L'adénosine, la PGE2 ou l'AMP cyclique intracellulaire mènent toutes à des actions antiinflammatoires chez le neutrophile en inhibant par exemple la phagocytose, la production d'ions superoxydes, l'adhésion et la libération de cytokines. Par contre, les mécanismes moléculaires régulant ces actions anti-inflammatoires ne sont pas bien connus. Dans cette étude, nous avons étudié l'impact que ces agents ont sur le profil d'expression des gènes du neutrophile. L'expression génique a été étudiée par Genechip puis les résultats obtenus ont été validés par la technique du peR en temps réel. Avec cette approche, une quinzaine de gènes dont l'expression était altérée par ces agents ont été identifiés. Remarquablement, les trois agents utilisés ont eu un impact fort similaire sur le profil d'expression, suggérant un mécanisme commun permettant de limiter l'activation cellulaire. Nous avons donc identifié lors de ce projet un ensemble de gènes qui peuvent constituer d'importants signaux d'arrêt de l'activation du neutrophile.

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale cause de démence chez les personnes âgées. Les mutations dans les gènes codant pour les présénilines 1 et 2 (PS1 et PS2) sont associées à une forme familiale très agressive de la MA, affectant des individus entre 25-50 ans. PS1 est un membre du complexe y-sécrétase impliqué dans la production de l'amyloïde, et les mutations de PS1 entraînent une surproduction des formes longues de ce peptide qui évoluent vers les plaques seniles. Cependant, il est maintenant bien décrit que PS1 interagît avec d'autres protéines et voies de signalisation, parmi lesquelles se trouve son seul partenaire exclusivement neuronal, la neural plakophilin related armadillo protein (NPRAP ou 5-caténine). Afin d'investiguer la fonction biologique de NPRAP, ainsi que son interaction avec PS1, nous avons réalisé une analyse d'expression génique à l'aide de micropuces à ADN. Nous avons trouvé plusieurs gènes régulés par NPRAP, y compris BCHE (butyrylcholinesterase), qui est associé à la MA. De plus, nous avons démontré que le signal de localisation nucléaire de NPRAP est requis pour cette modulation et que la PS1 peut affecter l'effet de NPRAP sur BCHE. Ces résultats sont en accord avec d'autres observations qui suggèrent un rôle pour PS1 comme régulateur de la mobilité de NPRAP, de la périphérie cellulaire jusqu'à la région périnucléaire ou ils interagissent très fortement. De façon intéressante, l'analyse de l'interactome de NPRAP par spectrométrie de masse a identifié son association directe à une isoforme de la dynamine 2 impliquée dans le trafic membranaire et l'assemblage de l'actine dans le Golgi. Nos résultats suggèrent que PS1 peut réguler la signalisation intracellulaire médiée par NPRAP, mais aussi que NPRAP aurait un rôle putatif dans la régulation du complexe y-sécrétase dans lequel participe PS1.

Le matériel génétique des cellules de notre organisme est continuellement exposé à différents types d'agressions. En effet, on estime qu'une cellule subit des dizaines de milliers de lésions dans l'ADN par jour. Ces dernières peuvent provoquer une instabilité génomique, une caractéristique du cancer, si elles ne sont pas réparées adéquatement. La recombinaison homologue (RH) est un des mécanismes de réparation des cassures double-brin de l'ADN. À la suite de l'action de nucléases sur les cassures double-brin, des extrémités simple-brin 3'-protubérants sont générées et protégées par la protéine RPA. Celle-ci doit ensuite être enlevée par l'activité médiatrice des protéines PALB2 et BRCA2 afin de permettre à la recombinase RAD51 de polymériser sur l'ADN et catalyser l'invasion du brin endommagé au niveau de la chromatide sœur. PALB2, est au cœur de ce processus, coordonnant les fonctions des protéines BRCA1/BRCA2 et interagissant avec l'ADN brisé pour faciliter la RH. Dans un premier temps, nous avons identifié un site majeur de liaison à l'ADN de PALB2 dans lequel des mutations réduisent de 50% la formation des foyers RAD51 et l'efficacité globale de la HDR (Homology-directed repair) dans les cellules. Le domaine de liaison à l'ADN situé en N-terminal de PALB2 (N-DBD) stimule la fonction recombinase de RAD51. Étonnamment, il possède une activité d'échange de brins sans RAD51. De plus, N-DBD stimule l'échange de brins inverse et peut utiliser des substrats d'ADN et d'ARN. Ces résultats révèlent une propriété d'interaction polyvalente de PALB2 et démontrent un rôle essentiel de la liaison à l'ADN par PALB2 pour la réparation des chromosomes dans les cellules. Ensuite, nous avons utilisé la microscopie électronique à transmission combinée à la biochimie pour caractériser la participation séquentielle de RPA, RAD52 et BRCA2 dans l'assemblage, l'architecture et l'activité du filament RAD51. Nous avons observé que RAD52 peut se lier étroitement à l'ADN simple-brin revêtu de RPA, inhiber le rôle médiateur de BRCA2 et former des filaments mixtes contenant RAD52 et RAD51 plus courts. Ces derniers sont plus efficaces dans la recherche d'homologie ultérieure, dans la formation de complexes synaptiques et de D-loops et entraine des multi-invasions plus fréquentes Une déficience dans la RH peut mener à une instabilité génomique et aux cancers. Dans la plupart des cas, ces défauts de réparation des cassures double-brin par RH surviennent à la suite d'altérations génétiques dans les gènes impliqués dans ce mécanisme tels que BRCA1, PALB2 et BRCA2. Ces tumeurs déficientes en RH peuvent être traitées par des inhibiteurs de PARP grâce au concept de létalité synthétique. En effet, il a été observé que l'inhibition de PARP-1, une protéine impliquée dans la réparation de l'ADN, entraine une létalité synthétique dans ces tumeurs déficientes sans pour autant affecter les tissus sains. Cependant, de nombreux patients vont développer