Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2000. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains v, 60 p. : ill. (some col.) Includes abstract. Includes bibliographical references (p. [54]-60).

The existence of an ultrashort feedback mechanism regulating GnRH secretion has been supported from in vivo and in vitro studies. However, the complex synaptic connections of GnRH neurons with other neural elements made it difficult to determine whether the regulation was mediated by direct actions on the GnRH neurons or through actions on other interneurons. The recent development of the GnRH-secreting neuronal cell line, GT1, provided a model system for the study of neural regulation of a pure population of GnRH neurons. The present studies utilized GT1 -7 cells to investigate whether GnRH (at the level of the nerve terminal) influences the control of its own release. Preliminary studies determined the presence of GnRH mRNA in GT1-7 cells and established a cell culture system for the analysis of secretagogue-induced GnRH release. In this system GnRH release was shown to be spontaneous and was enhanced by the addition of K⁺, L-GLU, forskolin and PMA. Furthermore, K⁺- and forskolin-induced GnRH release was dependent on extracellular Ca²⁺. For the analysis of an ultrashort feedback mechanism, GT1-7 cells were cultured in 6-well plates to near confluence and then incubated in serum-free medium in the presence (1 nM- 1 μM) or absence of GnRH antagonist, Ant 27. Basal, K⁺-and forskolin-induced secretion of GnRH was monitored with antiserum 1076 which does not cross-react with Ant 27 at> 1 μM. Ant 27 treatment increased basal, K⁺- and forskolin-stimulated GnRH release in a dose-dependent manner. Total content was unaffected by 18 h treatment of GT1-7 cells with Ant 27. This suggests that the effects of Ant 27 are at the level of release and not biosynthesis. The presence of GnRH binding sites in the cells was demonstrated with ¹²⁵I-GnRH analog. These findings support the concept that GnRH, acting via autoreceptors, negatively controls its own release.

Mon travail de thèse concerne l’étude des leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T). Il se décline en deux projets. Le premier, Le Saracatinib affecte les LAL-T humaines en ciblant la kinase LCK dans les cellules riches en radeaux lipidiques, nous a permis d’identifier une nouvelle voie métabolique importante pour la prolifération des cellules leucémiques. Nous avons montré que la kinase LCK est intégrée dans les radeaux lipidiques et impliquée dans la croissance des cellules leucémiques. L’inhibiteur de LCK Saracatinib affecte les cellules de LAL-T in vitro et in vivo en ciblant particulièrement les cellules les plus agressives ayant beaucoup de radeaux lipidiques à leur surface. Ces résultats permettent d’envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter les LAL-T et ont fait l’objet d’une publication parue dans Leukemia en janvier 2018. Le second projet, Les leucémies aiguës lymphoblastiques T produisent l’interleukine 7 de manière autocrine, démontre pour la première fois que pour la plupart des LAL-T, les cellules sont capables de sécréter elles-mêmes la cytokine IL-7. Nous avons complété cette étude par une analyse des mécanismes épigénétiques impliqués dans la régulation de cette sécrétion autocrine. Nos résultats montrent qu’elle est activée par la fixation des facteurs de transcription IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) et IRF-2 au niveau du promoteur du gène IL 7, lorsque celui-ci est peu méthylé. Grâce à l’inactivation du gène IL-7 dans un de nos modèles de LAL-T, nous avons pu démontrer que la sécrétion autocrine favorise le développement de la leucémie chez la souris xénogreffée en impactant la prise de greffe et le nombre de cellules initiatrices de leucémie. Ainsi, la régulation épigénétique de la sécrétion autocrine d’IL-7 pourrait être impliquée dans les premières étapes de la leucémogenèse des LAL-T. / My PhD work concerns T-cells acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) and includes two projects. The first one, Saracatinib impairs maintenance of human T-ALL by targeting the LCK tyrosine kinase in cells displaying high level of lipid rafts, allow us to identify a new signaling pathway important for the proliferation of T-ALL cells. We showed that LCK is localized into lipid rafts and is involved in the growth of T-ALL cells. The LCK inhibitor Saracatinib affects T-ALL cells in vitro and in vivo by targeting the most aggressive cells displaying high level of lipid rafts. These results highlight a new therapeutic strategy to treat T-ALL and were published in Leukemia in January 2018. The second project, T cell acute lymphoblastic leukemia produces autocrine interleukin 7, demonstrated for the first time that T-ALL cells are able to produce IL-7 cytokine. We performed an analysis of epigenetic mechanisms involved in the regulation of this autocrine secretion. Our results showed that when the IL-7 gene promoter is low methylated, Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1) and (IRF-2) transcription factors bind IRF-E sequence and upregulate IL-7 gene transcription. Thanks to IL 7 gene inactivation in one of our T ALL models, we demonstrated that autocrine secretion promotes leukemia development on xenografted mice through increasing engraftment cells capacity and leukemia initiating cells number. Thus, epigenetic regulation of IL-7 autocrine secretion may be involved in the leukemogenesis of T-ALL.

