Coronavírus, incluindo-se o Coronavírus aviário (ACoV), possuem o maior genoma composto por RNA conhecido entre os vírus. Aproximadamente dois terços desse genoma codificam proteínas não estruturais (Nsps), cujas funções parecem estar associadas à replicação e patogênese viral. Até o momento, esses alvos têm sido pouco explorados quanto a sua diversidade em diferentes linhagens de ACoV. O presente estudo teve como objetivo investigar a diversidade dos genes codificadores das proteínas não estruturais Nsp2 e protease Papaína-like (Plpro), utilizando-se linhagens brasileiras de ACoV. Para tanto, 10 linhagens de ACoV, isoladas em ovos embrionados, foram submetidas à RT-PCR direcionada aos genes codificadores de Plpro e Nsp2, seguindo-se o sequenciamento de DNA e a análise filogenética, juntamente com sequências homólogas obtidas no GenBank. Além disso, realizou-se a genotipagem por meio do sequenciamento parcial do gene codificador da proteína de espícula (região S1). Três das amostras virais obtidas e investigadas no presente trabalho apresentaram padrão de segregação discordante para os genes estudados. O isolado CRG I22 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo Massachusetts para S1 e com o grupamento de ACoVs brasileiros os genes da Nsp2 e Plpro. O isolado CRG I33 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo brasileiro para s1 e plpro e de maneira divergente para o gene da Nsp2. Para o isolado CRG I38, não foi obtida a genotipagem por s1, entretanto, similarmente ao observado para o isolado CRG I33, esse isolado agrupo-se com linhagens virais brasileiras para o gene plro e de maneira independente para o gene nsp2. As demais linhagens estudadas resultaram na formação de um grupamento especificamente brasileiro de ACoV, para os três genes estudados. Esses achados sugerem a ocorrência de recombinação nessas amostras discrepantes. Quanto às identidades médias entre as sequencias nucleotídicas analisadas, a região de s1 analisada apresentou as menores identidades (73,75% ±16,78), seguido pelo gene plpro (88,06% ±5,7) e do gene nsp2 (92,28% ±4,37), em acordo com a literatura. Assim sendo, os alvos investigados podem constituir ferramentas úteis na epidemiologia molecular do ACoV e na investigação de linhagens recombinantes do vírus. O presente estudo é o primeiro a investigar a diversidade genética de genes codificadores de proteínas não-estruturais em linhagens brasileiras de ACoV. Os resultados aqui apresentados reforçam a existência de um genótipo brasileiro de ACoV, para os 3 genes estudados. Entretanto, discrepâncias pontuais encontradas no padrão genotípico para s1, nsp2 e nsp3 permitem inferir uma diversidade genética maior do que a conhecida até o momento, possivelmente resultante de eventos de recombinação entre ACoVs brasileiros, ACoVs vacinais e outros ainda desconhecidos. Os resultados obtidos auxiliam na compreensão dos padrões e evolução dos ACoVs / Coronaviruses, including Avian coronavirus (ACoV), have the largest known RNA genome. Nearly two thirds of its genome codes for non-structural proteins (Nsps), whose functions appear to be linked to viral replication and pathogenesis. Hitherto these targets have been poorly explored regarding the ACoV lineages diversity. The present study aimed to assess the diversity of non-structural protein 2 (nsp2), papain-like protease (plpro) and spike protein (S1 subunit) coding genes, in Brazilian ACoV strains. To this end, 10 ACoV strains, isolated in embryonated eggs, had its 3rd and 5th passages submitted to RT-PCR targeting nsp2, plpro and s1, followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis, herewith homologous sequences obtained from GenBank. Three of the ACoV strains sequenced showed a discordant segregation pattern for target genes. CRG I22 strain clustered with Massachusetts genotipe strains for S1, and with Brazilian cluster for nsp3 and plpro genes. CRG I33 strain, clustered with Brazilian strains for S1 and plpro genes, and was divergent for nsp2 gene. For CRG I38 strain, the S1 sequence was not obtained, however, similarly to what was observed for CRG I33, this strain grouped with the Brazilian lineage for plpro gene and was divergent for nsp2 gene. All the other ACoV here sequenced resulted in a specific Brazilian cluster for the three studied genes. Regarding the mean nucleotide identities measured, s1 gene showed the lowest identity (73.75% ±16.78), followed by plpro gene (88.06% ±5.7) and nsp2 gene (92.28% ±4.37), in accordance with previous reported data. Therefore, the targets of the present study are useful tools for ACoV molecular epidemiology studies and for the survey of recombinant ACoV strains. The presented study is the first one investigating the molecular diversity of non-structural proteins coding genes in Brazilian strains of ACoV. Results achieved herein reinforce the data over the circulation of ACoV Brazilian strains in this country, for the three investigated genes. However, divergences found between S1, nsp2 and plpro genetic patters allow inferring a higher molecular diversity than previously known. It is possible that this divergence is due to recombination events between ACoV from vaccines, Brazilian field strains and others still unknown. These results contribute on the comprehension over genetic patters and evolution of ACoV

