Die Studie des menschlichen T1D (Type 1 Diabetes), als eine Autoimmunerkrankung der Bauchspeicheldrüse, könnte man mit der Entdeckung von Insulin unter Verwendung von pankreatectomisierten Tieren argumentieren. Es folgten Studien zur Verfeinerung des Insulinersatzes, Verbesserung der Technologien und zur Untersuchung von Stoffwechsel- und Autoimmunphänomenen in Blutproben. Während Tiermodelle eine Endorgananalyse erlaubten, war die Untersuchung der menschlichen Bauchspeicheldrüse im Vergleich zu Studien mit peripherem Blut stark eingeschränkt. Anhand der so genannten peripheren Blutstudien, die nPOD (Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes), konnte eine menschliche Bauchspeicheldrüsenbank mit Proben von Personen zusammenzustellt werden, die durch die Analyse peripherer Blut-Autoantikörper (Wasserfall, et al., 2016) für T1D als risikoreich eingestuft wurde [CW 1]. Das Hauptziel meiner Dissertation bestand darin, mit diesen noch immer ansteigenden Proben, einige grundlegende Fragen der menschlichen T1D-Biologie zu beantworten. Zuerst konnten meine Kollegen und ich Insulitis bei Autoantikörper-positiven Probanden und bei Patienten mit T1D-Diagnose (Campbell-Thompson, et al., 2016a) studieren [CW 2]. Dabei fanden wir in 2 von 5 Pankreasproben Insulitis von Autoantikörper-positiven Probanden, beide mit der Kombination GADA und IA-2A. In Pankreasproben von T1D-Spendern mit weniger als einem Jahr Krankheitsdauer hatten 100% der Patienten eine Insulitis. Während, in denen mit mehr als einem Jahr Krankheitsdauer, 23% der Insulitis aufzeigten. Dies impliziert, dass die Insulitis vorwiegend zum Krankheitsbeginn auftritt und danach abnimmt. Das steht im extremen Gegensatz zum NOD-Mausmodell, bei dem Insulitis sehr früh auftritt und bei 100% der Inzuchtmäuse, unabhängig davon, ob sie T1D entwickeln oder nicht. Auch im Gegensatz zum NOD, während β-Zellmasse in T1D-Pankreasproben reduziert wurde, fehlte es nicht ganz. Wir bestätigten ebenfalls die Ergebnisse einer reduzierten Gesamtmasse menschlicher T1D-Pankreasproben, die nicht durch fehlende β-Zellen erklärt werden, da die nur einen kleinen Teil des Organs ausmachen. Dies impliziert den Verlust von exokrinem Gewebe in einer Art und Weise, die bis heute ungeklärt bleibt. Weiterhin haben wir getestet, ob Komplement eine potenzielle Rolle in T1D spielt, indem die C4d-Deposition als Marker für (Auto) Antikörpervermittelte Ereignisse verwendet wurde (Rowe, et al., 2013) [CW 3]. Unerwarteterweise fanden wir heraus, dass es erhöhte C4d Antikörperfärbung in T1D Pankreasproben gab. Dies implizierte die Verteilung potentieller exokriner Entzündungen und nicht unbedingt Insel-spezifische Ereignisse. Ob dies mit den Befunden der kleineren Bauchspeicheldrüse in T1D zusammenhängt, ist eine naheliegende Frage für zukünftige Studien. Bei der Zusammenstellung dieser Begriffe verwendete ich eine Technik, um Proteine aus gefrorenen Abschnitten der Bauchspeicheldrüse zu extrahieren und fand die Persistenz von Proinsulin, während die Insulin- und C-Peptid-Konzentrationen niedrig bis nicht nachweisbar durch ELISA in T1D-Proben waren (Wasserfall, et al., 2017) [CW 4]. Weiterhin konnten wir zeigen, dass INS mRNA durch ISH und RT-qPCR zusammen mit Proinsulin und Insulin durch Immunhistochemie anwesend war. Wir waren ebenfalls in der Lage, die Progression von T1D semi-quantifizieren, durch den Verlust von Insulin in Inselchen, sondern die Persistenz von Insulin-positiven Einzelzellen mit längerer Krankheitsdauer. Das Enzym PCSK1 wurde außerdem in T1D-Proben durch RT-qPCR reduziert, was auf einen möglichen Mechanismus für die unvollständige Verarbeitung von Proinsulin zu reifem Insulin und CPeptid