPA1, la ribonucléoprotéine influencée par l’allèle au locus rs3846662, sont considérablement réduits dans la MA et le vieillissement. Il est donc proposé que les effets protecteurs contre la MA associés au génotype AA soient le résultat d’une action indirecte sur le processus physiopathologique. / In this thesis, the impact of rs3846662 polymorphism on the alternative splicing of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR) was investigated in vivo, in patients with familial hypercholesterolemia (FH) or Alzheimer disease (AD). The first manuscript addresses the issue of normalization in relative quantification of mRNA by quantitative PCR. The findings presented in this manuscript have allowed us to determine with a high level of certainty the appropriate reference genes to use for the relative quantification of HMGCR mRNA levels in blood samples (third manuscript) and postmortem brain tissues (fourth manuscript). In the second manuscript, we demonstrate through the use of three independent cohorts, namely the French Canadian population of Quebec and the two North American populations named "Alzheimer's Disease Cooperative Study (ADCS)" and "Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) ", that the AA genotype at locus rs3846662 confers significant protection against AD. Women carrying this genotype decrease their risk of AD by about 50%, and delay their age of onset of 3.6 years. For their part, individuals carrying both the APOE4 risk allele and the AA genotype have decreased levels of senile plaques and neurofibrillary tangles compared to individuals carrying both the APOE4 and HMGCR G alleles. Finally, individuals suffering from mild cognitive impairment and carrying both the APOE4 risk allele and the protective AA genotype see their risk of converting to AD drop from 76% to 27%. In the third manuscript, contrary to the model described in normal subjects, we discovered that individuals with FH carrying the AA genotype have higher levels of total cholesterol and LDL-C before treatment compared to the carriers of the G allele. This latter association is observed only in non-carriers of the APOE4 risk allele. Furthermore, women carrying the AA genotype have both an increase in total HMGCR mRNA levels and a decrease response to statin treatment. These results suggest the AA genotype has an impact not only on the alternative splicing, but also on the transcription of HMGCR. Since an exhaustive review of the literature has reveal no studies corroborating this hypothesis, our results suggest the existence of yet unknown players influencing the relationships between the AA genotype, alternative splicing and the mRNA levels of HMGCR. In the fourth manuscript, we uncovered no association between the AA genotype and Δ13 mRNA or HMGCR protein levels. This strongly suggests that the rs3846662 polymorphism is not functional in the CNS affected by AD. A thorough study of the literature enabled us to support this hypothesis since the levels of HNRNPA1, the ribonucleoprotein influenced by the allele status at rs3846662 locus, are significantly reduced in AD and aging. Accordingly, we propose that the protective effects of the AA genotype against AD may be mediated through indirect effects on the physiopathology of the disease.

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