Submitted by Lucas Bocchini Rodrigues Alves null (lucasbocchini@gmail.com) on 2017-12-05T19:45:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Lucas_Bocchini_Rodrigues_Alves.pdf: 48834271 bytes, checksum: 5031c0180284664e9a7c99d9701586b4 (MD5) / Submitted by Lucas Bocchini Rodrigues Alves null (lucasbocchini@gmail.com) on 2017-12-11T18:47:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Lucas_Bocchini_Rodrigues_Alves.pdf: 48834271 bytes, checksum: 5031c0180284664e9a7c99d9701586b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2017-12-13T11:36:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rodriguesalves_lb_jabo.pdf: 48291587 bytes, checksum: dba569cb90d71bd85abca6cc394cb228 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-13T11:36:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rodriguesalves_lb_jabo.pdf: 48291587 bytes, checksum: dba569cb90d71bd85abca6cc394cb228 (MD5) Previous issue date: 2017-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / RESUMO – Salmonella Gallinarum (SG) é um patógeno hospedeiro-específico que causa o tifo aviário, doença sistêmica severa que é considerada uma das principais preocupações da indústria avícola mundial. Quando infecta a ave, SG utiliza mecanismos de evasão para sobreviver e replicar no interior de macrófagos. Nesse contexto, os genes phoPQ codificam o sistema regulatório de dois componentes (PhoPQ) que regula genes de virulência responsáveis pela adaptação de Salmonella spp. a fatores antimicrobianos como baixo pH, peptídeos antimicrobianos e baixas concentrações de cátions bivalentes. No presente estudo, objetivou-se investigar a função desses genes para SG. Assim, uma estirpe de SG com genes phoPQ defectivos (SG ∆phoPQ) foi construída e sua patogenicidade avaliada em aves poedeiras de 20 dias de vida susceptíveis ao tifo aviário. SG ∆phoPQ não causou sinais clínicos nem mortalidade em aves desafiadas oralmente, sendo não-patogênica. Ademais, essa estirpe não foi recuperada de fígados e baços. Por outro lado, aves desafiadas subcutaneamente com a estirpe mutante tiveram alterações patológicas discretas a moderadas e baixas contagens bacterianas em tecidos de fígado e baço. A partir dos dados, observa-se que SG ∆phoPQ é atenuado para aves o que sugere que ambos os genes são importantes durante a infecção sistêmica em aves por SG. / ABSTRACT – Salmonella Gallinarum (SG) is a host-restrict pathogen that causes fowl typhoid, a severe systemic disease that is one of the major concerns to the poultry industry worldwide. When infecting the bird, SG makes use of evasion mechanisms to survive and to replicate within macrophages. In this context, phoPQ genes encode a two-component regulatory system (PhoPQ) that regulates virulence genes responsible for adaptation of Salmonella spp. to antimicrobial factors such as low pH, antimicrobial peptides and deprivation of bivalent cations. Herein, we aimed to investigate the role of the mentioned genes to SG. Thus, a phoPQ-depleted SG strain (SG ∆phoPQ) was constructed and its virulence assessed in twenty-day-old laying hens susceptible to fowl typhoid. SG ∆phoPQ did cause neither clinical signs nor mortality in birds orally challenged, being non-pathogenic. Furthermore, this strain was not recovered from livers or spleens. On the other hand, chickens challenged subcutaneously with the mutant strain had discreet to moderate pathological changes and also low bacterial counts in liver and spleen tissues. These findings show that SG ∆phoPQ is attenuated to susceptible chickens and suggest that both genes are important during chicken systemic infection by SG.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA105.pdf: 858249 bytes, checksum: 72004378f59a4f1ac9176d09bd0051e8 (MD5) Previous issue date: 2012-07-29 / The objective of this study was to quantify the presence of Alphitobius diaperinus (darkling beetle) and evaluate the growth performance of broiler chickens reared in different types of floor shed and methods of reusing litter. We used 20 broiler poultry farms, 10 poultry houses, concrete floor and 10 poultry houses, dirt floor of an agribusiness SC. Of the 10 avian concrete floor, five avian use of lime used as a treatment for bed and five aviaries used anerobically fermented litter in between batches. The same procedure was used in poultry houses, dirt floor. Counting the mealworm proceeded through the bed samples collected one day before the departure of the birds for slaughter at 14 different sites of the avian (located flush against the wall, ceiling and bottom of the feeders) and collected samples of bed moisture analysis. The samples were sieved then quantified and the insects in each of the 14 sampling points. Performance was evaluated in live weight (g) at seven, 14, 21, 28, 35 and 42 days, feed conversion (kg / kg), total condemnation (%) and viability (%) of each batch of birds. Statistical analyzes were conducted based on data from all experimental units included in the studied treatments, according to the experimental design and sampling protocol used. Have been implemented by adopting a mixed linear model analysis of variance with repeated measures. Comparisons between the mean values of each of the variables in the different treatments in each plot were performed using the Tukey test. Linear regressions were adjusted for the purpose batch in each of the treatments. All analyzes were performed using the MIXED procedure of SAS ® computer software (Statistical Analysis System). For all tests performed was considered the minimum level of significance of 5%. The results showed that none of the methods evaluated was effective in reducing the number of catfishes during the four consecutive batches, but avian concrete floor combined with the method anerobically fermented litter promoted the maintenance of the number of insects (P >0.05). It was observed that the highest number of insects concentrated below the troughs. Independent of the floor of the aviary and method of treatment of reused litter, humidity remained between 22% and 31% (P <0.05). The performance of birds did not differ between control