une résistance à ces inhibiteurs de PARP, seulement quelques mois après le début du traitement, entrainant ainsi une récidive du cancer. C'est pourquoi il apparait essentiel de trouver de nouvelles options thérapeutiques. Nous avons utilisé plusieurs molécules commerciales dérivées du DIDS (4,4′-Diisothiocyano-2,2′-stilbenedisulfonic acid), un inhibiteur de RAD51, pour caractériser les déterminants structuraux impliqués dans la modulation de l'activité de RAD51. En combinant des approches biochimiques et biophysiques, nous avons montré que le DIDS et deux analogues étaient capables d'inhiber la liaison de RAD51 à l'ADN simple-brin et d'empêcher la formation de structure D-loop par RAD51. Les deux substituants isothiocyanate du DIDS semblent être essentiels dans l'inhibition de RAD51. Ces résultats ouvrent la voie à la synthèse de nouvelles molécules dérivées du DIDS qui devraient être de plus grands modulateurs de RAD51 et plus efficaces pour l'inhibition de la RH. Finalement, nous avons identifié de nouvelles molécules qui inhibent la RH. Pour cela, nous avons mis au point une technique de criblage *in cellulo* permettant de tester l'effet direct de composés chimiques sur la formation des foyers RAD51. À l'aide de cette technique, nous avons identifié que, parmi 1381 molécules chimiques, l'enzyme nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT) pouvait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de certaines tumeurs notamment celles présentant une surexpression de RAD51 et celles ayant développé une résistance aux inhibiteurs de PARP. En effet, l'inhibition de NAMPT entraine une diminution drastique des foyers RAD51 ainsi que des niveaux protéiques de RAD51 et BRCA2 conduisant à la mort des cellules par apoptose. / The cellular genetic material is continuously exposed to different sources of damages. Indeed, it is estimated that a cell undergoes tens of thousands of DNA lesions per day. These will cause genomic instability, a characteristic of cancer, if they are not correctly repaired. Homologous recombination (HR) is one of the repair mechanisms for DNA double-strand breaks. As a result of the action of nucleases on double-strand breaks, single-stranded 3'-overhang ends are generated and protected by the RPA protein. PALB2 and BRCA2 proteins will then remove RPA to allow the RAD51 recombinase to polymerize on the DNA and catalyze the invasion of the damaged strand to the sister chromatid. PALB2, is central to this process, coordinating the functions of the BRCA1/BRCA2 proteins and interacting with broken DNA to facilitate HR. First, we identified a major DNA-binding site of PALB2, mutations in which reduce RAD51 foci formation and the overall HDR (Homology-directed repair) efficiency in cells by 50%. PALB2 N-terminal DNA-binding domain (N-DBD) stimulates the function of RAD51 recombinase. Surprisingly, it possesses the strand exchange activity without RAD51. Moreover, N-DBD stimulates the inverse strand exchange and can use DNA and RNA substrates. Our data reveal a versatile DNA interaction property of PALB2 and demonstrate a critical role of PALB2 DNA binding for chromosome repair in cells. Then, we have used Transmission Electron Microscopy combined with biochemistry to characterize the sequential participation of RPA, RAD52 and BRCA2 in the assembly of the RAD51 filament, its architecture and its activity. Despite our results confirm that RAD52 lacks a mediator activity, we observed that RAD52 can tightly bind to RPA-coated ssDNA, inhibit the mediator role of BRCA2 and form shorter RAD52- and RAD51-containing mixed filaments that are more efficient in subsequent homology search and formation of synaptic complexes and D-loops, resulting in more frequent multi-invasions as well. A deficiency in HR can lead to genomic instability and cancers, notably breast and ovarian cancers. Most commonly, these defects in the repair of double-strand breaks by RH arise as a result of genetic alterations in the genes involved in this mechanism such as BRCA1, PALB2 and BRCA2. HR-deficient tumors can be treated with PARP inhibitors leading to synthetic lethality. Indeed, it has been observed that the inhibition of PARP-1, a protein involved in DNA repair, leads to synthetic lethality in these deficient tumors without affecting healthy tissues. However, many patients will develop resistance to these PARP inhibitors only a few months after starting treatment, leading to cancer recurrence. Therefore, it seems essential to find new therapeutic options. We used several commercial molecules derived from DIDS (4,4′-Diisothiocyano-2,2′-stilbenedisulfonic acid) to characterize the structural determinants involved in modulating the activity of RAD51. By combining biochemical and biophysical approaches, we have shown that DIDS and two analogs were able to inhibit the binding of RAD51 to ssDNA and prevent the formation of D-loop by RAD51. Both isothiocyanate substituents of DIDS appear to be essential in the inhibition of RAD51. These results open the way to the synthesis of new molecules derived from DIDS that should be greater modulators of RAD51 and more efficient for HR inhibition. Finally, we identified new molecules that inhibit HR. We have developed an *in cellulo* screening technique to test the direct effect of chemical compounds on the RAD51 foci formation. Using this technique, we have identified that, among 1381 chemical molecules, the enzyme nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) could be an interesting therapeutic target for the treatment of certain tumors, in particular those presenting an overexpression of RAD51 and those having developed a resistance to PARP inhibitors. Indeed, inhibition of NAMPT leads to a drastic decrease in RAD51 foci as well as protein levels of RAD51 and BRCA2 leading to cell death by apoptosis.

