Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e de distribuição cosmopolita. E. coli coloniza o intestino de humanos e outros animais endotérmicos logo após o nascimento, estabelecendo-se como um importante membro da microbiota intestinal. Algumas cepas de E. coli podem adquirir fatores de virulência, assumindo assim, uma natureza patogênica, como é o caso das E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). As cepas ExPEC apresentam a capacidade de colonizar e se disseminar em diversos nichos no hospedeiro, e são divididas em UPEC (E. coli uropatogênica), NMEC (E. coli causadora de meningite neonatal) e APEC (E. coli patogênica para aves). UPEC, NMEC e APEC compartilham fatores associados à virulência. Para serem aptas a causar doença, cepas ExPEC devem apresentar pelo menos um fator associado à adesão, um fator para captação de ferro (sideróforo) e um fator de resistência ao soro, podendo, também, apresentar genes que codificam toxinas e invasinas. Embora sejam conhecidos muitos fatores de virulência associados à patogenicidade de cepas ExPEC, a regulação da expressão de tais fatores ainda não foi elucidada. Fumarato-nitrato-redutase (FNR) é uma proteína que atua como regulador global, agindo como um sensor da presença de oxigênio em bactérias gramnegativas. Já foi demonstrado que FNR está relacionada à regulação da virulência de bactérias patogênicas como Shigella flexneri e Salmonella enterica serovar Typhimurium. Este trabalho teve como objetivo a análise epidemiológica e caracterização de cepas APEC, bem como a investigação do controle da expressão de fatores associados à virulência de ExPEC pelo regulador global FNR. Os resultados da análise epidemiológica das cepas APEC mostram o perfil de resistência aos agentes antimicrobianos, a prevalência dos fatores de virulência e dos grupos filogenéticos (de acordo com a classificação EcoR) e a relação filogenética dos isolados, fornecendo um panorama da caracterização de E. coli patogênicas aviárias de lesões severas de celulite e de infecção sistêmica oriundas da região sul do Brasil. Em relação ao FNR, este estudo mostrou a influência deste regulador sobre importantes fatores associados à virulência, estando envolvido no controle de várias etapas do estabelecimento da infecção por cepas ExPEC. A deleção de fnr na cepa UPEC CFT 073 reduziu a motilidade, a expressão das fimbrias tipo I e tipo P, reduziu a expressão da hemolisina e controlou a expressão da ilha de patogenicidade do α- cetoglutarato. Além disso, a deleção de fnr fez tornou as bactérias incapazes de invadir células dos rins e da bexiga e de causar doença in vivo em camundongos de 6 semanas. FNR também foi capaz de controlar as etapas da infecção por NMEC 56. Uma vez deletado, as bactérias perderam a capacidade de causar bacteremia, de crescer no fluido cerebrospinal e de causar doença in vivo em ratos de 5 dias de idade. A deleção de fnr em APEC O1 resultou na diminuição da expressão da proteína OmpT plasmidial, da fímbria do tipo I e do auto-transportador AatA. A principal contribuição deste trabalho foi demonstrar que FNR atua na regulação da expressão de importantes fatores associados à virulência de cepas ExPEC (UPEC, NMEC e APEC), sendo importante para o estabelecimento da infecção por essas cepas. Neste trabalho, verificamos que, além da função já conhecida de regular os genes envolvidos na manutenção de um meio anaeróbico, FNR também atua no controle de genes associados à virulência de cepas ExPEC, refletindo na capacidade de causar doença que tais cepas apresentam. / Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, facultative anaerobic and has cosmopolitan distribution. E. coli colonizes the intestine of humans and other endothermic animals immediately after birth, establishing as an important member of the intestinal microbiota. Some strains of E. coli can acquire virulence factors thereby assuming a pathogenic nature, as in the case of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC strains have the ability to colonize and spread out in different niches of the host, and are divided into UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (newborn meningitis E. coli) and APEC (avian pathogenic E. coli). UPEC, NMEC and APEC share virulence factors. To be able to cause disease, ExPEC strains must produce virulence factors required for adherence, for iron uptake (siderophore) and for resistance to serum and may also contain genes encoding toxins and invasins. Although many