La croissance post natale est dépendante des effets physiologiques de l'hormone de croissance ou GH («Growth Hormone») qui se traduisent au niveau cellulaire par une augmentation de la prolifération, de la différenciation et du métabolisme. La libération pulsatile de GH hypophysaire induit une réponse cellulaire adaptée et régulée en fonction des différentes situations physiologiques et conditions homéostatiques. La transduction du signal de la GH est médiée par l'activation de la voie canonique de transduction des signaux des cytokines, Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT). La GH est également produite en des sites extrahypophysaires par les cellules endothéliales, fibroblastiques et épithéliales suivant un mode de régulation bien distinct de celui de l'hypophyse. Cette GH ectopique synthétisée en faible quantité par rapport à la production hypophysaire ne contribue pas à l'élévation de la concentration de GH circulante et agirait comme un facteur local de régulation exerçant ses effets de façon autocrine et paracrine. L'objectif principal exposé dans ce mémoire est de comprendre le rôle physiologique et les conséquences pathologiques de la synthèse de GH autocrine. Cette problématique a été abordée depuis la cellule jusqu'à l'animal entier et expérimentalement testée par à un ensemble de techniques de biologie cellulaire, moléculaire et biochimiques. Nous avons dans un premier temps identifié certains sites de production ectopique de GH tels que les organes du système immunitaire et la glande mammaire et démontré que son expression était régulée en fonction de l'ontogenèse ou de l'état physiologique des animaux. Dans la glande mammaire de souris la GH autocrine participe à son développement en activant les mécanismes de prolifération épithéliale et en s'opposant à la différenciation lactogène. Nous avons également mis en évidence l'expression de GH humaine (hGH) dans les cellules épithéliales et fibroblastiques du sein humain et montré qu'elle était augmentée dans les cas de cancers agressifs. L'élaboration d'un modèle cellulaire de production autocrine de hGH nous a permis de caractériser en détail son rôle dans les cellules carcinomateuses mammaires. La GH induit une augmentation significative du nombre de cellules carcinomateuses par stimulation des mécanismes moléculaires de la prolifération cellulaire et par activation des mécanismes anti-apoptotiques. La production autocrine de hGH induit également une remarquable augmentation des capacités migratoires et invasives des cellules associées à un changement morphologique en type fibroblastique conjointement à l'acquisition des marqueurs de la transition épithélio-mésenchymateuse. Nous avons par la suite démontré que les mécanismes moléculaires de la progression tumorale mammaire induite par la GH autocrine résultent de l'activation d'un programme transcriptionnel complexe médié par l'action de protéines spécifiques (CHOP, HOXA1, Cycline D1, c-Myc, Bcl-2, Catalase). Cette plateforme transcriptionnelle permet l'activation soutenue de la voie des MAPK ainsi que la stimulation des fonctions antiapoptotiques, antiradicalaires et de chimiorésistance des cellules carcinomateuses. Par la suite nous avons découvert que l'expression constante et forcée de hGH dans une lignée épithéliale mammaire humaine est suffisante pour induire leur transformation oncogénique in vitro et in vivo, suggérant que la GH pourrait exercer la fonction d'un oncogène impliqué dans les cancers du sein humains. L'ensemble de nos travaux indique que les effets autocrines et paracrines de la GH se traduisent en situation physiologique par le développement prolifératif de l'épithélium mammaire et en conditions pathologiques stimulent la progression tumorale. L'expression constante de hGH par les cellules épithéliales mammaires humaines est potentiellement responsable de leur transformation oncogénique. L'antagonisme de la voie de transduction du signal de la GH représente donc un nouveau niveau d'intervention thérapeutique.