L'orme d'Amérique (*Ulmus americana*) est un arbre d'Amérique du Nord qui joue un rôle écologique crucial en étant l'un des premiers arbres à fleurir au printemps. Il constitue un habitat pour diverses espèces d'insectes et de pollinisateurs, ainsi que pour les oiseaux migrateurs au début de la saison. L'espèce est également utilisée dans l'agriculture et la construction depuis l'arrivée des premiers peuples indigènes américains et des colons européens et aussi très prisé pour sa valeur ornementale. Le XXe siècle a marqué un tournant dans l'histoire de l'orme américain en raison de deux épidémies consécutives de maladie hollandaise de l'orme (MHO) causées par les champignons ascomycètes *Ophiostoma ulmi* (OU) et *O. novo-ulmi* (ONU) qui ont provoqué des pertes catastrophiques dans toute l'aire de répartition de l'orme américain. Afin de mieux comprendre les mécanismes d'action des agents de la MHO, nous avons réalisé la première étude de transcriptomique comparative incluant des souches représentatives des trois espèces causant la MHO, ainsi que de l'espèce apparentée *O. quercus*, un saprotrophe. Les analyses statistiques des transcriptomes fongiques récupérés 3 et 10 jours après l'infection de jeunes plants d'*Ulmus americana* ont mis en évidence plusieurs gènes candidats associés à la virulence et aux interactions hôte-pathogène, chaque souche présentant un transcriptome distinct. Les données obtenues confirment l'importance d'étudier le comportement transcriptionnel de taxons fongiques distincts afin de comprendre leur pathogénicité et leur virulence en relation avec la progression temporelle de l'interaction hôte-pathogène. Les données massives de séquences d'ARN total de l'infection *in planta* développées pour cette première étude nous ont également permis d'investiguer le comportement transcriptionnel d'*U. americana* en réponse à l'infection. Les analyses ont démontré que les transcriptomes d'orme varient selon l'espèce et la lignée d'*Ophiostoma* inoculée. Nous avons notamment observé que l'inoculation d'une souche d'ONU sauvage ou d'un mutant (*∆ogf1*) pour un seul gène nucléaire engendrait des différences majeures chez les transcriptomes d'orme, notamment l'expression différentielle d'un orthologue du gène de la MAP kinase 3 (MAPK3) chez les individus auxquels on avait inoculé le mutant ∆*ogf1*. Nous avons en outre utilisé pour la première fois l'outil informatique *CoNet* du logiciel *Cytoscape* pour déduire des réseaux d'association biologique et détecter des schémas non aléatoires significatifs de cooccurrence entre les plantes et les champignons. Cette approche a révélé une corrélation significative entre l'expression de plusieurs gènes chez l'hôte et chez l'agent pathogène, 3 jours après l'inoculation. Bien que moins nombreuses, les cooccurrences détectées 10 jours après inoculation incluaient des corrélations significatives entre l'expression d'un gène impliqué dans la photosynthèse chez l'orme et l'expression de gènes d'ONU codant pour des métabolites secondaires. Finalement, afin de mieux comprendre les mécanismes de virulence d'*Ophiostoma novo-ulmi* et la base moléculaire de l'interaction entre *O. novo-ulmi* et *U. americana*, nous avons réalisé une analyse fonctionnelle en inactivant deux gènes fongiques à l'aide de l'édition du génome CRISPR-Cas9. Les mutants ont ensuite été inoculés à de jeunes plants d'orme en serre. Cette étude fonctionnelle met en évidence le gène codant pour le régulateur transcriptionnel Zap1 qui contrôle l'expression des gènes responsables de la captation de zinc, ainsi que le gène codant pour le facteur de transcription Ste12 présent exclusivement dans le règne fongique. Le mutant ∆*zap1* s'est avéré plus virulent que la souche *O. novo-ulmi* H327 de type sauvage dont il est issu, tandis que le mutant ∆*ste12* s'est avéré avirulent. En outre, des gaules d'orme d'abord infectées par le mutant ∆*ste12* ont montré une plus grande résistance lorsque confrontées à la souche de type sauvage. Cette thèse permet de mieux comprendre le développement de l'interaction entre l'orme d'Amérique et les agents pathogènes responsables de la MHO, grâce à l'obtention et