Hepatocarcinoma (HCC) é o mais comum tumor maligno primário do fígado. Aurora A é importante durante o ciclo celular, atuando na maturação centrossômica e sua separação, entrada em mitose, montagem de fuso bipolar, alinhamento dos cromossomos na placa metafásica e citocinese. Expressão alterada de Aurora A tem sido associada com o desenvolvimento do tumor e sua superexpressão ocorre em 60% dos HCCs. Inibidores de Aurora quinases têm sido desenvolvidos como drogas antitumorais. 4(4`-Benzamidoanilina)-6,7dimetoxiquizanoline, BADIM, é um recém desenvolvido inibidor da Aurora. Nosso estudo investigou os efeitos de BADIM na linhagem celular HepG2, derivada de HCC, quando tratada com 300, 600 e 1200nm de BADIM por 24 e 48h. Observamos inibição de proliferação, aumento de células tetraplóides, binucleadas e gigantes, bloqueio em G2/M do ciclo celular, alterações nos microtúbulos, mitoses atípicas e apoptose. Por conseguinte, este inibidor é um agente promissor para estudos em HCC, pois atua em pontos críticos relacionados com o processo de tumorigênese. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common primary malignant tumor of liver. Aurora A is important during cell cycle, including centrosome maturation and separation, mitotic entry, bipolar-spindle assembly, chromosome alignment on metaphase plate and cytokinesis. Altered expression of Aurora A has been associated with tumor development and its overexpression occurs in 60% of HCC. Aurora kinases inhibitors have been developed as antitumoral drugs. 4(4`-Benzamidoanilino)-6,7-dimethoxiquizanolina, BADIM, is a new Aurora inhibitor. Our study aimed investigates the BADIM effects on HepG2 cell line, derivates of HCC, when treated in 300, 600 and 1200nM for 24 and 48h. We observed inhibition of cell proliferation, increase of tetraploids, binucleated and giant cells, arrest in G2/M cell cycle, microtubules alterations, aberrant cell divisions and apoptosis. Therefore this inhibitor is a promising agent for studies in HCC, since it acts at critical points related to tumorigenesis.

La kinase Aurora B appartient au complexe des protéines passagères. Ce complexe est impliqué dans la régulation de la condensation, constriction et ségrégation des chromosomes, ainsi que dans la cytokinèse. Son rôle est donc crucial pour prévenir la formation de cellules cancéreuses. Cependant, l'étude de la fonction précise d'Aurora B dans chacune des phases de la mitose est limitée par la durée de celle-ci, et par le manque de spécificité des inhibiteurs existants. Nous avons donc développé une stratégie basée sur la photo-inactivation de la kinase par le chromophore Killer-Red, fusionné à la protéine. L'émission locale de ROS après irradiation, permet alors la photo-inactivation spécifique et temporelle d'Aurora B. La photo-inactivation d'Aurora B avant anaphase aboutie soit à un arrêt de la mitose, soit à la régression du sillon de division, provoquée par l'entrée en anaphase en présence de chromosomes retardés. La photo-inactivation d'Aurora B en début d'anaphase a pour conséquence la régression du sillon de division en cytokinèse ; apportant la première indication directe de l'implication d'Aurora B dans le fuseau mitotique en cytodiérèse. De façon surprenante, la photo-inactivation de la kinase au niveau du corps résiduel, après constriction du sillon de division, n'affecte pas l'abscission. La photo-inactivation d'Aurora B n'affecte pas la localisation des autres membres du complexe des protéines passagères, indiquant que la kinase n'est pas impliquée dans la dynamique du complexe. Les résultats obtenus montrent sans aucun doute l'implication d'Aurora B dans chacune des phases de la mitose, suggérant que la phosphorylation par Aurora B de ses substrats permet le controle de la division cellulaire. / Aurora B is a mitotic kinase involved in chromosome condensation and segregation as well as cytokinesis. Aurora B together with INCENP, Survivin, TD60 and Borealin constitute the chromosome passenger protein complex (CPC), which localizes to the inner centromeres all through metaphase, transfers to the spindle midzone in anaphase and to the midbody in cytokinesis. In order to dissect the mitotic kinase functions of Aurora B as well as its role as an integral part of the CPC in a temporal manner, we have used chromophore assisted light inactivation (CALI) approach. We have combined miRNA ablation of endogenous Aurora B with ectopic expression of miRNA resistant Aurora B fused to the photosensitizer Killer Red (AurB-KR) in HeLa cells. Irradiation at distinct phases of mitosis led to photobleaching of the Killer Red protein, accompanied by emission of reactive oxygen species (ROS) resulting in the photoinactivation of the fused Aurora B. Photoinactivation before anaphase led to either mitotic arrest or cleavage furrow regression due to entry into anaphase with chromosome bridges. CALI at early anaphase also led to cytokinesis failure underlying the role of Aurora B in central spindle function. Consistent with the effects of dominant negative dead-kinase Aurora B, upon CALI the localisation of Incenp, Survivin and Borealin was not affected. Importantly, photoinactivation of Aurora B-KR following cleavage furrow constriction at the midbody had no effect on the completion of abscission. These data, demonstrate unequivocally the distinct roles Aurora B exerts at each phase of mitosis and in particular suggest that Aurora B substrate phosphorylation from metaphase to anaphase is implicated in the spatio-temporal control of cell division and cytokinesis.