virulence factors associated with the pathogenicity of ExPEC strains are known, the regulation of the expression of these factors has not yet been fully elucidated. Fumarate nitrate reductase (FNR) is a global regulatory protein, acting as a sensor of oxygen in Gram- negative bacteria. It has been shown that FNR relates virulence of pathogenic bacteria such as Shigella flexneri and Salmonella enterica serovar Typhimurium. The aim of this study was to do an epidemiological analysis and characterization of APEC strains as well as the investigation of regulation of ExPEC’s virulence factors by the global FNR regulator. The results of epidemiological analysis of APEC strains showed the profile of antimicrobial resistance , the prevalence of virulence factors and phylogenetic groups (according to the EcoR group) and the phylogenetic relationship of the isolates, providing an overview of the characterization of avian pathogenic E. coli causing severe cellulitis lesions and systemic infection originating from southern Brazil. In relation to FNR, this study showed the influence of this important regulator of virulence factors that is involved in controlling various stages of establishment of infection by ExPEC strains. Deletion of fnr in UPEC strain CFT 073 reduced motility and expression of type I and type P fimbriae, reduced the expression of hemolysin and control the expression of the pathogenicity island of α -ketoglutarate. Furthermore, fnr mutant strains were unable to invade cells of kidney and bladder, and to colonize the urinary tract of 6 weeks-old mice. FNR was also able to control the stages of infection of NMEC 56. The fnr mutant lost its ability to cause bacteremia, grow in cerebrospinal fluid, cause disease in 5 days old rats. Deletion of fnr in APEC O1 resulted in decreased expression of genes corresponding to the plasmid encoded OmpT protein, type I fimbriae and autotransporter AatA. The main contribution of this work was to demonstrate that FNR regulates expression of important virulence factors of ExPEC strains (UPEC, NMEC and APEC), which is important for the establishment of infection by these strains. In this work, we found that, besides the already known function in regulating genes involved in maintaining an anaerobic environment, FNR also acts in the control of virulenceassociated genes of ExPEC strains, reflecting the ability of these strains to cause disease.

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T17:06:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aragao_AnnelizeZambonBarbosa1984-_M.pdf: 1442209 bytes, checksum: 20b02ae5cd0351830e8e623b5e9c17a4 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Escherichia coli isoladas de lesões de celulite aviária em frangos de corte produzem uma citotoxina que causa intensa vacuolização citoplasmática em células de origem aviária, mas não em células de mamíferos. Esta citotoxina foi denominada Vat (vacuolating autotransporter toxin) e apresenta massa molecular de 56 kDa e ponto isoelétrico de 6,37. Estudos preliminares comprovaram que a Vat induz, em frangos de corte, respostas inflamatórias liberando as citocinas TNF-a e IL-10, indicando o seu papel relevante no desenvolvimento da celulite aviária. A dose citotóxica para 50% das células foi determinada em 40 µg.mL-1. A Vat aplicada sobre cultura de células FEG (fibroblasto de embrião de galinha) induz perda da viabilidade em 50% células após 18 horas de ensaio. Ensaios com a toxina indicam que, após 24 horas, os lisossomos mostram-se bastante comprometidos (37% viáveis), a viabilidade mitocondrial decresce e se mantém durante as 24 horas do ensaio em cerca de 55%, havendo uma redução acentuada das mitocôndrias viáveis após 36 horas da aplicação da Vat. A membrana plasmática das células FEG também sofre alterações de integridade, liberando 66,7 unidades de LDH (lactato desidrogenase)/mL, após 12 horas de ensaio (pico máximo de liberação, que corresponde a 51,7% do conteúdo total de LDH em células FEG). A Vat induz alterações no citoesqueleto das células FEG e os ensaios com o marcador fluorescente Acridine Orange indicam que há um aumento de RNA no citoplasma das células. Neste trabalho o gene vat foi detectado em amostras de APEC (filogrupos A e B1), UPEC e SEPEC (ambas em filogrupos B2 e D). Todas as amostras positivas para vat foram examinadas em células, sendo que 54% (27/50) apresentaram atividade vacuolizante em células FEG. Nossos resultados indicam que a Vat é uma toxina que induz