La phophomannose isomérase de type I (PMI), une métalloenzyme à zinc, et la phosphoglucose isomérase (PGI), catalysent l’isomérisation réversible du β-D-fructose-6-phosphate (F6P), respectivement en β-D-mannose-6-phosphate (M6P) et en α-D-glucose-6-phosphate (G6P). Ces deux enzymes sont des cibles thérapeutiques potentielles. La phosphoglucose isomérase humaine (hPGI), connu également sous le nom de facteur de motilité autocrine (AMF), stimule, en plus de son activité glycolytique intracellulaire, la migration des cellules in vitro et le développement de métastases in vivo. D'autre part, Candida albicans est la principale levure impliquée en pathologie humaine. Ces dernières années, un problème de résistance du germe aux antifongiques classiques est apparu. En conséquence, la recherche se dirige vers de nouvelles cibles thérapeutiques, dont la PMI de C. albicans (CaPMI) qui joue un rôle important dans la biosynthèse de structures mannosylées nécessaires à la survie du pathogène. Les réactions catalysées par ces deux enzymes mettent en jeu le même intermédiaire de haute énergie (IHE) de type 1,2-cis-ènediolate, sauf qu’il est coordiné au zinc dans le cas de la PMI. La surexpression ainsi que la purification de CaPMI et de hPGI ont été réalisées au laboratoire. Une petite chimiothèque a été créée à partir du 5-phospho-D-arabinono-1,4-lactone (5-PAL) en modulant la partie tête de l’IHE. Un groupe chélatant du zinc (zinc binding group, ZBG) a été introduit dans plusieurs composés dans le but d’inhiber sélectivement CaPMI. De plus, deux composés possédant en partie tête une fonction amine terminale ont été synthétisés pour inhiber spécifiquement la PGI humaine en ciblant un résidu glutamate du site actif de l'enzyme (Glu357). Toutes ces molécules ont d’abord été testées sur la PGI du muscle de lapin et la PMI de E. coli commerciales, et par la suite sur la CaPMI et la hPGI surexprimées. Une série de bons voire très bons inhibiteurs de hPGI, et donc potentiellement anti-métastatiques, a été découverte. Ces composés ne sont cependant pas inhibiteurs de la CaPMI. Deux structures tridimensionnelles à haute résolution de complexes enzyme-inhibiteur ont été obtenues. Au delà des aspects thérapeutiques, mécanistiques et structuraux, un biocapteur électrochimique à base d'un des inhibiteurs synthétisés a été réalisé pour la détection de hPGI qui est un biomarqueur validé de cancers métastatiques. Ce biocapteur a démontré une limite de détection de 43 fM dans du tampon phosphate (PBS). / Phosphoglucose isomerase (PGI) and type I phosphomannose isomerase (PMI), a zinc metalloenzyme, catalyze the reversible isomerization of β-D-fructose 6-phosphate (F6P) to α-D-glucose 6-phosphate (G6P) and β-D-mannose 6-phosphate (M6P), respectively. These two enzymes are potential therapeutic targets. Human PGI (hPGI) often called as AMF-PGI (autocrine motility factor-PGI), in addition to its intracellular glycolytic activity, stimulates cell migration in vitro and metastasis in vivo. Inhibition of its extracellular activity is obviously interesting in oncology. On the other hand, Candida albicans is the main yeast involved in human pathology. During recent years, resistance of this pathogenic fungus to conventional antifungal drugs appeared. Consequently, research is moving towards new therapeutic targets, including C. albicans PMI (CaPMI) that plays an important role in the biosynthesis of mannosylated structures required for pathogen survival. The reactions catalyzed by these two enzymes involve the same high energy intermediate (HEI) type 1,2-cis-enediolate, except that it is coordinated to the zinc active site in the case of PMI. Overexpression and purification of both CaPMI and hPGI were performed in our laboratory. A small chemical library was created from the synthon 5-phospho-D-arabinono-1,4-lactone (5-PAL) by modulating the head part of the HEI. A zinc binding group (ZBG) was introduced in several compounds in order to selectively inhibit the CaPMI enzyme. Moreover, two compounds with a terminal amine function were designed to selectively inhibit hPGI by targeting a glutamate residue of the enzyme (Glu357). All these molecules were first tested on rabbit muscle PGI and PMI from E. coli, and later on CaPMI and hPGI. None of these compounds are good inhibitors of CaPMI. However, a series of strong inhibitors of hPGI, and therefore potentially anti-metastatic drugs, was discovered. High-resolved 3D structures of the two enzymes complexed with inhibitors have been successfully obtained. Beyond the therapeutic, mechanistic and structural aspects, an electrochemical biosensor based on one of the synthesized inhibitors was carried out for the detection of hPGI, which is a validated biomarker of metastatic cancers. This biosensor demonstrated a detection limit of 43 fM in phosphate buffer (PBS).

published_or_final_version / Biological Sciences / Doctoral / Doctor of Philosophy

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2010. / Includes bibliographical references (leaves 142-175). Also available in print.

The embryonic stem cell (ESC) microenvironment contains various localized physical and biochemical cues to direct cell fate. Current approaches for microenvironmental regulation rely on restricting cell behaviour to control endogenous signals such as secreted ligands. This report presents a microfluidic device that can directly manipulate the removal of autoregulatory ligands from culture and control the activation of Signal Transducer and Activator of Transcription-3 (Stat3) in ESCs. Specifically, the response of Stat3 was measured under diffusive and convective mass transfer regimes. A Brownian dynamics algorithm was also developed to simulate ligand transport and predict cellular response under these conditions. Stat3 activation under perfusion culture was found to depend on flow rate and axial distance in the flow direction. Long-term perfusion also allowed for the formation of a sustained gradient of Stat3 activation that led to selective loss of ESC pluripotency. These results demonstrate the utility of microfluidic culture for stem cell bioengineering applications.

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