methods evaluated (P >0.05) / Objetivou-se com este trabalho quantificar a presença de Alphitobius diaperinus (cascudinho) e avaliar o desempenho zootécnico de frangos de corte criados em diferentes tipos de piso de galpão e métodos de reutilização de cama de aviário. Foram utilizados 20 aviários de frangos de corte, sendo 10 aviários de piso de concreto e 10 aviários de piso de chão batido de uma agroindústria de SC. Dos 10 aviários de piso de concreto, cinco aviários utilizaram aplicação de cal como tratamento da cama e cinco aviários utilizaram o enlonamento de toda a cama no intervalo entre lotes. O mesmo procedimento foi utilizado nos aviários de piso de chão batido. A contagem do cascudinho procedeu-se através de amostras de cama coletadas um dia antes da saída das aves para o abate em 14 pontos distintos do aviário (localizados rente a mureta, pé-direito e embaixo dos comedouros) bem como coletada amostras de cama para análise de umidade. As amostras foram peneiradas e os insetos então quantificados em cada um dos 14 pontos coletados. No desempenho avaliou-se o peso vivo (g) aos sete, 14, 21, 28, 35 e 42 dias, conversão alimentar (kg/kg), condenação total (%) e viabilidade (%) de cada lote de aves. As análises estatísticas foram conduzidas a partir dos dados de todas as unidades experimentais incluídas nos tratamentos estudados, de acordo com o delineamento experimental e protocolo de amostragem utilizado. Foram implementadas adotando-se um modelo linear misto de análise de variância com medidas repetidas no tempo. As comparações entre os valores médios de cada uma das variáveis analisadas nos diferentes tratamentos em cada lote foram efetuadas por meio do teste de Tukey. Também foram ajustadas regressões lineares para o efeito de lote em cada um dos tratamentos estudados. Todas as análises foram procedidas usando-se o procedimento MIXED do software computacional estatístico SAS® (Statistical Analysis System). Para todos os testes efetuados foi considerado o nível mínimo de significância de 5%. Os resultados apresentaram que nenhum dos 7 métodos avaliados foi eficiente em reduzir o número de cascudinhos no decorrer dos quatro lotes consecutivos, porém aviários de piso de concreto aliados ao método de enlonamento promoveu a manutenção do número de insetos (P>0,05). Observou-se que o maior número de insetos concentrou-se embaixo dos comedouros. Independente do tipo de piso do aviário e método de tratamento da cama reutilizada, a umidade se manteve entre 22% e 31% (P<0,05). O desempenho zootécnico das aves não diferiu entre os métodos de controle avaliados (P>0,05)

Coronavírus, incluindo-se o Coronavírus aviário (ACoV), possuem o maior genoma composto por RNA conhecido entre os vírus. Aproximadamente dois terços desse genoma codificam proteínas não estruturais (Nsps), cujas funções parecem estar associadas à replicação e patogênese viral. Até o momento, esses alvos têm sido pouco explorados quanto a sua diversidade em diferentes linhagens de ACoV. O presente estudo teve como objetivo investigar a diversidade dos genes codificadores das proteínas não estruturais Nsp2 e protease Papaína-like (Plpro), utilizando-se linhagens brasileiras de ACoV. Para tanto, 10 linhagens de ACoV, isoladas em ovos embrionados, foram submetidas à RT-PCR direcionada aos genes codificadores de Plpro e Nsp2, seguindo-se o sequenciamento de DNA e a análise filogenética, juntamente com sequências homólogas obtidas no GenBank. Além disso, realizou-se a genotipagem por meio do sequenciamento parcial do gene codificador da proteína de espícula (região S1). Três das amostras virais obtidas e investigadas no presente trabalho apresentaram padrão de segregação discordante para os genes estudados. O isolado CRG I22 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo Massachusetts para S1 e com o grupamento de ACoVs brasileiros os genes da Nsp2 e Plpro. O isolado CRG I33 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo brasileiro para s1 e plpro e de maneira divergente para o gene da Nsp2. Para o isolado CRG I38, não foi obtida a genotipagem por s1, entretanto, similarmente ao observado para o isolado CRG I33, esse isolado agrupo-se com linhagens virais brasileiras para o gene plro e de maneira independente para o gene nsp2. As demais linhagens estudadas resultaram na formação de um grupamento especificamente brasileiro de ACoV, para os três genes estudados. Esses achados sugerem a ocorrência de recombinação nessas amostras discrepantes. Quanto às identidades médias entre as sequencias nucleotídicas analisadas, a região de s1 analisada apresentou as menores identidades (73,75% &plusmn;16,78), seguido pelo gene plpro (88,06% &plusmn;5,7) e do gene nsp2 (92,28% ±4,37), em acordo com a literatura. Assim sendo, os alvos investigados podem constituir ferramentas úteis na epidemiologia molecular do ACoV e na investigação de linhagens recombinantes do vírus. O presente estudo é o primeiro a investigar a diversidade genética de genes codificadores de proteínas não-estruturais em linhagens brasileiras de ACoV. Os resultados aqui apresentados reforçam a existência de um genótipo brasileiro de ACoV, para os 3 genes estudados. Entretanto, discrepâncias pontuais encontradas no padrão genotípico para s1, nsp2 e nsp3 permitem inferir uma diversidade genética maior do que a conhecida até o momento, possivelmente resultante de eventos de recombinação entre ACoVs brasileiros, ACoVs vacinais e outros ainda desconhecidos. Os resultados obtidos auxiliam na compreensão dos padrões e evolução dos ACoVs / Coronaviruses, including Avian coronavirus (ACoV), have the largest known RNA genome. Nearly two thirds of its genome codes for non-structural proteins (Nsps), whose functions