hindeutet. Die Aufklärung dieses Prozesses und die Frage, ob die einzelnen insulinpositiven Zellen als therapeutische Option gerettet werden können oder ob sie die Zellen von β dedifferenzieren, werden in Zukunft weiterverfolgt.:TABLE OF CONTENTS II LIST OF ABBREVIATIONS IV LIST OF FIGURES V SUMMARY 1 1 MOTIVATION 1 2 STATE OF THE ART 6 2.1 Type 1 diabetes is an autoimmune disease 6 2.2 Models of type 1 diabetes 6 2.3 Humoral immune responses in type 1 diabetes 7 2.4 Genetics and Cell mediated immunity in type 1 diabetes 8 2.5 The lesion in type 1 diabetes 11 2.6 Prediction of type 1 diabetes in the general human population 14 3 OBJECTIVES 17 4 OWN RESEARCH RESULTS 19 4.1 Screening organ donors for type 1 diabetes autoantibodies is feasible 19 4.2 The insulitis lesion in humans reveals the heterogeneity of type 1 diabetes 20 4.3 Complement deposition in the human pancreas is not specific to islet blood vessels 22 4.4 The pancreas of individuals with type 1 diabetes shows progressive loss of insulin, but proinsulin persists 22 5 DISCUSSION 26 5.1 Even with a low prevalence disease such as T1D it is possible to screen organ donors for the presence of disease specific autoantibodies 26 5.2 Insulitis in the natural history of T1D 26 5.3 Complement deposition in the natural history of T1D 28 5.4 Presence of endocrine hormones in the natural history of T1D 29 6 RESUME 31 SUMMARY GERMAN 33 BIBLIOGRAPHY 35 LIST OF PUBLICATIONS 53 [CW1] Validation of a rapid type 1 diabetes screening assay for community-based screening of organ donors to identify subjects at increased risk for the disease 54 [CW2] Insulitis and β-Cell Mass in the Natural History of Type 1 Diabetes 66 [CW3] Increased Complement Activation in Human Type 1 Diabetes Pancreata 82 [CW4] Persistence of Pancreatic Insulin mRNA Expression and Proinsulin Protein in Type 1 Diabetes Pancreata 87 CURRICULUM VITAE 101 ACKNOWLEDGEMENTS 121 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 124 ANLAGE 1 125 ANLAGE 2 127

Dear Editor, Dermatomyositis (DM) is a rare autoimmune disease with cutaneous and systemic involvement significantly impairing quality of life. Current treatment options are unspecific and often induce only partial remission, especially in DM‐associated panniculitis. The pathogenesis of the disease is fairly unknown; however, induction of type I interferon (IFN) and its IFN‐stimulated genes (ISGs) was discovered in patients’ blood, muscle and skin.1 Inhibiting the activation of Janus kinase (JAK)‐transmitting signals of the type I IFN receptor is a valuable therapeutic option, and the efficacy of the JAK1 and JAK2 inhibitor baricitinib was reported in eight patients with juvenile DM and in two patients with adult DM.2–6 The prominent type I IFN signature in DM prompted us to treat three patients with classic adult DM with the JAK inhibitor baricitinib.1 Patient 1 had experienced a recurrent disease course for 25 years. She had previously received immunosuppressive therapy and intravenous immunoglobulin (IVIG). Partial remission was achieved with low‐dose prednisolone (5 mg per day), methotrexate, hydroxychloroquine and adalimumab. Nevertheless, she presented with a new disease flare with violaceous erythema prone to the face, décolleté, neck and periungual area, but normal muscle enzymes (Figure 1a). The therapy with methotrexate and adalimumab was terminated due to an increase in liver enzymes. Thereafter, tofacitinib was started but was not well tolerated because of lactose intolerance in the patient. Therefore, the therapy was changed to baricitinib 4 mg daily. The neck, facial and periungual erythema completely regressed within 5 months of treatment (Figure 1a).