Hepatocarcinoma (HCC) é o mais comum tumor maligno primário do fígado. Aurora A é importante durante o ciclo celular, atuando na maturação centrossômica e sua separação, entrada em mitose, montagem de fuso bipolar, alinhamento dos cromossomos na placa metafásica e citocinese. Expressão alterada de Aurora A tem sido associada com o desenvolvimento do tumor e sua superexpressão ocorre em 60% dos HCCs. Inibidores de Aurora quinases têm sido desenvolvidos como drogas antitumorais. 4(4`-Benzamidoanilina)-6,7dimetoxiquizanoline, BADIM, é um recém desenvolvido inibidor da Aurora. Nosso estudo investigou os efeitos de BADIM na linhagem celular HepG2, derivada de HCC, quando tratada com 300, 600 e 1200nm de BADIM por 24 e 48h. Observamos inibição de proliferação, aumento de células tetraplóides, binucleadas e gigantes, bloqueio em G2/M do ciclo celular, alterações nos microtúbulos, mitoses atípicas e apoptose. Por conseguinte, este inibidor é um agente promissor para estudos em HCC, pois atua em pontos críticos relacionados com o processo de tumorigênese. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common primary malignant tumor of liver. Aurora A is important during cell cycle, including centrosome maturation and separation, mitotic entry, bipolar-spindle assembly, chromosome alignment on metaphase plate and cytokinesis. Altered expression of Aurora A has been associated with tumor development and its overexpression occurs in 60% of HCC. Aurora kinases inhibitors have been developed as antitumoral drugs. 4(4`-Benzamidoanilino)-6,7-dimethoxiquizanolina, BADIM, is a new Aurora inhibitor. Our study aimed investigates the BADIM effects on HepG2 cell line, derivates of HCC, when treated in 300, 600 and 1200nM for 24 and 48h. We observed inhibition of cell proliferation, increase of tetraploids, binucleated and giant cells, arrest in G2/M cell cycle, microtubules alterations, aberrant cell divisions and apoptosis. Therefore this inhibitor is a promising agent for studies in HCC, since it acts at critical points related to tumorigenesis.

Mit einem medianen Überleben von 14 bis 16 Monaten und einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 5 % zählt das Glioblastoma multiforme (GBM) zu den aggressivsten Tumoren des zentralen Nervensystems (Cloughesy et al., 2014; Batash et al., 2017; Guberina et al., 2020). Das GBM, auch als WHO-Grad IV-Astrozytom bezeichnet, ist mit > 50 % aller glialen Tumoren der häufigste maligne hirneigene Tumor (Ohgaki und Kleihues, 2005). Aufgrund ihrer infausten Prognose ist eine Weiterentwicklung und Optimierung der aktuellen Leitlinientherapie sowie die Entwicklung neuartiger Therapiekonzepte für Primärtumore und Rezidive unentbehrlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Therapieansätze, wie elektrische Wechselfelder (tumor treating fields, TTFields) und der Aurorakinaseinhibitor AZD1152 sowie die konventionelle, in der Leitlinie des Primärtumors verankerte Radiotherapie eingesetzt. Während eine Strahlentherapie in erster Linie durch die Induktion von DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüchen wirkt, beruht der Wirkmechanismus der TTFields auf eine Störung der Dipol-gesteuerten Schritte während der Zellteilung. Dies führt folglich zu einer Arretierung des Zellzyklus in der G2/M- und G1/S-Phase. Sofern eine Reparatur an den checkpoints nicht möglich ist, erfolgt die Überleitung der Zelle in die Apoptose (Suzuki et al., 2003; Wilson et al., 2014; Fontana et al., 2015; Gerelchuluun et al., 2015). Die TTFields kamen mittels des InovitroTM-Systems zum Einsatz, die insbesondere inhibierend auf die M-Phase des Zellzyklus wirken (Gutin und Wong, 2012; Saria und Kesari, 2016). Für das Glioblastoma multiforme wurde dabei eine spezifische Frequenz von 200 kHz und eine Feldintensität von 1,7 V/cm bestimmt, welche das außerhalb des Zielgebiets liegende Gewebe schont (Kirson et al., 2009; Fabian et al., 2019). Für Primärtumore eines Glioblastoma multiforme konnte in der EF-14-Studie bereits ein signifikant verlängertes Überleben durch TTFields bestätigt werden, während für das Rezidiv in der EF-11-Studie lediglich eine Verbesserung der Lebensqualität erreicht wurde jedoch keine Verlängerung der Überlebenszeit (Stupp et al., 2012; Stupp et al., 2017). Ein vielversprechender Therapieansatz scheint außerdem der Einsatz des Aurora B-Kinase-Inhibitors AZD1152 zu sein. Als enzymatischer Teil des chromosomale passenger complex (CPC) liegt die Hauptaufgabe der Aurora B-Kinase in der Kontrolle der Mitose des Zellzyklus (Vader et al., 2006). Resultierend aus der Aufhebung des genannten Kontrollmechanismus mittels AZD1152 (Barasertib™) kommt es zum Anstieg polyploider Zellen, wodurch eine Überleitung in die Apoptose erfolgt (Zekri et al., 2016). Schlussfolgernd erscheint in Anbetracht der Einzeleffekte von Radiotherapie, TTFields und Aurora B-Kinase-Inhibierung deren kombinierter Einsatz wesentlich bedeutsam, wodurch der vorliegenden Arbeit die Hypothesen eines überwiegenden Effekts der Dreifachkombination im Vergleich zu der Einzeltherapie und den jeweiligen Zweifachkombinationsbehandlungen zugrunde liegen. Für die drei in dieser Arbeit eingesetzten Primärkulturen eines Glioblastoma multiforme Rezidivs konnte für die Dreifachkombinationstherapie gegenüber den Einzelbehandlungen ein hoch bis höchst signifikant additiv-zytotoxischer Effekt nachgewiesen werden. Im Mittel gelang eine Reduktion der Lebendzellzahl auf 20 – 34 % vitaler Zellen. Auch in Bezug auf die einzelnen Zweifachkombinationen wurden signifikante, hoch signifikante sowie ein höchst signifikantes Ergebnis für die Dreifachkombinationstherapie erzielt. Lediglich für die TTFields/AZD1152-Kombinationsbehandlung der Primärkultur HT18328-3 traf dies nicht zu. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wurden ergänzend qualitative, zellmorphologische Änderungen visualisiert. Während sich in den Einzelbehandlungen sowie den Zweifachkombinationen Veränderungen der Zell- und Kerngröße sowie eine Kernfragmentierung andeuteten, waren diese Effekte in der Dreifachkombination deutlicher ausgeprägt. Die bereits quantitativ detektierten synergistisch zytotoxischen Effekte konnten durch lichtmikroskopische Bilder verifiziert werden. Langfristiges Ziel dieser Arbeit ist, die Kombinationstherapie im Rahmen von klinischen Studien zu testen. Jedoch sollte, aufgrund der insgesamt hohen inter- und intratumoralen Heterogenität des Glioblastoma multiforme im Vorfeld zur Etablierung des klinischen Einsatzes das Verhalten weiterer Primärkulturen untersucht werden. Ebenso erscheint die Berücksichtigung der vorausgehenden Behandlung der Patienten sowie des Ploidiegrades der Primärkultur als relevant, um ein unterschiedliches Therapieansprechen sowie mögliche Resistenzmechanismen nachzuvollziehen. Ferner sollte ein neoadjuvanter Einsatz des AZD1152 weiter verifiziert werden, denn eine Verbesserung der Radiosensibilität, resultierend in einem gesteigerten Therapieansprechen, konnte bereits aufgezeigt werden (Tao et al., 2009). Zur Minimierung der systemischen Nebenwirkungen des AZD1152 (Barasertib™) wäre die Etablierung einer gezielten, lokalen Anwendung im Sinne einer intraoperativen oder minimalinvasiven Applikation zielführend.:1 Einleitung 1.1 Glioblastoma multiforme: Definition, Ätiologie, Inzidenz 1.1.1 Symptome und Diagnostik 1.2 Molekulare Klassifizierung 1.2.1 Unterteilung in primäre und sekundäre Glioblastome mittels des IDH-Status 1.2.2 Molekulare Marker primärer Glioblastome 1.2.4 Die Methylguanin-Methyltransferase (MGMT) 1.3 Konventionelle Therapie 1.3.1 Leitlinie Primärtumor – Leitlinie Rezidiv 1.3.2 Radiotherapie 1.4 Neuartige Therapiekonzepte 1.4.1 Biologischer Hintergrund 1.4.2 Aurorakinase-Inhibitoren 1.4.3 Tumor Treating Fields (TTFields) 1.5 Zielstellung 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Antikörper 2.1.2 Chemikalien 2.1.3 Geräte 2.1.4 Lösungen 2.1.5 Medien 2.1.6 Kits 2.1.7 Primärkulturen 2.1.8 Software 2.1.9 Statistik 2.1.10 Verbrauchsmaterialien 2.2 Methoden 2.2.1 Zellkultivierung allgemein 2.2.2 Passagieren adhärenter Zellen . 2.2.3 Kultivierung von primärem Patientenmaterial 2.2.4 Kryokonservierung und Rekultivierung 2.2.5 Bestimmung der Lebendzellzahl – Neubauer-Zählkammer 2.2.6 Durchflusszytometrische Analyse 2.2.7 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels PI 2.2.8 Bestimmung des DNA-Gehalt/Ploidiegrades mittels PI 2.2.9 Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung von Glioblastomzellen 2.2.10 Beschichtung von Glascoverslips 2.2.11 Bestrahlung mittels Röntgensystem 2.2.12 Titration der Bestrahlungsdosis 2.2.13 Titration einer effektiven Aurora B-Kinase-Inhibitorkonzentration 2.2.14 In vitro-Applikation der TTFields 2.2.15 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 3 Ergebnisse 3.1 Wahl der Kontrollgruppe 3.2 Typisierung der verwendeten Primärkulturen 3.2.1 Befunde der Pathologie des UKD 3.2.2 Immunphänotypisierung 3.3 Titration der AZD1152-Konzentration 3.3.1 Titration der AZD1152-Konzentration an der Primärkultur HT16360-1 3.3.2 Titration der AZD1152-Konzentration an der Primärkultur HT18328-3 3.3.3 Titration der AZD1152-Konzentration an der Primärkultur HT18816 3.4 Dosistitration der Radiotherapie 3.4.1 Titration der Bestrahlungsdosis an HT16360-1 3.4.2 Titration der Bestrahlungsdosis an HT18328-3 3.4.3 Titration der Bestrahlungsdosis an HT18816 3.5 Kombinationstherapie mit Radiotherapie, TTFields und AZD1152 3.5.1 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie anhand der Lebendzellzahl 3.5.2 Zytoreduktiver Effekt der Kombinationstherapie 3.5.3 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie anhand des Ploidiegrades 3.5.4 Qualitativer Effekt der Kombinationstherapie 4 Diskussion 4.1 In vitro-Charakterisierung der Primärkulturen 4.2 Radiotherapie . 4.3 Neuartige Behandlungsoptionen 4.3.1 TTFields 4.3.2 Aurora B-Kinase-Inhibitor AZD1152 4.4 Kombinierte Behandlungsmethoden – Zwei- und Dreifachtherapie 5 Zusammenfassung Abstract Literaturverzeichnis Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang / With a median survival of 14 to 16 months and a 5-year survival rate of less than 5 %, glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most aggressive tumours of the central nervous system (Cloughesy et al., 2014; Batash et al., 2017; Guberina et al., 2020). GBM, also known as WHO grade IV astrocytoma, is the most common malignant brain tumor with > 50% of all glial tumors (Ohgaki und Kleihues, 2005). Due to its dismal prognosis, further development and optimisation of the current guideline therapy as well as the development of novel therapeutic concepts for primary tumours and recurrences is indispensable. Within the framework of this work, novel therapeutic approaches such as alternating electric fields (tumor treating fields, TTFields) and the aurorakinase inhibitor AZD1152 as well as conventional radiotherapy anchored in the guideline of the primary tumor were applied. While radiotherapy primarily works by the induction of DNA single and double strand breaks, the mechanism of action of TTFields is based on a disruption of the