appear to be linked to viral replication and pathogenesis. Hitherto these targets have been poorly explored regarding the ACoV lineages diversity. The present study aimed to assess the diversity of non-structural protein 2 (nsp2), papain-like protease (plpro) and spike protein (S1 subunit) coding genes, in Brazilian ACoV strains. To this end, 10 ACoV strains, isolated in embryonated eggs, had its 3rd and 5th passages submitted to RT-PCR targeting nsp2, plpro and s1, followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis, herewith homologous sequences obtained from GenBank. Three of the ACoV strains sequenced showed a discordant segregation pattern for target genes. CRG I22 strain clustered with Massachusetts genotipe strains for S1, and with Brazilian cluster for nsp3 and plpro genes. CRG I33 strain, clustered with Brazilian strains for S1 and plpro genes, and was divergent for nsp2 gene. For CRG I38 strain, the S1 sequence was not obtained, however, similarly to what was observed for CRG I33, this strain grouped with the Brazilian lineage for plpro gene and was divergent for nsp2 gene. All the other ACoV here sequenced resulted in a specific Brazilian cluster for the three studied genes. Regarding the mean nucleotide identities measured, s1 gene showed the lowest identity (73.75% ±16.78), followed by plpro gene (88.06% ±5.7) and nsp2 gene (92.28% ±4.37), in accordance with previous reported data. Therefore, the targets of the present study are useful tools for ACoV molecular epidemiology studies and for the survey of recombinant ACoV strains. The presented study is the first one investigating the molecular diversity of non-structural proteins coding genes in Brazilian strains of ACoV. Results achieved herein reinforce the data over the circulation of ACoV Brazilian strains in this country, for the three investigated genes. However, divergences found between S1, nsp2 and plpro genetic patters allow inferring a higher molecular diversity than previously known. It is possible that this divergence is due to recombination events between ACoV from vaccines, Brazilian field strains and others still unknown. These results contribute on the comprehension over genetic patters and evolution of ACoV

Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T17:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sakata_SoniaTatsumi_M.pdf: 14113239 bytes, checksum: 26dfdfbc0c87c2a3a37c6143072df6c6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Produtos naturais isolados a partir de invertebrados e organismos marinhos tem sido objeto de pesquisas contínuas ao longo dos últimos cinquenta anos, principalmente devido à sua complexidade estrutural e potentes atividades biológicas. O presente trabalho teve como proposta ampliar e aprofundar a investigação de substâncias bioativas em extratos de organismos marinhos, junto ao IQSC-USP/Projeto temático, realizando bioensaios de atividade antiviral no laboratório de virologia da Unicamp. Com o objetivo de realizar uma triagem para pesquisar substâncias com ação antiviral, foram eleitas duas espécies de vírus de destaque na avicultura, o Metapneumovirus aviário (aMPV) e o vírus da Doença de Newcastle (NDV), representantes da família Paramyxoviridae. As propriedades em comum dos vírus dentro das respectivas subfamílias, como a organização genômica, sequências das proteínas e suas atividades biológicas, permitem a utilização do aMPV como modelo de estudo para importantes agentes infecciosos da subfamília Pneumovirinae, e o NDV da subfamília Paramyxovirinae. Para a triagem de compostos antivirais foi realizada a avaliação in vitro na linhagem celular Chicken Embryo Related (CER) para a propagação dos vírus e analisar os resultados de inibição viral frente a diferentes extratos e substâncias. Dos cento e vinte e cinco extratos testados frente ao aMPV, sete demonstraram ser ativos, e seis com alto potencial antiviral. Inicialmente, cento e quarenta e sete extratos foram testados frente ao NDV, porém, o resultado foi inconclusivo devido a problema com o título da amostra viral. Assim, os sete extratos ativos e os seis com alto potencial antiviral contra o aMPV foram testados quanto à capacidade de inibição do NDV. Apesar das similaridades dos vírus da família Paramyxoviridae, os extratos não tiveram atividade contra o NDV, como ocorreu frente ao aMPV. As amostras ativas foram estudadas em três tipos de tratamento a fim de determinar os possíveis mecanismos de ação dos extratos: Pré-tratamento, fases de adsorção e/ou penetração do vírus na célula; Pós-tratamento, etapas intracelulares de replicação do vírus; e Inativação Viral. Pela análise visual do efeito citopático, os sete extratos ativos contra aMPV, quatro interrompem as etapas intracelulares de replicação do vírus, dois agem nas fases de adsorção e/ou penetração do vírus à célula, e um não tinha quantidade suficiente para realizar o teste. Com a finalidade de avaliar os possíveis mecanismos de ação com maior objetividade, menor risco de contaminação e alta especificidade, testou-se a metodologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Utilizando um composto puro (pirocina A) frente ao aMPV em CER, a metodologia se demonstrou eficiente. Esse dado foi confirmando pela diminuição de RNA viral quando ocorre a atividade antiviral, dando indícios de atuação do composto em etapas intracelulares de replicação do aMPV. A detecção de extratos com atividade antiviral nas situações testadas neste trabalho corrobora o valor da biodiversidade marinha como fonte de produtos promissores na terapêutica de enfermidades virais. Portanto, a necessidade de estudos sobre esses vírus e do desenvolvimento de novos insumos a serem utilizados nos seus controles