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Die myotone Dystrophie ist eine autosomal dominant vererbte, multisystemische Erkrankung mit skelettmuskulärem Fokus und wird in zwei Untergruppen eingeteilt, die myotone Dystrophie Typ I (MD1), verursacht durch eine CTG-Trinukleotidexpansion im DMPK-Gen auf Chromosom 19, und die myotone Dystrophie Typ II (MD2), verursacht durch eine Tetranukleotidexpansion im CNBP-Gen auf Chromosom 3. Die Nukleotidexpansionen akkumulieren als mRNA intranukleär und tragen über die Beeinflussung des alternativen Splicings von über 30 Genen zum Erkrankungsmechanismus bei. Daneben akkumulieren die mRNA-Repeats im Zytoplasma und induzieren über die Repeat-assoziierte-non-AUG-Translation (RAN-Translation) die Akkumulation aberranter Proteine. Wenngleich die Patienten der MD2 einen milderen Krankheitsverlauf erleben, zeigen sie ein erhöhtes Auftreten von Autoimmunerkrankungen. In der Pathogenese der Autoimmunerkrankungen spielt die durch Interferon-Typ-I vermittelte Immunreaktion eine wichtige Rolle. In der AG Günther konnte eine erhöhte Expression interferonstimulierter Gene und die erhöhte Expression von Markern des Stresszustandes des endoplasmatischen Retikulums in Fibroblasten von MD2-Patienten nachgewiesen sowie die erhöhte Prävalenz von Autoimmunerkrankungen in MD2 gezeigt werden. Die Auswertung serologischer Parameter im Rahmen dieser Arbeit erlaubte eine klinische Charakterisierung der Patienten und ergab einen positiven Zusammenhang zwischen Höhe der Myoglobin-Konzentration im Serum und Länge der CCTG Repeats. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die zytoplasmatischen RNA-Repeats über die RAN-Translation und Akkumulation aberranter Proteine zur Induktion von ER-Stress führen, welcher über die gemeinsame Kontaktflächen der Mitochondrien-assoziierten Membranen (MAMs) in die Mitochondrien übertragen wird. Im Rahmen des mitochondrialen Stresszustandes könnte es zu einer Freisetzung mitochondrialer DNA und zur Aktivierung des zytosolischen DNA-Rezeptors cGAS und einer nachfolgenden Expression von Interferon und Interferon-stimulierten Genen kommen, die für das vermehrte Auftreten der Autoimmunerkrankungen verantwortlich sind. Zur Überprüfung der Hypothese sollte nach Analyse der Proteinexpression der ER-Stress-Marker eIF2α und peIF2α eine Hemmung der ER-Stressreaktion vorgenommen werden. Die anschließende Untersuchung des mitochondrialen Stresszustandes und die Unterbrechung der MAMs sollte Aufschluss über die Rolle der Mitochondrien in der Pathogenese der Autoimmunität liefern. In dieser Arbeit konnte die erhöhte Expression des ER-Stressmarkers peIF2α nach Stressinduktion in Fibroblasten von MD2-Patienten gezeigt werden. Dies könnte auf eine Sensibilisierung des Signalweges im Rahmen eines chronischen Stresszustandes hinweisen. Der Versuch einer Behandlung der Fibroblasten mit Ursodesoxycholsäure (UDCA), einem chemischen Chaperon, mit Ziel der Suppression der ER-Stressreaktion erzielte keine Reduktion der Expression der ER-Stressmarker unter Nativniveau. Nach Stimulation des ER-Stresses konnte mit UDCA-Vorbehandlung dennoch die Reduktion auf Nativniveau erzielt werden. Zur Analyse des mitochondrialen Stresszustandes wurde eine Färbung mit Mitotracker-Farbstoffen und anschließender Durchflusszytometrie und eine Messung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) vorgenommen, welche ein verringertes mitochondriales Membranpotential und eine erhöhte ROS-Expression in den MD2-Fibroblasten ergaben und mit einem mitochondrialen Stresszustand einhergehen könnten. Nach Unterbrechung der räumlichen Verbindung zwischen ER und Mitochondrium durch die Herunterregulation des gemeinsamen Strukturproteins PERK konnten Hinweise auf eine verringerte ROS-Expression in den MD2-Fibroblasten gefunden werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese der Funktion der mitochondrialen Stressreaktion in den Fibroblasten der MD2-Patienten, wenngleich die Autoimmunität-vermittelnden Mechanismen noch Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein sollten.