l'analyse statistique de données massives. Finalement, la production de souches d'*Ophiostoma* mutantes ouvre également la possibilité de réaliser de futures études transcriptionnelles pour amener de nouvelles connaissances dans la compréhension de la MHO. / The American elm (*Ulmus americana*) is a North American tree that plays a crucial ecological role as one of the first trees to flower in spring. It provides a habitat for various species of insects and pollinators, as well as for migratory birds at the start of the season. The species has also been used in agriculture and construction since the arrival of the first indigenous American peoples and European settlers and is highly prized for its ornamental value. The 20th century marked a turning point in the history of the American elm due to two consecutive epidemics of dutch elm disease (DED) caused by the ascomycete fungi *Ophiostoma ulmi* (OU) and *O. novo-ulmi* (ONU), which led to catastrophic losses throughout the range of the American elm. To better understand the mechanisms of action of DED agents, we carried out the first comparative transcriptomics study including representative strains of the three DED-causing species, as well as the related saprotrophic species *O. quercus*. Statistical analyses of fungal transcriptomes recovered 3 and 10 days after infection of Ulmus americana seedlings revealed several candidate genes associated with virulence and host-pathogen interactions, with each strain presenting a distinct transcriptome. The data obtained confirm the importance of studying the transcriptional behavior of distinct fungal taxa to understand their pathogenicity and virulence in relation to the temporal progression of host-pathogen interaction. The massive total RNA-seq data from in planta infection developed for this first study also enabled us to investigate the transcriptional behavior of *U. americana* in response to infection. Analyses showed that elm transcriptomes varied according to the species and lineage of *Ophiostoma* inoculated. We observed that inoculation with either a wild-type ONU strain or a mutant (∆ogf1) for a single nuclear gene resulted in major differences in elm transcriptomes, including differential expression of an ortholog of the MAP kinase 3 (MAPK3) gene in individuals inoculated with the ∆*ogf1* mutant. We also used the Cytoscape software tool CoNet for the first time to infer biological association networks and detect significant non-random patterns of co-occurrence between plants and fungi. This approach revealed a significant correlation between the expression of several genes in the host and in the pathogen, 3 days after inoculation. Although fewer in number, the co-occurrences detected 10 days after inoculation included significant correlations between the expression of a gene involved in photosynthesis in elm and the expression of ONU genes encoding secondary metabolites. Finally, to better understand the virulence mechanisms of *Ophiostoma novo-ulmi* and the molecular basis of the interaction between *O. novo-ulmi* and *U. americana*, we carried out a functional analysis by inactivating two fungal genes using CRISPR-Cas9 genome editing. The mutants were then inoculated into elm seedlings in the greenhouse. This functional study highlighted the gene encoding the transcriptional regulator Zap1, which controls the expression of genes responsible for zinc uptake, as well as the gene encoding the transcription factor Ste12 found exclusively in the fungal kingdom. The ∆zap1 mutant proved more virulent than the wild-type *O. novo-ulmi* H327 strain from which it was derived, while the ∆ste12 mutant proved avirulent. In addition, elm saplings first infected with the ∆ste12 mutant showed greater resistance when confronted with the wild-type strain. This thesis provides a better understanding of the development of the interaction between American elm and the pathogens responsible for DED, by obtaining and statistically analyzing massive data. Finally, the production of mutant *Ophiostoma* strains also opens the possibility of future transcriptional studies to provide new insights into the understanding of DED.