é de grande importância ponderado a crescente projeção da indústria avícola brasileira no comércio mundial / Abstract: Natural products isolated from invertebrates and marine organisms have been studied over the past fifty years, mainly due to their structural complexity and potent biological activities. This project was proposed to broaden and deepen the research of bioactive substances in extracts of marine organisms, with the IQSC-USP group, performing bioassays antiviral activity in the laboratory of virology at Unicamp. In order to perform a screening to search antiviral substances were elected two species prominent in poultry, the avian Metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV), representatives of the family Paramyxoviridae. The common properties of the virus within their respective subfamilies, such as genomic organization, sequences of proteins and their biological activities, allow the use of aMPV as a study model for important infectious agents of Pneumovirinae subfamily, and NDV Paramyxovirinae subfamily. For antiviral screening, compounds were tested in vitro using Chicken Embryo Related (CER) cell lineage for the propagation of the virus and analyze the results of viral inhibition against various substances. Among one hundred twenty five extracts tested against aMPV, seven were actives and six have been shown high antiviral potential against the virus. Initially, one hundred fourty seven extracts were tested against NDV. However, the result was inconclusive due to problems with the titer of the viral sample. Thus, the seven active extracts and six extracts with high antiviral potential against the aMPV were tested for the ability to inhibit NDV. Despite the similarities of viruses of the family Paramyxoviridae, the extracts had no activity against NDV, as occurred against aMPV. The active samples were studied in three types of treatment in order to determine the possible mechanisms of action of the extracts: Pre-treatment, stages of adsorption and / or penetration of the virus into the cell; Post-treatment, intracellular steps of virus replication; and Viral Inactivation. At visual analysis of cytopathic effect, from all 7 extracts active against aMPV, 4 disrupt intracellular steps of virus replication, 2 acts on adsorption and / or penetration stages of the virus into the cell, and 1 was not enough to perform the test. In order to assess the possible mechanisms of action more objectively, lower contamination risk and high specificity, the polymerase chain reaction (PCR) in real time methodology was tested. Using a pure compound (pirocina A) against aMPV in CER cell lineage, the methodology is demonstrated efficient. This was confirmed by the decrease of viral RNA when occurs antiviral activity, an evidence of compound's action on intracellular steps of aMPV replication. The detection of extracts with antiviral activity in this study confirms the value of marine biodiversity as a source of promising products in the viral diseases therapeutic. Therefore, the primordiality for more studies and the development of new inputs to control these viruses is extremely important to increasing of Brazilian poultry industry in world trade / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Clarice Weis Arns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:57:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_AlyneVieira_M.pdf: 608733 bytes, checksum: 93e4d814c0f99c65741a343e76d35fc4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Estudos de plantas medicinais com conhecimento tradicional têm sido uma fonte potencial de substâncias com atividades farmacológicas e biológicas significantes. Guettarda angelica Mart. ex Müll. Arg. (Rubiaceae) é uma planta medicinal no qual suas raízes são popularmente utilizadas para diversos fins terapêuticos, incluindo veterinário. Estudos antimicrobianos com raízes desta planta também relataram uma atividade in vitro contra bactérias. Como as infecções virais ainda continuam sendo um sério problema mundial, a etnofarmacologia fornece uma abordagem alternativa para descoberta de novos agentes antivirais. O objetivo do presente trabalho foi o estudo antiviral de extratos da casca das raízes, folhas e sementes de G. angelica frente aos herpesvírus bovino (BoHV-1), suíno (SuHV-1) e equino (EHV-1), reovírus (ARV) e metapneumovírus aviário (aMPV). A atividade antiviral foi testada in vitro em células Vero e MDBK utilizando os ensaios de redução do título viral e o ensaio quantitativo colorimétrico através do MTT. Inicialmente, a concentração máxima não-citotóxica (MNCC) dos extratos foi determinada nas células através da observação de suas alterações morfológicas. Estudos realizados através da redução dos títulos virais mostrou que apenas o extrato aquoso de sementes (AEs) apresentou uma atividade antiviral contra o BoHV-1, SuHV-1, EHV-1 e ARV. Assim, esse extrato foi posteriormente avaliado pelo método MTT para determinação do CC50 (concentração citotóxica a 50%), IC50 (concentração inibitória a 50%) e o SI (índice de seletividade). Os valores de CC50 do extrato AEs foram 400,60 e 920,50 para células Vero e MDBK, respectivamente. E os valores de IC50 e SI foram 22, 79 e 40,39 para BoHV-1; 91,30 e 10,08 para SuHV-1; 19,95 e 20,08 para EHV-1; e 23,59 e 17,00 para ARV. Esses resultados indicam que a semente de G. angelica contém compostos com atividade antiviral promissora e baixa toxicidade / Abstract: Study of medicinal plants with traditional knowledge has been a potential source of substances with significant pharmacological and biological activities. Guettarda angelica M. (Rubiaceae) is a medicinal plant where its roots are popularly used for various therapeutic purposes