dipole-controlled steps during cell division. Consequently, this leads to a locking of the cell cycle in the G2/M and G1/S phase. If repair at the checkpoints is not possible, the cell is transferred to apoptosis (Suzuki et al., 2003; Wilson et al., 2014; Fontana et al., 2015; Gerelchuluun et al., 2015). The TTFields were used by means of the InovitroTM system, which has a particularly inhibitory effect on the M-phase of the cell cycle (Gutin und Wong, 2012; Saria und Kesari, 2016). For glioblastoma multiforme, a specific frequency of 200 kHz and a field intensity of 1.7 V/cm was determined, which spares the tissue outside the target area (Kirson et al., 2009; Fabian et al., 2019). For primary tumours of glioblastoma multiforme a significantly prolonged survival could already be confirmed by TTFields in the EF 14 study, whereas for recurrent tumours only an improvement in quality of life was achieved in the EF 11 study (Stupp et al., 2012; Stupp et al., 2017). The use of the Aurora B kinase inhibitor AZD1152 also appears to be a promising therapeutic approach. As an enzymatic part of the chromosomal passenger complex (CPC), the main task of the aurora B-kinase is to control cell cycle mitosis (Vader et al., 2006). As a result of the removal of the above-mentioned control mechanism by means of AZD1152 (BarasertibTM), there is an increase in polyploid cells, which leads to a transition to apoptosis (Zekri et al., 2016). In conclusion, considering the single effects of radiotherapy, TTFields and Aurora B-kinase inhibition, their combined use seems to be of considerable importance. Therefore, the present study is based on the hypotheses of a predominant effect of the triple combination compared to the single therapy and the respective dual combination treatments. For the three primary cultures of a glioblastoma multiforme recurrence used in this work, a high to highly significant additive cytotoxic effect could be demonstrated for the triple combination therapy compared to the single treatments. On average, a reduction in the number of living cells to 20 – 34 % vital cells was achieved. Significant, high significant and highly significant results were also achieved with regarding to the individual dual combination treatments. Only for the TTFields/AZD1152 combination treatment of the primary culture HT18328-3 this was not true. Confocal laser scanning microscopy was used to visualise qualitative, cell morphological changes. While changes in cell and core size as well as nucleus fragmentation were indicated in the single treatments as well as in the dual combination treatments, these effects were more pronounced in the triple combination. The already quantitatively detected synergistic cytotoxic effects could be verified by light microscopic images. The long-term goal of this work is to test the combination therapy in clinical trials. However, due to the overall high inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma multiforme, the behaviour of further primary cultures should be investigated in advance of establishing clinical use. In addition, consideration of the previous treatment of the patients as well as the degree of ploidy of the primary culture seems to be relevant to understand a different response to therapy and possible resistance mechanisms. Furthermore, a neoadjuvant use of AZD1152 should be further verified, as an improvement in radiosensitivity resulting in an increased response to therapy has already been demonstrated (Tao et al., 2009). In order to minimize the systemic side effects of AZD1152 (BarasertibTM), the establishment of a targeted, local application in the sense of an intraoperative or minimally invasive application would be beneficial.:1 Einleitung 1.1 Glioblastoma multiforme: Definition, Ätiologie, Inzidenz 1.1.1 Symptome und Diagnostik 1.2 Molekulare Klassifizierung 1.2.1 Unterteilung in primäre und sekundäre Glioblastome mittels des IDH-Status 1.2.2 Molekulare Marker primärer Glioblastome 1.2.4 Die Methylguanin-Methyltransferase (MGMT) 1.3 Konventionelle Therapie 1.3.1 Leitlinie Primärtumor – Leitlinie Rezidiv 1.3.2 Radiotherapie 1.4 Neuartige Therapiekonzepte 1.4.1 Biologischer Hintergrund 1.4.2 Aurorakinase-Inhibitoren 1.4.3 Tumor Treating Fields (TTFields) 1.5 Zielstellung 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Antikörper 2.1.2 Chemikalien 2.1.3 Geräte 2.1.4 Lösungen 2.1.5 Medien 2.1.6 Kits 2.1.7 Primärkulturen 2.1.8 Software 2.1.9 Statistik 2.1.10 Verbrauchsmaterialien 2.2 Methoden 2.2.1 Zellkultivierung allgemein 2.2.2 Passagieren adhärenter Zellen . 2.2.3 Kultivierung von primärem Patientenmaterial 2.2.4 Kryokonservierung und Rekultivierung 2.2.5 Bestimmung der Lebendzellzahl – Neubauer-Zählkammer 2.2.6 Durchflusszytometrische Analyse 2.2.7 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels PI 2.2.8 Bestimmung des DNA-Gehalt/Ploidiegrades mittels PI 2.2.9 Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung von Glioblastomzellen 2.2.10 Beschichtung von Glascoverslips 2.2.11 Bestrahlung mittels Röntgensystem 2.2.12 Titration der Bestrahlungsdosis 2.2.13 Titration einer effektiven Aurora B-Kinase-Inhibitorkonzentration 2.2.14 In vitro-Applikation der TTFields 2.2.15 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 3 Ergebnisse 3.1 Wahl der Kontrollgruppe 3.2 Typisierung der verwendeten Primärkulturen 3.2.1 Befunde der Pathologie des UKD 3.2.2 Immunphänotypisierung 3.3 Titration der AZD1152-Konzentration 3.3.1 Titration der AZD1152-Konzentration an der Primärkultur HT16360-1 3.3.2 Titration der AZD1152-Konzentration an der Primärkultur HT18328-3 3.3.3 Titration der AZD1152-Konzentration an der Primärkultur HT18816 3.4 Dosistitration der Radiotherapie 3.4.1 Titration der Bestrahlungsdosis an HT16360-1 3.4.2 Titration der Bestrahlungsdosis an HT18328-3 3.4.3 Titration der Bestrahlungsdosis an HT18816 3.5 Kombinationstherapie mit Radiotherapie, TTFields und AZD1152 3.5.1 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie anhand der Lebendzellzahl 3.5.2 Zytoreduktiver Effekt der Kombinationstherapie 3.5.3 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie anhand des Ploidiegrades 3.5.4 Qualitativer Effekt der Kombinationstherapie 4 Diskussion 4.1 In vitro-Charakterisierung der Primärkulturen 4.2 Radiotherapie . 