diversas ações intracelulares, podendo ser chamada de toxina multifuncional / Abstract: Escherichia coli isolated from avian cellulitis lesions in broilers produce a cytotoxin that causes intense vacuolation in avian cells, but not in mammals cells. This cytotoxin, called Vat (vacuolating autotransporter toxin), has a 56 kDa protein and has a isoeletric point of 6.37. Preliminary studies have shown the Vat induce inflammatory response in broilers, by releasing cytokines TNF-a and IL-10, what indicates it can act in the avian cellulitis development. The cytotoxic dose for 50% of the cells was fixed at 40 µg.mL-1. The tests using CEF (chicken embryo fibroblasts) cells indicate Vat leads to cell viability loss in 50% of the cells after 18 hours. The tests with the toxin indicate that after 24 hours the lysosomes are 37% viable, the mitochondrial viability decreases after 24 hours (about 55%), with a remarkable reduction of viable mitochondria after 36 hours of Vat application. The CEF cells' plasma membrane of also loses integrity, releasing 66.7 units LDH (lactato dehydrogenase)/mL, after 12 hours of test (which is 51.7% of the total LDH content in CEF cells). The CEF cells' cytoskeleton also changed when exposed to Vat. Essays involving the fluorescent dye Acridine Orange indicate a RNA increase in the cytoplasm of cells. In this work the vat gene was detected in samples of APEC (A and B1 philogroups), UPEC and SEPEC (B2 and D philogroups). All vat positive samples have been tested for vat in cells, and 54% (27/50) of them have shown vacuolizing activity in CEF cells. The results indicate Vat is a toxin which induces various intracellular actions, therefore it can be called a multifunctional toxin / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

E. coli isoladas de lesões de celulite aviária em frangos de corte produzem uma citotoxina, denominada ECVF (E. coli Vacuolating Factor), que causa intensa vacuolização citoplasmática em células aviárias, mas não em células mamárias. A importância de ECVF na patogenia da celulite foi avaliada neste estudo. ECVF purificado foi inoculado subcutaneamente em frangos de corte, e induziu sinais de inflamação nos tecidos subcutâneo, adiposo e conjuntivo. Em ensaios de citotoxicidade, foi verificado que ECVF induz alterações citoplasmáticas e nucleares que podem afetar diretamente o metabolismo celular, entre elas condensação da cromatina e fragmentação nuclear, intensa vacuolização citoplasmática e desorganização do citoesqueleto, conduzindo à apoptose. Também foi verificada interação de ECVF com proteínas de células aviárias, em detrimento das de células de mamíferos, sugerindo uma especificidade da toxina a este tipo celular. Nossos resultados, apoiados por dados de estudos anteriores, permitem sugerir um importante papel de ECVF na patogenia da celulite aviária. / E. coli isolated from cellulitis lesions in broiler chickens produce a citotoxin, called ECVF (Escherichia coli Vacuolating Factor), which causes intense cytoplasm vacuolization in avian cells, but not in mammalian cells. The importance of ECVF in the pathogenesis of avian cellulitis was assessed in this study. Purified ECVF was inoculated subcutaneously in broiler chickens, and induced signs of inflammation on subcutaneous, adipose and connective tissues. In citotoxicity assays, we verified that ECVF induced cytoplasmic and nuclear alterations, which can affect cellular metabolism directly, such as chromatin condensation and nuclear fragmentation, intense cytoplasm vacuolization, and disorganization of cytoskeleton, leading to apoptosis. It was also verified the interaction of ECVF with proteins of avian cells, instead of those from mammalian cells, suggesting the specificity of this toxin to this cells. Our results, supported by data from previous studies, suggest an important role of ECVF in the pathogenesis of avian cellulitis.