La population québécoise (~7 millions d’habitants) est constituée d'environ six millions d'individus descendant d'un bassin génétique estimé à 8500 fondateurs. Les caractéristiques uniques de cette population facilitent beaucoup les recherches en génétique. Cette thèse de doctorat traite de la génétique moléculaire du glaucome, une maladie oculaire insidieuse qui est l'une des principales causes de cécité à travers le monde. Dans le but d'investiguer les facteurs génétiques impliqués dans cette maladie, nous avons recruté des familles ségréguant le glaucome primaire à angle ouvert (GPAO) et des individus non reliés également atteints de glaucome ou d'hyperpression intraoculaire (HTO). Des mutations du « trabecular meshwork inducible glucocorticoid response gene » (TIGR), ou myociline (MYOC), ont été recherchées parmi 18 familles, représentant 180 individus atteints, et 422 cas sporadiques. La prévalence de mutation de ce gène a été établie à 22,2 et 3,8%, respectivement chez les familles et patients non reliés. Des corrélations génotype/phénotype des mutations identifiées ont été établies. Grâce à la détermination de signatures alléliques entourant le gène TIGR/MYOC, il a été possible d'estimer le nombre de fondateurs ayant contribué à la présence des mutations disséminées dans l'échantillon de la population québécoise testée. Huit familles comportant un nombre suffisant d'individus pour la réalisation d'une étude préliminaire de liaison (linkage) ont été génotypées sur six régions de susceptibilité au glaucome déjà rapportées. Le génotypage de ces familles visait la réduction d’intervalles génétiques associés au glaucome dans le but de découvrir d’autres gène responsables de la maladie. Une famille, représentant un potentiel de liaison intéressant au locus GLC1B, a été élargie dans le but d'augmenter le nombre d'individus atteints possédant un haplotype lié à cette région située sur le chromosome 2cen-q13. Malgré l'identification de gènes candidats intéressants dans ce locus, la saturation de la région chromosomique en marqueurs génotypés chez cette famille a révélé l'absence d'un haplotype commun parmi tous les individus affectés. Le recrutement additionnel de larges familles ségréguant le GPAO et l'élargissement de certains pedigrees déjà prélevés seront nécessaires à l'identification de nouveaux facteurs génétiques jouant un rôle important dans cette pathologie oculaire commune. / The Québec population (~7 million residents) is constituted of approximately six million individuals that descended from an estimated genetic pool of 8500 founders. Utilizing the unique features of this population, this thesis is about the molecular genetics glaucoma, an insidious ocular disease that is a worldwide leading cause of blindness. To study the genetic factors involved in this disorder, we recruited families segregating primary open-angle glaucoma (POAG), and unrelated individuals also affected by glaucoma or ocular hypertension (OHT). Mutations of the TIGR/myocilin (MYOC) gene, until recently the only known genetic cause for juvenile and adult-onset POAG, have been screened in 18 families, representing 180 affected individuals, and 422 sporadic cases. Mutational analysis of this gene showed mutation prevalences of 22,2 and 3,8%, respectively, in families and unrelated patients. Genotype/phenotype correlations of some of the mutations found were established, revealing that the Gly367Arg and Lys423Glu mutations were the most severe. Characterization of allelic signatures surrounding the TIGR/MYOC gene allowed an estimation of the number of founders that may have disseminated the mutations found in the Québec population sample and an evaluation of the possible application of this technique to similar disorders. Eight families with enough individuals to undertake a preliminary linkage study were genotyped on six known glaucoma susceptibility regions. The genotyping of these families aimed the reduction of the genetic intervals of one or more of these known regions to eventually find a new glaucoma-causing gene. One family, representing a strong linkage potential to the GLC1B locus, was extended to have a higher number of affected individuals harboring the candidate disease haplotype linked to this region positioned at chromosome 2cen-q13. Although some interesting candidate genes were identified in this locus, the saturation of the chromosomal region with polymorphic markers revealed the absence of a common haplotype between all the affected individuals of this family. Additional recruiting of large families segregating POAG and the extension of some pedigrees already investigated will be necessary to the identification of new genetic factors closely involved in this common ocular pathology.

Insulin-like factor 3 (INSL3) est une hormone qui est exprimée spécifiquement dans les cellules de Leydig chez le mâle et les cellules de la thèque chez la femelle. INSL3 joue un rôle essentiel dans le développement et la fonction de l'appareil reproducteur mâle. En effet, LNSL3 contrôle la 1ère phase de la descente testiculaire pendant la vie foetale et agit comme facteur de survie des cellules germinales chez l'adulte. Malgré son rôle crucial chez le mâle, on sait peu de choses quant à sa régulation transcriptionnelle dans les cellules de Leydig. Jusqu'à présent seulement 2 facteurs de transcription ont été identifiés comme régulateur de la transcription d'Insl3 : les récepteurs nucléaires SF-1 et NUR77. Toutefois, ces récepteurs sont exprimés dans de nombreux autres tissus qui n'expriment pas Insl3, indiquant que d'autres facteurs de transcription sont requis pour l'expression spécifique d'Insl3 dans les cellules de Leydig. Afin d'identifier ces facteurs de transcription, nous avons isolé et analysé un fragment de 1.1 kb du promoteur souris d'Insl3. Grâce à des deletions 5' progressives, j'ai identifié une région de 27 pb responsable de 70% de l'activité transcriptionnelle d'Insl3.