4.3 Neuartige Behandlungsoptionen 4.3.1 TTFields 4.3.2 Aurora B-Kinase-Inhibitor AZD1152 4.4 Kombinierte Behandlungsmethoden – Zwei- und Dreifachtherapie 5 Zusammenfassung Abstract Literaturverzeichnis Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang

Das Glioblastom ist der häufigste hirneigene Tumor des Erwachsenen und mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 5 % eine der aggressivsten Hirntumorerkrankungen (Batash et al., 2017). Verbunden mit einer schlechten Prognose und geringen Remissionsraten ergibt sich die Notwendigkeit, bestehende Therapieoptionen zu optimieren und zu erweitern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das vor einigen Jahren entwickelte und aktuell in klinischen Studien angewandte Konzept der Therapie von Malignomen mit elektrischen Wechselfeldern, den sog. Tumor Treating Fields (TTFields), aufgegriffen. Basis der anti-tumoralen Wirkung der im Rahmen von Glioblastom-Studien applizierten TTFields bildet eine Tumor-spezifische Frequenz von 200 kHz sowie geringe Intensitäten, die einen nebenwirkungsarmen anti-mitotischen Effekt erzielen (Kirson et al., 2004; Kirson et al., 2007; Clark et al., 2017; Porat et al., 2017). Dieser resultiert sowohl aus alternierenden elektrischen Feldern, die während der Metaphase über eine Irritation des Dipolmoments von Tubulin-Untereinheiten die Assemblierung des Spindelapparates inhibieren, als auch aus inhomogenen elektrischen Feldern, die während der Telophase die Trennung der Tochterzellen behindern. Mit dieser Behandlungsoption konnten schon einige gute Ergebnisse für die Behandlung von Glioblastomen in klinischen Studien erreicht werden (Stupp et al., 2017). Eine weitere anti-mitotische Therapieoption stellt die Inhibierung der Aurora B Kinase mittels AZD1152 dar. Die Aurora B Kinase ist Teil des Chromosomal Passenger Complex (CPC), der bei Inhibierung der Kinase seine Kontrollfunktionen während der Mitose und Zytokinese nicht wahrnehmen kann. Diese fehlende Kontrolle führt zu Polyploidie, die einen Zelltod verursachen kann (Wiedemuth et al., 2016). Aufgrund dieses ähnlichen biologischen Hintergrundes wurde zu Beginn dieser Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass eine kombinierte Therapie mittels TTFields und AZD1152 einen additiven zytotoxischen Effekt im Vergleich zur Monotherapie mit TTFields erzielen kann. Es konnte zunächst für die etablierte Zelllinie U87-MG ein signifikanter additiver Effekt in der Kombinationstherapie der TTFields mit AZD1152 im Vergleich zur alleinigen Therapie mittels TTFields nachgewiesen werden. Die mediane Tumorzellzahl konnte hierbei in der Kombinationstherapie um 60 % reduziert werden. Dieser additive Effekt konnte ebenfalls an zwei Primärkulturen reproduziert werden. Hierbei konnte die relative mediane Tumorzellzahl der Primärkultur HT18584 ebenfalls um 60 % in der Kombinationstherapie gesenkt werden. Diese tetraploide Zellreihe zeigte außerdem einen außergewöhnlich großen zytotoxischen Effekt bei der Behandlung mit AZD1152. Signifikant zeigte ebenso die Primärkultur HT12347 einen medianen Verlust von 56 % der Tumorzellen nach einer kombinierten Behandlung. Qualitativ und zellmorphologisch konnte mittels konfokaler Laser-Scanning- sowie Lichtmikroskopie die Akkumulation von mitotischen Defekten detektiert werden, die auch in den Monotherapien aber vor allem in der Kombinationstherapie zu finden waren. Die in der quantitativen Analyse gezeigte additive Zytotoxizität der Kombinationstherapie konnte hier nochmals visualisiert und bestätigt werden. Für eine klinische Phase I-Studie zur Überprüfung der Effektivität sollten zunächst weitere zellkulturtechnische Daten erfasst werden, um die Universalität der kombinierten Behandlung zu überprüfen. Weiterhin wäre die Entwicklung einer selektiven/lokalen Therapie mittels AZD1152 wünschenswert, um die Nebenwirkungen des Medikamentes abzumildern. Es sollte außerdem das im Rahmen dieser Arbeit detektierte sensitivere Ansprechen der tetraploiden Zelllinie HT18584 genauer untersucht werden, um eine potentiell prognostisch günstige Verbindung zwischen der Behandlung mit AZD1152 und tetraploiden Zellen herstellen zu können.