Die Myasthenia Gravis (MG) ist ein Prototyp einer Antikörper-vermittelte Autoimmunerkrankung. Die Autoantikörper richten sich hauptsächlich gegen den Acetylcholinrezeptor (AChR). Welche Bedeutung TH17-Zellen für die Pathogenese der MG haben, konnte bisher noch nie direkt gezeigt werden. Mithilfe des Tiermodells Experimentelle Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG) sollte die Rolle der TH17-Zellen im Rahmen dieser Arbeit analysiert werden. Eine signifikante Anzahl tAChR-spezifischer CD4+ T-Zellen, die IL17 exprimieren, konnte nach der Immunisierung mit torpedo AChR in CFA in Wildtyp-Mäusen (WT) beobachtet werden. Die IL17ko Mäuse entwickelten weniger oder keine EAMG Symptome, obwohl weder die Frequenz tAChR-spezifischer CD4+ T-Zellen, die IL2, IFNgamma oder IL21 sezernierten noch der prozentuale Anteil der FoxP3+ Treg-Zellen einen Unterschied aufwiesen. Im Gegensatz dazu waren die Level pathogener anti-muriner AChR Antikörper statistisch geringer in IL17ko Mäusen, während bei anti-tAChR Antikörpertitern kein Unterschied festzustellen war. Ähnliche Resultate erbrachten TCRbeta/delta ko Mäuse rekonstituiert mit entweder WT oder IL17ko CD4+ T-Zellen. Die Depletion von Treg-Zellen mithilfe von DEREG Mäusen in der frühen Erkrankungsphase zeigte keine signifikanten Unterschiede bezüglich der analysierten Parameter. Zusammenfassend lässt sich hier festhalten, dass die Frequenz und Differenzierung Antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen sowie der Antikörpertiter gegen den tAChR nicht durch die IL17-Defizienz im EAMG Modell beeinflusst wird. Auch hat eine frühe Treg-Zell-Depletion keinen Einfluß auf die Erkrankungsstärke. Allerdings scheint das Durchbrechen der B-Zell Toleranz, das zur Produktion von pathogenen Anti-mAChR-spezifischen Antikörpern und somit zu einer Induktion der Erkrankung führt, abhängig von IL17-produzierenden CD4+ T-Zellen zu sein. Der Einsatz von Anti-IL17-Antikörpern könnte insofern auch für die MG eine Therapieoption darstellen. / Myasthenia gravis (MG) is an antibody-mediated autoimmune disease. The autoantibodies are directed against the acetylcholine receptor (AChR). The importance TH17 cells have for MG pathogenesis has never been directly demonstrated. Therefore, the analysis of TH17 cells in the Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG) animal model was the aim of this work. Here, it is shown that in wildtype mice (WT) significant numbers of IL17-producing tAChR-specific CD4+ T cells could be observed after immunization with torpedo AChR in CFA. IL17ko mice developed less or no EAMG symptoms, although frequencies of tAChR-specific CD4+T cells secreting IL2, IFNgamma or IL21 as well as percentage of FoxP3+ Treg cells were similar. In contrast, pathogenic anti-murine AChR antibody levels were significantly lower in IL17ko mice, while anti-tAChR antibody levels were equal. Similar results were obtained by the reconstitution of TCR beta/delta ko mice with CD4+ T cells of either WT or IL17ko origin. For the depletion of Treg cells using DEREG mice in the initial phase of the disease no significant differences could be detected in terms of the analyzed parameters. In summary, this thesis demonstrates, that frequencies and differentiation of antigen specific CD4+ T cells as well as the level of anti-tAChR specific antibody titers are not affected by IL17-deficiency in the EAMG model. Likewise, an early Treg cell depletion seems to have no impact on disease severity. However, breaking of B cell tolerance resulting in pathogenic anti-murine AChR specific antibodies and subsequent disease induction, seems to be dependent on IL17 producing CD4+ T cells. In this respect, the application of anti-IL17 antibodies could also become a MG therapy option.

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