Plusieurs études ont démontré l’existence d’une corrélation directe entre l’exposition fœtale à des contaminants environnementaux (comme le DEHP ou les estrogènes) et la perturbation de la différenciation sexuelle chez les fœtus mâles. Ces études ont notamment mis en évidence l’existence d’une fenêtre de susceptibilité; une période pendant laquelle l’exposition des cellules de Leydig aux contaminants perturbe leurs activités et entraine une diminution de leurs sécrétions des hormones testostérone (T) et Insulin-like 3 (INSL3). Ces hormones sécrétées par les cellules de Leydig sont requises pour la différenciation sexuelle du fœtus mâle, l’adoption des caractéristiques masculines primaires et secondaires (revue de Robert Courrier, 1962). Ces hormones influencent aussi la formation des spermatozoïdes et le comportement sexuel. Les études démontrent qu’une production insuffisante de ces hormones est corrélée avec une fertilité réduite (de modérée à très grave), une sous-masculinisation, la non-descente des testicules dans le scrotum (cryptorchidie) et parfois même une féminisation des organes sexuels primaires. Selon plusieurs spécialistes, ces symptômes seraient le résultat d’une perturbation de l’ontogenèse des testicules durant le développement fœtal. Syndrome de dysgénésie testiculaire est le nom qui a été donné à cette théorie. La cryptorchidie congénitale découlerait donc d’une insuffisance d’activités hormonales et révélerait par le fait même un problème de dysgénésie testiculaire. Bien que la prévalence varie à travers le monde, il semblerait, qu’en moyenne, au moins 4 % des nouveau-nés naissent avec cette condition. La localisation des testicules cryptorchides peut être corrigée chirurgicalement par orchiopexie (orchidopexie). Néanmoins, la correction chirurgicale ne semble pas être suffisante puisque les individus cryptorchides à la naissance demeurent plus à risque de développer un cancer du testicule et de souffrir de problèmes reliés à la fertilité, et ce, même après correction chirurgicale. Bien que les preuves provenant des études épidémiologiques et animales soient de plus en plus explicites, les preuves moléculaires demeurent partielles ou peu concluantes. Des preuves de nature moléculaire pourraient permettre de mieux définir le risque réel que représente le DEHP pour la santé humaine et la fertilité masculine. Le principal objectif des recherches effectuées était d’identifier et de valider un modèle in vitro permettant l’étude de composés potentiellement toxiques en minimisant le sacrifice d’animaux. À travers ces travaux, nous démontrons que la testostérone (T) augmente les niveaux d’ARNm d’Insl3 dans une lignée de cellules de Leydig et dans des cellules de Leydig primaires. Nous démontrons aussi que la testostérone induit l’activité des promoteurs d’Insl3 de différentes espèces. De plus, nous mettons en évidence que l’effet inducteur de la T sur l’activité transcriptionnelle et l’ARNm d’Insl3 nécessite le récepteur aux androgènes (AR). Nous avons localisé l’élément de réponse à la T sur le promoteur proximal d’INSL3. Cette région est toutefois dépourvue d’un élément de réponse aux androgènes consensus, ce qui suggère un mécanisme d’action indirect. Enfin, nous démontrons que le mono-(2-éthylhexyl) phtalate, le métabolite actif du perturbateur endocrinien DEHP, réprime aussi la transcription d’Insl3 dans les cellules de Leydig en antagonisant l’action de la dyade T/AR. Nous démontrons que l’estradiol (E2) réduit le niveau d’ARNm d’Insl3 dans les cellules de Leydig MA-10. Nos résultats démontrent qu’E2 réduit l’activité des promoteurs humain et murin d’Insl3/INSL3. Nous avons circonscrit la région répondant à l’E2 sur le promoteur proximal du promoteur humain d’INSL3. Cette région ne contient pas d’élément consensus de réponse aux estrogènes. Ceci indique que le mécanisme de répression est indirect. Conformément à cela, nous avons noté que la réponse à l’E2 est perdue lorsqu’une mutation est introduite au niveau des sites de liaisons des récepteurs nucléaires NUR77 et SF1. Enfin, nous démontrons que l’effet de l’exposition à l’E2 peut être renversé par un traitement conjoint avec de la testostérone, un activateur de la transcription d’Insl3. Malheureusement, les travaux n’ont pu être complétés dans le cadre de la présente thèse puisque la lignée cellulaire utilisée comme modèle, la lignée MA-10, a cessé de répondre aux divers stimuli. Néanmoins, les données présentées procurent d’importantes nouvelles perspectives sur la régulation de la transcription d’Insl3/INSL3 dans les cellules de Leydig, sur le mode d’action des phtalates et suggèrent des pistes de recherche à venir. La présente thèse contribue ainsi à la somme des savoirs qui permettra de comprendre comment le DEHP vient inhiber la sécrétion de T et d’INSL3.