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Glioblastoma multiforme – Definition, Inzidenz und Ätiologie 1 1.1.1 Symptomatik und Diagnostik des Glioblastoms 2 1.2 Molekulare Klassifizierung 3 1.2.1 Primäre und sekundäre Glioblastome und einige allgemeine Marker 3 1.2.2 Der MGMT-Status 5 1.3 Der eukaryotische Zellzyklus und sequentielle Kontrollpunkte 6 1.3.1 Der Chromosomal Passenger Complex (CPC) 8 1.3.2 Die Familie der Aurorakinasen 9 1.4 Therapie maligner Gliome 10 1.4.1 Standardtherapie eines Glioblastoms 10 1.4.2 Tumor Treating Fields (TTFields) – Biologischer Effekt und Studienlage 11 1.4.3 Aurora Kinase-Inhibitoren 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 15 2 METHODEN UND MATERIALIEN 17 2.1 Methoden 17 2.1.1 Zellkultivierung allgemein 17 2.1.2 Passagieren adhärenter Zellen 17 2.1.3 Kultivierung von primärem Patientenmaterial 18 2.1.4 Kryokonservierung und Rekultivierung eukaryotischer Zelllinien 18 2.1.5 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Neubauer-Zählkammer 19 2.1.6 Durchflusszytometrische Analyse 19 2.1.7 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Propidiumiodid (PI) 20 2.1.8 Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung von Glioblastomzellen 20 2.1.9 In vitro-Applikation der Tumor Treating Fields (TTFields) 21 2.1.10 Titration der effektiven Aurora B Kinase-Inhibitorkonzentrationen mittels PI 22 2.1.11 Titration inhibitorischer Temozolomidkonzen-trationen mittels AlamarBlue-Assay 23 2.1.12 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 23 2.2. Materialien 25 2.2.1 Geräte 25 2.2.2 Chemikalien und Reagenzien 25 2.2.3 Lösungen 26 2.2.4 Medien 27 2.2.5 Kommerzielle Kits 28 2.2.6 Antikörper 28 2.2.7 Software 28 2.2.8 Statistik 29 2.2.9 Zelllinien 29 3 ERGEBNISSE 30 3.1 Wahl des Designs der Kontrollgruppen 30 3.2 Typisierung der verwendeten Primärkulturen 32 3.2.1 Befunde der Pathologie des Universitätsklinikums Dresden 33 3.2.2 Immunphänotypisierung der Primärkultur HT18584 34 3.2.3 Immunphänotypisierung der Primärkultur HT12347 35 3.3 Titrationen mit AZD1152 36 3.3.1 Titration mit AZD1152 für die Primärkultur HT18584 36 3.3.2 Titration mit AZD1152 für die Primärkultur HT12347 37 3.4 Kombinationstherapie mittels AZD1152 und TTFields 38 3.4.1 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an U87-MG 39 3.4.2 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an HT18584 40 3.4.3 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an HT12347 41 3.4.4 Qualitativer Effekt der Kombinationstherapien 42 3.4.4.1 Die Kombinationstherapie mit U87-MG 43 3.4.4.2 Die Kombinationstherapie mit HT18584 44 3.4.5 Zytotoxischer Effekt der Kombinationstherapie an HT12347 45 3.5 Titrationen mit Temozolomid 47 3.5.1 Therapie mit Temozolomid an U87-MG 48 3.5.2 Therapie mit Temozolomid an Primärkulturen 48 4 DISKUSSION 52 4.1 Vorversuche 52 4.1.1 Wachstumsanalyse der Kontrollgruppen 52 4.1.2 Charakterisierung der Primärkulturen 53 4.2 Die neuen Behandlungsoptionen 54 4.2.1 Applikation der TTFields 54 4.2.2 Die Behandlung mit AZD1152 55 4.2.3 Die Kombinationstherapie 57 4.3. Die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) 59 5 ZUSAMMENFASSUNG 62 LITERATURVERZEICHNIS 64 TABELLENVERZEICHNIS 73 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 74 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 75 ANHANG 77 Anhang 1: Einverständniserklärung der Patienten 77 Anhang 2: Erlaubnis zur Nutzung der Patientendaten der Pathologie 78 Anhang 3: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 79 Anhang 4: Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Vorgaben 81

La première partie de cette thèse présente une modélisation des émissions aurorales de Jupiter dans l'ultraviolet. Le but de ce travail est de quantifier comment ces émissions permettent de contraindre l'énergie des électrons qui précipitent dans la haute atmosphère polaire de la planète. Deux types d'émissions sont étudiés : celle de la raie Lyman alpha de l'hydrogène atomique ainsi que celles de H2. Les précipitations d'électrons aurorales sont modélisées à l'aide d'un code de transport cinétique. Le profil et l'intensité de la raie H Lyman alpha sont obtenus avec un code de transfert radiatif. Des spectres synthétiques des émissions de H2 sont calculés. En étudiant la variabilité des raies en fonction de l'énergie des électrons nous montrons que seules des observations à très haute résolution permettront de contraindre fortement les précipitations d'électrons. La deuxième partie de cette thèse présente la première modélisation de l'émission H Lyman alpha d'un Jupiter chaud jamais réalisée. Si elle était détectée, cette raie permettrait de caractériser l'environnement des planètes extrasolaires. L'émission de l'étoile est beaucoup plus intense que celle de la planète, ce qui rend la détection de la raie planétaire très difficile. Les seules estimations de contraste qui avaient été réalisées jusqu'à présent découlaient d'extrapolations basées sur l'émission de Jupiter. Nous introduisons ici des outils appropriés au calcul des émissions des Jupiter chauds, en tenant compte des spécificités de leur haute atmosphère, et notamment leur forte ionisation et leurs températures qui dépassent les 10 000 K. Nous évaluons l'émission Lyman alpha de deux Jupiter chauds, en tenant compte de plusieurs sources d'excitation des particules : les émissions aurorales et thermiques sont calculées, ainsi que l'émission excitée par le rayonnement de l'étoile. Nous montrons que, dans le cas du Jupiter chaud HD 209458b, la détection de l'émission planétaire n'est pas possible avec les instruments actuels. En revanche la raie Lyman alpha du Jupiter chaud HD 189733b semble pouvoir être détectée avec l'instrument STIS du télescope spatial Hubble. / The first part of this thesis describes a modeling of the auroral emission of Jupiter in the ultraviolet. The aim of this work is to quantify how these emissions allow to constrain the energy of the electrons that precipitate in the upper atmosphere of the planet at polar latitudes. Two kinds of emissions are studied : the one of the Lyman alpha line of atomic hydrogen and those of H2. The auroral electron precipitation is modeled with a kinetic transport