including veterinary. In vitro antimicrobial studies also related antibacterial activity of these roots against bacteria. Like viral infections still remain a serious worldwide problem, the ethnopharmacology provides an alternative approach for discovery of new antiviral agents. The aim of the present work was the antiviral study of extracts from roots bark, leaves and seeds of G. angelica against bovine (BoHV-1), swine (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses, avian reovirus (ARV) and metapneumovirus (aMPV) The antiviral activity was tested in vitro on Vero and MDBK cells using the viral titer assay and the quantitative colorimetric assay through MTT. Initially, the maximum non-citotoxic concentration (MNCC) of extracts was determined in cells by observation of their morphological alterations. Studies through the reduction of viral titers showed that only the aqueous extract from seeds (AEs) presented an antiviral activity against BoHV-1, SuHV-1, EHV-1 and ARV. Then, this extract was further evaluated by MTT method to determine the CC50 (50% cytotoxic concentration), IC50 (50% inhibitory concentration) and SI (selectivity index). The values of CC50 of AEs extract were 400.60 and 920.60 to Vero and MDBK cells, respectively. And the values of IC50 and SI were 22.79 and 40.39 for BoHV-1; 91.30 e 10.08 for SuHV-1; 19.95 and 20.08 for EHV-1; 23.59 and 17.00 for ARV. These results indicate that the seeds from G. angelica contain composts with promising antiviral activity and low toxicity / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Columbiformes sinantrópicos podem ter um importante papel na epidemiologia de patógenos com potencial zoonótico ou de impacto econômico para a indústria avícola. Dentre eles destacam-se: Mycoplasma spp., Salmonella spp., paramixovírus aviário tipo 1 (APMV-1), inseridos no Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) e a Chlamydophila psittaci, agente de uma das principais zoonoses relacionada com aves silvestres. Dentro desse contexto, este trabalho objetivou pesquisar, sazonalmente, a ocorrência destes patógenos em pombos-domésticos (Columba livia) em dois entrepostos no Estado de São Paulo. Ao longo de um ano, mensalmente 10 pombos foram capturados em cada entreposto para a colheita de amostras de suabe cloacal e sangue. A técnica de soroaglutinação rápida em placa (SAR) foi utilizada para a detecção de anticorpos anti-M. synoviae, anti-M. gallisepticum e anti-S.Pullorum/Gallinarum; para a confirmação dos sororeagentes foram utilizadas a prova de inibição da hemaglutinação e soroaglutinação lenta, respectivamente. Para a detecção do DNA de C. psittaci e RNA de AMPV-1 foram utilizados métodos moleculares, PCR e RT-PCR. Para investigação de anticorpos anti-APMV-1 foi empregada a técnica de HI. Na SAR, 3,3% dos soros foram reagentes para M. synoviae; 2,5% para M. gallisepticum e 0,4% para S. Pullorum/Gallinarum. No entanto, essas amostras foram negativas nas técnicas confirmatórias. A ocorrência do APMV-1 não foi detectada. O DNA de C. psittaci foi detectado em 13,3% das amostras sendo 10,8% provenientes de aves capturadas na estação seca e 15,8% na estação chuvosa. Tais resultados são relevantes, pois demonstram que a C. psittaci ocorre em pombos presentes em áreas públicas frequentadas por um grande número de pessoas. Frente à escassez de pesquisas realizadas em Columbiformes no país, novos estudos são necessários para a determinação do real risco que pombos-domésticos podem representar quanto à transmissão de patógenos para aves comerciais e a influência da sazonalidade na disseminação desses microrganismos. / Columbiformes may play an important role in the epidemiology of pathogens with zoonotic potential or economic impact in the poultry industry. Among these pathogens there are Mycoplasma spp., Salmonella spp., Avian Paramyxovirus type 1 (APMV-1), included in the National Poultry Health Program (PNSA) and Chlamydophila psittaci, etiologic agent of an important zoonosis associated with wild birds. Thus, the aim of this study was to investigate, seasonally, the occurrence of the pathogens listed above in feral pigeons (Columba livia) in two warehouses in São Paulo State. During one year, 10 birds were captured monthly in each locality and cloacal swabs and blood samples were collected from each pigeon. The rapid seroagglutination test was performed for the detection of antibodies against M. synoviae, M. gallisepticum and Salmonella Pullorum/Gallinarum. Positive results were submitted to the hemagglutination inhibition and slow seroagglutination test, respectively. For the C. psittacis DNA and APMV-1s RNA diagnosis, molecular techniques PCR and RT-PCR were performed. Hemagglutination inhibition test was also performed in order to detect antibodies against APMV-1. From the serum samples analyzed by rapid seroagglutination test, 3.3% were positive for M. synoviae, 2.5% for M. gallisepticum and 0.4% for S. Pullorum/Gallinarum. However, none of these samples was positive on the confirmatory tests. APMV-1 was not detected in any of the laboratory tests used. C. psittacis DNA was detected in 13.3% of the samples being, 10.8% from pigeons captured during the dry season and 15.8% in the rainy season. These results are relevant since they indicate that C. psittaci occurs in birds living in public areas frequented by a large number of people. The occurrence of the other pathogens was not detected. Nevertheless, due to lack of information about the pigeons sanitary status in the country, additional researches are necessary to determine the risk that feral pigeons can pose in the transmission of pathogens for poultry and the influence of each season in the spread of these microorganisms.