Le syndrome X-fragile, la première cause de retard mental héréditaire, est causé dans la majorité des cas par l'expansion d'une séquence répétée située dans la région 5' non-traduite du gène FMR1. Cette expansion entraîne l'inactivation du gène et l'absence des protéines FMR1 (6 isoformes) est directement responsable des phénotypes observés chez les patients. L'anticorps monoclonal 1C3, disponible depuis près d'une décennie, a permis l'étude de la protéine sous tous ses aspects ou presque. Cependant, il a été montré récemment que cet anticorps détecte aussi la protéine homologue FXR1. La contribution de cette réaction croisée au signal observé n'a pas été quantifiée mais représente probablement une proportion faible mais non négligeable selon la technique utilisée. Nous avons utilisé deux techniques en parallèle pour obtenir de nouveaux anticorps. Tout d'abord, nous avons tenté la sélection de fragments d'anticorps par la technologie du ?phage display?. Nous avons aussi entrepris la création de nouveaux hybridomes en injectant la protéine FMR1 purifiée à des souris Balb/C. Nous avons obtenu 23 lignées d'hybridomes parmi lesquelles 4 types d'anticorps différents ont été identifiés. La caractérisation de ces anticorps a débuté par l'identification de leur classe d'IgG et la chaîne lègère utilisée. Nous avons aussi vérifié leur spécificité et identifié l'épitope reconnu. L'anticorps produit par l'hybridome 14D3 est ressorti comme étant le plus intéressant compte tenu de sa spécificité et de la possibilité de le purifier. Nous avons évalué son efficacité en immunobuvardage, en immunofluorescence, en immunohistochimie, en ELISA et en immunoprécipitation. L'anticorps 14D3 s'est avéré un excellent anticorps pour toutes ces techniques à l'exception de l'immunoprécipitation. Certains de nos résultats diffèrent des travaux effectués avec l'anticorps 1C3. Cette différence est peut-être attribuable à la différence de spécificité des anticorps ou au fait que l'épitope reconnu par notre anticorps peut être absent de certaines isoformes. Nous avons aussi utilisé les anticorps 14D3 et 11F7 pour préparer un test de dosage par ELISA-sandwich. L'ELISA a été mis au point sur la protéine purifiée. Les tests effectués sont reproductibles et la précision de la courbe standard est excellente (R2 > 0.98).

La 3-alpha hydroxystéroïde déshydrogénase de type 3 humaine (3α-HSD3) a un rôle essentiel dans l’inactivation de la 5α-dihydrotestostérone (5α-DHT). Par une combinaison de la mutagenèse, de la cinétique et de la cristallographie par rayon-X, nous démontrons que la mutation de la Valine54 à la Leucine54 dans la 3α-HSD3 réduit sa capacité d’inactivation de la 5α-DHT et améliore une activité 20-alpha hydroxystéroïde déshydrogénase. Par ailleurs, la structure cristalline de la 3α-HSD3 en complexe avec la 5α-androstane-3,17-dione/épi-androstérone (A-dione/epi-ADT) a été obtenue par la co-cristallisation, avec la 5α-DHT, ce qui implique que la 5α-DHT a des modes de liaison alternative avec la 3α-HSD3. La suppression de l’expression de la 3α-HSD3 par des ARNsi ne fait pas seulement qu’augmenter la concentration de la 5α-DHT dans les cellules MCF7, mais elle diminue aussi la prolifération cellulaire des cellules MCF7 en présence de 5α-DHT. Le récepteur des estrogènes de type alpha (ERα) contrôle le développement sexuel et les fonctions reproduction. Nous avons mis en place une méthode de purification du fragment de l’ERα incluant son domaine de liaison à l’ADN et de son domaine de liaison au ligand (DBD-LBD). La cristallogenèse préliminaire de l’ERα DBD-LBD en complexe avec les éléments de réponse à l’estrogène a été effectuée. Par ailleurs, nous avons rapporté une méthode de purification simple et efficace pour le domaine de liaison au ligand de l’ERα. / Human 3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase type 3 (3α-HSD3) has an essential role in the inactivation of androgen 5α-dihydrotestosterone (5α-DHT). By a combination of mutagenesis, kinetics and X-ray crystallography, we demonstrate that the mutation of Valine54 to Leucine54 in 3α-HSD3 reduces its 5α-DHT inactivation ability and enhances a 20-alpha hydroxysteroid dehydrogenase activity. Furthermore, the crystal structure of 3α-HSD3 in complex with 5α-androstane-3,17-dione/epi-androsterone (A-dione/epi-ADT) is obtained by co-crystallization with 5α-DHT, which implies that 5α-DHT has the alternative binding mode within 3α-HSD3. Suppression of 3α-HSD3 expression by specific siRNA not only increases 5α-DHT concentration in MCF7 cells, but also decreases MCF7 cell proliferation in the presence of 5α-DHT. Estrogen receptor alpha (ERα) controls sexual development and reproductive functions. We establish a purification protocol of ERα fragment including its DNA binding domain and ligand binding domain (DBD-LBD). Preliminary crystallogenesis of ERα DBD-LBD in complex with estrogen response elements is carried out. Additionally, we report a simple and efficient purification method for ERα LBD.