code. The H Lyman alpha line profile and intensity are obtained with a radiative transfer code. Synthetic spectra of H2 emissions are calculated. By studying the variability of the lines as a function of the energy of the precipitating electrons, we show that only high resolution observations will allow to put strong constraints on the electron precipitation. The second part of this thesis presents the first calculation of the H Lyman alpha emission of a hot Jupiter ever realized. If it were detected, this line would allow to constrain the environment of the extrasolar planets. The stars' emission is much more intense than that of the planet, which transforms the detection of the planetary line in a very difficult challenge. Up to now, the only estimations of contrast that have been realized are based on extrapolations of Jupiter's emission. Here we present tools that are adequate to calculate the emission of hot Jupiters. They take into account the particularities of their atmosphere, like their high ionization degree and their temperatures that exceed 10,000 K. We calculate the Lyman alpha emission of two hot Jupiters, by taking into account the auroral, thermal and dayglow contributions. In the case of the hot Jupiter HD 209458b, we show that current facilities do not allow to detect the planetary emission. On the other hand, the detection of the Lyman alpha line of the planet HD 189733b seems to be within reach of the Hubble Space Telescope.

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Foram analisados quatro tratamentos submetidos a reflorestamento com: Curauá (Ananas comosus var. erectifolius L.B.Smith), Paricá (Shizolobium var. amazonicum Huber ex Ducke) sob a forma de monocultivos, Paricá + curauá (Ananas comosus var. erectifolius L.B.Smith; Shizolobium var. amazonicum Huber ex Ducke); Paricá + Mogno + Freijó + Curauá (Shizolobium var. amazonicum Huber ex Ducke; Switenia macrophylla, King; Cordia goeldiana Huber; Ananas comosus var. erectifolius L.B.Smith). As amostragens foram realizadas em dezembro de 2009, abril e julho de 2010, o que caracterizou o período sazonal de transição (estiagem para chuva intensa), chuva intensa e estiagem respectivamente, para avaliar a granulometria, densidade aparente, densidade da partícula, porosidade total e umidade atual, bases trocáveis, soma de bases, CTC, acidez, fósforo, teor de carbono orgânico, pH, em três profundidades diferentes (0 – 10 cm. 10 - 20 cm; 20 – 40 cm) e a ocorrência de macrofauna edáfica. Os resultados mostraram a ação dos períodos sazonais sobre a densidade aparente, densidade da partícula, porosidade total do solo. Fatores químicos como, por exemplo, carbono orgânico, cujos teores variaram entre 5,85 g/kg e 13,00 g/kg, com teores elevados no sistema de cultivo S2, sofreu alterações nos períodos sazonais chuva intensa e estiagem. Quanto a fauna edáfica, foram capturados 9.964 invertebrados pertencentes a 26 táxons diferentes. Os mais abundantes foram Hymenoptera- Formicidae (5.805), Coleoptera (1.454), Acari (862), Collembola (649), Diplopoda (307) e Isopoda (110). Dos 26 táxons identificados, aproximadamente 40% deles apresentaram apenas um representante nas três amostragens efetuadas ou em apenas uma delas. Os maiores valores para frequência relativa ocorreu no sistema de cultivo S2, S4 e S3, respectivamente. O maior valor para frequência absoluta ocorreu durante o período sazonal chuva intensa em S1. As áreas sob reflorestamento com monocultivo e sistema agroflorestal paricà + curauá mostraram melhores desempenhos na recuperação da fertilidade do solo e da fauna edáfica comprovando a eficácia do paricá em monocultivo ou em sistema agroflorestal na recuperação da fertilidade do solo e da fauna edáfica. / This study aimed to evaluate the variation in soil fertility and soil fauna under reforestation paricá (Schizolobium amazonicum Heber ex. Ducke) in monoculture or agroforestry system compared with secondary forest in the experimental area considering the seasonality of precipitation in the period 2009 and 2010. The experimental farm owned by Tramontina Belem S / A, located in northeastern Pará, in the city of Aurora do Pará Four treatments were analyzed undergoing reforestation: Curaua (Ananas comosus var. Erectifolius L.B.Smith) Parica (Shizolobium var. Amazonicum Huber ex Ducke) in the form of monoculture, Parica + curauá (Ananas comosus var. erectifolius L.B.Smith; Shizolobium var. amazonicum Huber ex Ducke); Parica Mahogany + Freijó Curaua (Shizolobium var. amazonicum Huber ex Ducke, Swietenia macrophylla, King, Cordia goeldiana Huber, Ananas comosus var. erectifolius LB.Smith). Samples were taken in December 2009, April and July 2010, which marked the seasonal transition period (dry to heavy rain), heavy rain and dry seasons respectively, to evaluate the particle size, bulk density, particle density, porosity and moisture content, exchangeable bases, total bases, CEC, acidity, phosphorus, organic carbon, pH, at three different depths (0 - 10 cm. 10 to 20 cm, 20-40 cm) and the occurrence of macrofauna. The results showed the action of the seasons on the bulk density, particle density, total soil porosity. Chemical factors, eg, organic carbon, whose contents varied between 5.85 g / kg and 13.00 g / kg, at high levels in the culture system S2, changed during intense rainfall seasons and drought. As for soil fauna, 9964 invertebrates were captured belonging to 26 different taxa. The most abundant were Hymenoptera – Formicidae (5.805), Coleoptera (1.454), Acari (862) Collembola (649), Diplopoda (307) and Isopoda (110). Of the 26 taxa identified, approximately 40% of them showed only a representative sampling carried out in three or just one. The highest values for relative frequency occurred in the cropping system S2, S3 and S4, respectively. The highest value of absolute frequency occurred during seasonal rainstorms in S1. Areas under reforestation and agroforestry monoculture Parica + curauá showed better performance in the recovery of soil fertility and soil fauna proving the efficacy of paricá in monoculture or agroforestry system in the recovery of soil fertility and soil fauna.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2006. / Full text release at OhioLINK's ETD Center delayed at author's request