Columbiformes sinantrópicos podem ter um importante papel na epidemiologia de patógenos com potencial zoonótico ou de impacto econômico para a indústria avícola. Dentre eles destacam-se: Mycoplasma spp., Salmonella spp., paramixovírus aviário tipo 1 (APMV-1), inseridos no Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) e a Chlamydophila psittaci, agente de uma das principais zoonoses relacionada com aves silvestres. Dentro desse contexto, este trabalho objetivou pesquisar, sazonalmente, a ocorrência destes patógenos em pombos-domésticos (Columba livia) em dois entrepostos no Estado de São Paulo. Ao longo de um ano, mensalmente 10 pombos foram capturados em cada entreposto para a colheita de amostras de suabe cloacal e sangue. A técnica de soroaglutinação rápida em placa (SAR) foi utilizada para a detecção de anticorpos anti-M. synoviae, anti-M. gallisepticum e anti-S.Pullorum/Gallinarum; para a confirmação dos sororeagentes foram utilizadas a prova de inibição da hemaglutinação e soroaglutinação lenta, respectivamente. Para a detecção do DNA de C. psittaci e RNA de AMPV-1 foram utilizados métodos moleculares, PCR e RT-PCR. Para investigação de anticorpos anti-APMV-1 foi empregada a técnica de HI. Na SAR, 3,3% dos soros foram reagentes para M. synoviae; 2,5% para M. gallisepticum e 0,4% para S. Pullorum/Gallinarum. No entanto, essas amostras foram negativas nas técnicas confirmatórias. A ocorrência do APMV-1 não foi detectada. O DNA de C. psittaci foi detectado em 13,3% das amostras sendo 10,8% provenientes de aves capturadas na estação seca e 15,8% na estação chuvosa. Tais resultados são relevantes, pois demonstram que a C. psittaci ocorre em pombos presentes em áreas públicas frequentadas por um grande número de pessoas. Frente à escassez de pesquisas realizadas em Columbiformes no país, novos estudos são necessários para a determinação do real risco que pombos-domésticos podem representar quanto à transmissão de patógenos para aves comerciais e a influência da sazonalidade na disseminação desses microrganismos. / Columbiformes may play an important role in the epidemiology of pathogens with zoonotic potential or economic impact in the poultry industry. Among these pathogens there are Mycoplasma spp., Salmonella spp., Avian Paramyxovirus type 1 (APMV-1), included in the National Poultry Health Program (PNSA) and Chlamydophila psittaci, etiologic agent of an important zoonosis associated with wild birds. Thus, the aim of this study was to investigate, seasonally, the occurrence of the pathogens listed above in feral pigeons (Columba livia) in two warehouses in São Paulo State. During one year, 10 birds were captured monthly in each locality and cloacal swabs and blood samples were collected from each pigeon. The rapid seroagglutination test was performed for the detection of antibodies against M. synoviae, M. gallisepticum and Salmonella Pullorum/Gallinarum. Positive results were submitted to the hemagglutination inhibition and slow seroagglutination test, respectively. For the C. psittacis DNA and APMV-1s RNA diagnosis, molecular techniques PCR and RT-PCR were performed. Hemagglutination inhibition test was also performed in order to detect antibodies against APMV-1. From the serum samples analyzed by rapid seroagglutination test, 3.3% were positive for M. synoviae, 2.5% for M. gallisepticum and 0.4% for S. Pullorum/Gallinarum. However, none of these samples was positive on the confirmatory tests. APMV-1 was not detected in any of the laboratory tests used. C. psittacis DNA was detected in 13.3% of the samples being, 10.8% from pigeons captured during the dry season and 15.8% in the rainy season. These results are relevant since they indicate that C. psittaci occurs in birds living in public areas frequented by a large number of people. The occurrence of the other pathogens was not detected. Nevertheless, due to lack of information about the pigeons sanitary status in the country, additional researches are necessary to determine the risk that feral pigeons can pose in the transmission of pathogens for poultry and the influence of each season in the spread of these microorganisms.

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA / Reusing litter is a common practice in broiler farming. However, it requires the adoption of efficient procedures for inactivating and controlling residual microorganisms during downtime between flocks to ensure sanitary control over the next flock and the quality of the broiler meat. The broiler production adopts a series of stringent precautionary measures to avoid sanitary emergencies and should be able to employ appropriate control measures. In addition, international consumer markets require proof of the efficiency of treatment methods for broiler litter reuse. The efficiency of broiler litter treatments on pathogens is variable and multifactorial and can be influenced by the treatment method and/or microorganisms evaluated. This study aimed to evaluate the efficiency of different strategies of treatment of broiler litter on Newcastle disease virus (NDV), Infectious bursal disease virus (IBDV) and Salmonella Heidelberg. Total enterobacteria counts were carried out as an indicator of microbiological quality of litter. First, the experimental contamination of the broiler litter by viruses was standardized, comparing the seeder birds inoculated versus the direct spray of the virus in the broiler litter. To evaluate the treatments, reused broiler litter was contaminated with the three microorganisms and submitted to the treatments (T): T1- shallow fermentation; T2- quicklime; T3- shallow fermentation followed by quicklime; and, T4- untreated. The broiler litter was submitted to bacteriological and physico-chemical analyzes during treatment. Sentinel chicks were housed on the broiler litter treated and further monitored by clinical evaluation, as well as microbiological, serological and molecular tests. The results demonstrated that seeder birds were efficient to stablish viral contamination in broiler litter. T1 was superior in reducing total enterobacteria in the broiler litter. The evaluation of sentinel chicks also indicated that T1 and T3 inactivated IBDV in the broiler litter. T2 was not able to reduce the microorganisms evaluated, and its association with T1 (T3) did not enhance the treatment action. NDV did not survive in broiler litter, regardless of the treatment applied. S. Heidelberg survived in