La surexpression du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) et/ou l’amplification du gène HER2 sont des facteurs prédictifs du cancer du sein. Avec l’introduction du traitement ciblé au trastuzumab, l’évaluation fiable d’HER2 est devenue essentielle. Malheureusement, jusqu’à 50% des patientes HER2-positives développent une résistance envers ce médicament. Les objectifs étaient : 1) déterminer la façon la plus fiable et économique pour évaluer le statut HER2 (cohorte de 521 cas consécutifs de cancer du sein); 2) examiner l’association entre deux polymorphismes d’HER2 (Ile655Val et Ala1170Pro), la consommation de tabac et d’alcool et la réponse au trastuzumab (cohorte de 236 patientes HER2-positives traitées au trastuzumab). De plus, dans une étude pilote, nous avons examiné l’association entre les patrons de méthylation d’ADN dans la tumeur et la réponse au trastuzumab (cohorte de 12 patientes HER2-positives traitées au trastuzumab). Le statut HER2 a été évalué par immunohistochimie (IHC), hybridation fluorescente in situ (FISH) et essai TaqMan. Nous avons comparé le statut HER2 déterminé par FISH sur lame complète (LC, un tissu par lame) et par matrice tissulaire (TMA, 60 tissus par lame), ainsi que le statut HER2 évalué par IHC et FISH sur le bloc ayant servi pour le diagnostic (bloc diagnostique) et sur un bloc choisi aléatoirement (bloc aléatoire). Les informations cliniques ont été obtenues dans les dossiers médicaux, celles sur la consommation de tabac et d’alcool par des questionnaires validés. Le patron de méthylation d’ADN a été évalué en utilisant la micropuce Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. La concordance générale entre le statut HER2 déterminé par FISH sur LC et TMA était de 98,2%, et celle entre les blocs diagnostiques et aléatoires était de 98,0% au FISH et de 93,6% à l’IHC. La consommation de tabac et l’allèle Val étaient associés à une moins bonne réponse, tandis que la consommation d’alcool était associée à une meilleure réponse. Le patron de méthylation dans les tumeurs de patientes atteintes d’un cancer du sein HER2- positif qui ont développé une résistance au trastuzumab diffère de celui des patientes qui répondent au traitement. Cependant, ces résultats semblent dépendre de la méthode bioinformatique d’analyse utilisée. Nous concluons que l’évaluation d’HER2 par FISH sur TMA représente une méthode fiable et économique. Les taux de concordances obtenus par FISH, mais pas ceux observés à l’IHC, satisfont l’exigence du Collège des pathologistes américains d’au moins 95% de concordance entre les résultats obtenus avec la méthode de référence et la nouvelle méthode. Le tabagisme, la consommation d’alcool et le polymorphisme HER2 Ile655Val pourraient influencer la réponse au traitement au trastuzumab. / The overexpression of the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) and/or HER2 gene amplification are predictive factors in breast cancer. Following the HER2-targeted treatment with trastuzumab, the reliable evaluation of HER2 has become essential. Unfortunately, up to 50% of HER2-positive breast cancer patients develop resistance towards this drug. The objectives were: 1). To determine the most reliable and economical method to evaluate HER2 status (cohort of 521 consecutive breast cancer cases); 2). To examine the association between tobacco and alcohol consumption, and two HER2 polymorphisms (Ile655Val and Ala1170Pro), and the response to trastuzumab (cohort of 236 HER2-positive breast cancer patients treated with trastuzumab). Moreover, in a pilot study, we explored the association between genome-wide DNA methylation patterns in breast cancer tissues and the response to trastuzumab (cohort of 12 breast cancer patients treated with trastuzumab). HER2 status was evaluated by immunohistochemistry (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH), and TaqMan assay. We compared HER2 status determined by FISH on whole tissue (WT, one tissue per slide) section and tissue microarray (TMA, 60 tissues per slide) section, and HER2 status evaluated by IHC and FISH on the block used for diagnostic (diagnostic block) and on a randomly chosen additional block (random block). Clinicopathological information were assessed by review of medical records, tobacco and alcohol consumption by an administered validated questionnaire. DNA methylation patterns were evaluated using the Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Overall concordance between HER2 status determined by FISH on WT and TMA sections was 98.2% and that between diagnostic and random blocks was 98.0% for FISH and 93.6% for IHC. Tobacco consumption and the Val allele were associated with a worse response, whereas alcohol consumption was associated with a better response. Methylation pattern in tumor tissues of HER2-positive breast cancer patients who acquired resistance to trastuzumab treatment differed from that of HER2-positive breast cancer patients who responded to trastuzumab treatment. However, this observation seemed to depend upon the method of bioinformatics analysis used. We conclude that FISH performed on TMA section represents a reliable and economical method for the evaluation of HER2. Results obtained by FISH, but not those obtained by IHC, fulfill the recommendations of the College of American Pathologists of concordance greater than 95% between the reference method and the new method. Tobacco use, alcohol consumption and Ile655Val HER2 polymorphism might influence the response to trastuzumab treatment.