Les recherches décrites dans ces pages portent sur l'étude de l'aurore à protons par télédétection spatiale en ultraviolet lointain. Ce travail s'inscrit dans le cadre de la mission IMAGE, dont l'instrument FUV offre la possibilité d'observer les émissions aurorales dues à la précipitation d'électrons et de protons. L'imageur spectral SI12, construit au Centre Spatial de Liège, donne une image de la raie Lyman-alpha déplacée par effet Doppler produite par la désexcitation de l'hydrogène. Il permet l'observation globale de l'ovale auroral avec une résolution temporelle de 2 minutes. Les données couplées à un modèle de transport et de dégradation d'énergie des particules qui précipitent ont été utilisées pour étudier l'aurore à protons tant d'un point de vue morphologique que d'un point de vue quantitatif. La première étape du travail consistait à valider les observations et à calibrer la méthode développée pour obtenir les flux énergétiques des particules accélérées vers l'atmosphère à partir des taux de comptage SI12. Des comparaisons des observations SI12 et des mesures in situ de particules des satellites NOAA ont montré un désaccord de 50%, qui a été pris en considération dans la suite du travail. J'ai ensuite entrepris une étude statistique des caractéristiques morphologiques de l'ovale protonique. Cette statistique présente un très bon accord avec les études précédentes, bien que celles-ci soient basées sur des mesures locales de la précipitation de protons. Les résultats quantitatifs quant à l'intensité de la précipitation des protons ont montré une variation saisonnière, avec un maximum dans l'hémisphère estival. J'ai également mis en évidence l'influence de l'orientation de la composante nord/sud du champ magnétique interplanétaire et de la pression dynamique du vent solaire sur la précipitation de protons tant au point de vue de l'énergie accumulée durant la phase de croissance, que des processus de déclenchement de leur précipitation et des processus de précipitation eux-mêmes. L'analyse de la dynamique de l'ovale auroral protonique durant les phases de croissance des sous-tempêtes magnétiques a montré que le mouvement vers l'équateur des frontières de l'ovale pouvait être local, global ou une superposition des deux. Ce résultat est interprété comme la combinaison d'un étirement global de la magnétosphère dû à l'influence du vent solaire et d'un étirement local trouvant son origine dans le feuillet de plasma interne à la magnétosphère. Dans la dernière étape du travail, j'ai analysé les conséquences de la précipitation aurorale sur l'ionosphère. J'ai montré que les conductivités de Hall et de Pedersen et leur évolution temporelle pouvaient être déduites de la contribution des trois imageurs ultraviolets à une échelle spatiale globale. Le résultat principal de cette partie montre que la contribution des protons à la puissance et aux conductances aurorales ne peut localement pas être négligée par rapport à celle des électrons.

A 50 MHz Frequency Modulated Continuous Wave (FMCW) radar system, developed at the University of Saskatchewan to provide improved spatial and temporal resolution measurements of auroral E-region plasma processes, introduces ambiguous spectral information, due to spectral ghosting, for scattering events in which multiple radar echoes are detected. This thesis identifies two Linearly Frequency Modulated (LFM) radar waveforms used by the FMCW system as the source of the ghosting. An analysis procedure designed to counteract the spectral ghosting problem is developed but is not an ideal solution, and therefore replacement of the LFM waveforms is recommended.<p> A detailed investigation of alternative radar waveforms using the Ambiguity Function and Ambiguity Diagram techniques is performed. A frequency coded continuous wave radar waveform based on a composite Costas sequence is proposed as a successor to the LFM waveforms. The composite Costas radar waveform will conserve the spatial and temporal resolutions extended by the LFM waveforms and preclude any spectral ghosting. Implementing the proposed radar waveform and avoiding receiver saturation issues with the mono-static FMCW radar system in which both the transmitting and receiving antenna arrays are simultaneously and continuously active and geographically co-located is also discussed.<p> In addition to this, two 50 MHz backscatter events are presented in this thesis to demonstrate the effectiveness of the FMCW system, notwithstanding the spectral ghosting complication. The first event from November 21, 2009 is identified as a Type 1 instability and the second from September 13, 2009 is identified as a Type 2 instability which lasted for ~ 16 minutes. Linear plasma fluid theory is used to provide a brief interpretation of both scattering events.