broiler litter after all treatments evaluated and was also detected in the sentinel chicks. The antimicrobial activity of T1 and T3 was associated to ammonia levels present in the broiler litter. The results reveal that shallow fermentation is efficient to control residual IBDV and total enterobacteria in recycled broiler litter. However, other strategies should be considered in the presence of S. Heidelberg. / A reutilização da cama aviária é uma prática comum na avicultura de corte. Porém, o reuso da cama requer a adoção de procedimentos eficientes na inativação e controle de micro-organismos indesejáveis no intervalo entre os lotes, para preservar a saúde avícola e a qualidade do alimento produzido. A preocupação com as questões sanitárias na avicultura engloba a saúde dos frangos e do consumidor. A produção está sujeita às emergências sanitárias e deve estar preparada para empregar medidas adequadas de contenção e controle. Além disso, os mercados consumidores internacionais demandam comprovação da eficiência dos métodos de tratamento para o reuso da cama entre lotes de frangos. A eficiência dos tratamentos de cama sobre os patógenos é variável e multifatorial e pode ser influenciada pelo método de tratamento e/ou pelos micro-organismos avaliados. Deste modo, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a eficiência de diferentes estratégias de tratamento da cama aviária sobre vírus da Doença de Newcastle (VDNC), vírus da Doença Infecciosa da Bursa (VDIB) e Salmonella Heidelberg. Enterobactérias totais foram analisadas como indicador da qualidade microbiológica da cama aviária. Inicialmente, a contaminação experimental pelos vírus aviários foi padronizada, comparando-se a excreção por aves inoculadas (seeder birds) versus a aspersão direta dos vírus na cama. Para avaliação dos tratamentos, cama aviária reutilizada foi contaminada com os três micro-organismos e submetida aos tratamentos (T): T1- fermentação plana; T2- cal virgem; T3- fermentação plana seguida de adição de cal virgem; T4- não tratado. A cama aviária foi submetida às análises bacteriológicas e físico-químicas durante o tratamento. Aves sentinelas foram alojadas sobre a cama tratada, sendo monitoradas por meio de avaliação clínica e análises microbiológicas, sorológicas e moleculares. Os resultados demonstraram que as seeder birds foram eficientes em estabelecer a contaminação viral da cama. O T1 foi superior na redução de enterobactérias totais na cama aviária. A avaliação das aves sentinelas indicou que ambos T1 e T3 inativaram VDIB na cama aviária. O T2 não foi eficiente sobre os micro-organismos avaliados e sua associação ao T1 (T3) não potencializou a ação do tratamento. O VDNC não sobreviveu na cama, independente do tratamento aplicado. S. Heidelberg permaneceu viável na cama de todos os tratamentos, sendo também detectada nas aves sentinelas. A atividade antimicrobiana dos T1 e T3 foi relacionada aos maiores teores de amônia presentes na cama aviária. Os resultados indicam que a fermentação plana é eficiente para o controle do VDIB e enterobactérias totais residuais na cama aviária reutilizada. Todavia, na presença de S. Heidelberg outras alternativas devem ser consideradas no controle deste agente de importância na saúde animal e pública.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA178.pdf: 1072214 bytes, checksum: 2feb2bb4cea985aa369f44b04592defd (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / Chicken anemia virus (CAV) is an important virus that belongs to Circoviridae family, Gyrovirus genre, known to lead to significant losses in poultry, the viruses can cause immunosuppression and disease especially in young birds. CAV was the only virus of this family known to infect chickens by 2011, after the discovery of a new virus, the Avian Gyrovirus type 2 (AGV2). According to the literature, AGV2 is closely related to CAV, as well as being widely distributed in chickens in Brazil and other countries, but its pathogenic potential is unknown and studies on molecular epidemiology are still scarce. The present study aimed to detect CAV (Nested-PCR), and AGV2 (PCR) on DNA extracted from samples of thymus tissue of broiler chickens housed on two states of southern Brazil. In addition, perform phylogenetic analysis of AGV2 positive samples. Results showed that of 180 birds tested, 105 (58.33%) were positive for CAV and 39 (21.67%) positive for AGV2. On the positive material for AGV2 were selected eleven amplicons for sequencing and phylogenetic analysis, where it became clear that there were no differences among the samples. The sequences obtained were compared with samples from other countries, many of these detected in humans (HGyV). It was not possible in the present work, observe correlation between geographical distribution and genetic variability among most samples AGV2 now studied / O vírus da anemia das galinhas (CAV) é um importante vírus pertencente a família Circoviridae, gênero Girovirus, conhecido por levar a perdas significativas na avicultura, este vírus pode causar imunossupressão e doença principalmente em aves jovens. O CAV era o único vírus desta família conhecido por infectar galinhas até 2011, após a descoberta de um novo vírus, o Girovírus Aviário tipo 2 (AGV2). Segundo consta na literatura, o AGV2 está estreitamente relacionado ao CAV, além de estar amplamente distribuído em frangos no Brasil e em outros países, mas seu potencial patogênico ainda é desconhecido e trabalhos sobre sua epidemiologia molecular ainda são bastante escassos. Assim, o presente trabalho teve por objetivo realizar a detecção de CAV (Nested-PCR), e AGV2 (PCR) em amostras de DNA extraídas de tecido do timo, de aves alojadas em plantéis de frango de corte de dois estados da região Sul do Brasil. Além disso, realizar a análise filogenética de amostras positivas para AGV2. Os resultados apontaram que das 180 aves testadas 105 (58,33%)foram positivas para CAV e 39 (21,67%) positivas para AGV2. Do material positivo para AGV2 foram selecionados onze amplicons para sequenciamento e análise filogenética, onde foi possível evidenciar que não houve diferenças entre o material analisado. As sequências obtidas foram comparadas com amostras provenientes de outros países, muitas destas detectadas em humanos (HGyV), não tendo sido possível, no presente trabalho, observar correlação entre distribuição geográfica e variabilidade genética entre a maioria das amostras de AGV2 ora estudadas