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:02:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaSilva_LiviaPilattiMendes_M.pdf: 1602121 bytes, checksum: 21e5b9daa8ce74359c48e82c96cf7a13 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Linhagens de Escherichia coli patogênica para aves causam doenças extraintestinais em aves, levando a perdas econômicas consideráveis para a indústria avícola em todo o mundo. Fatores de virulência ainda não conhecidos podem apresentar papéis importantes na patogenicidade, os quais podem ser significativos para o desenvolvimento de medidas de controle de processos infecciosos dessas linhagens. Invasinas permitem que o patógeno invada células hospedeiras, sobrepujando as defesas do hospedeiro, por interagir com receptores específicos na superfície celular. Baseando-se em análises do genoma da linhagem APEC SEPT362, detectou-se a presença de uma provável invasina, homóloga ao gene ychO, ainda não caracterizado, da linhagem E. coli str. K-12 substr. MG1655, sendo seu efeito na patogenicidade estudado. Neste trabalho, a linhagem SEPT362 deficiente para ychO reduziu a taxa de mortalidade em pintos, a adesão a células de fibroblasto de embrião de galinha (FEG), a invasão em células fibroblasto de embrião de galinha (CEC-32), a sobrevivência em macrófagos de aves (HD11), a formação de biofilme e a motilidade. Esses resultados sugerem, pela primeira vez, que o gene ychO codifica para uma invasina e que tem papel na patogenicidade da linhagem APEC SEPT362. Além dos diversos fatores de virulência, o estudo de diferentes tipos de sinais extracelulares que medeiam a comunicação entre bactérias e regulam a expressão gênica abre grandes possibilidades no estudo de mecanismos de patogenicidade e possíveis meios de interferir nos mesmos, transformando organismos patogênicos em organismos não virulentos. Quorum sensing (QS) é um mecanismo dependente da densidade celular bacteriana que as permitem agir como complexos multicelulares, aumentando suas chances de sobrevivência no meio ambiente. O sistema QS autoindutor 2 (AI-2) é um sistema de comunicação universal de bactérias mediado pelo AI-2, produzido pela ação da enzima LuxS. O sistema QS autoindutor 3 (AI-3) é um sistema que pode também mediar a comunicação entre reinos, sendo regulado pela hisitidina quinase QseC. Neste contexto, mutantes para os genes luxS e qseC foram construídos na linhagem SEPT362. A linhagem deficiente para luxS apresentou uma redução significativa na adesão a células FEG, devido a um papel do gene na regulação da fímbria do tipo 1. A linhagem deficiente para qseC teve uma menor taxa de mortalidade em pintos e uma redução significativa na adesão a células FEG, pela falta da fímbria do tipo 1 no mutante / Abstract: Avian pathogenic Escherichia coli strains cause extraintestinal diseases in poultry, leading to substantial economic losses to the poultry industry worldwide. Virulence factors not yet known may play important roles in pathogenicity, which may be significant for measures control development of infectious processes of these strains. Invasins allow the pathogen to invade host cells, overcoming host defenses by interacting with specific cell surface receptors. Based on analysis of APEC SEPT362 strain genome detected the presence of a putative invasin gene homologous to ychO, not yet characterized, of E. coli str. K-12 substr. MG1655, and its effect on pathogenicity was studied. In this work, the SEPT362 strain deficient for ychO reduced the mortality rate in chicks, the adherence to chicken embryo fibroblast (CEF) cells, the invasion of chicken embryo cells (CEC-32), the survival in poultry macrophages (HD11), the motility and biofilm formation. These results suggest, for the first time, that ychO gene encodes for an invasin and plays a role in APEC SEPT362 pathogenicity. In addition to the many virulence factors, the study of different types of extracellular signals that mediate communication between bacteria and regulate gene expression opens up great possibilities to study pathogenic mechanisms and possible ways to interfere in it, transforming pathogenic organisms into non-virulent organisms. Quorum sensing (QS) is a mechanism dependent on the bacterial cell density that enables them to act as multicellular complexes, increasing their chances of survival in the environment. The QS system autoinducer 2 (AI- 2) is a universal communication system of bacteria mediated by AI- 2 produced by the action of the enzyme LuxS. The QS system autoinducer 3 (AI- 3) is a system that can also mediate communication between realms, being regulated by kinase QseC. In this context, mutants for the luxS and qseC genes were built in SEPT362 strain. The strain deficient for luxS showed a significant reduction in CEF cell adhesion due to a role in the regulation of gene type 1 fimbriae. The deficient strain for qseC had a lower rate of mortality in chicks and a significant reduction in cell adhesion to CEF, due to a lack of type 1 fimbriae in the mutant / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Marcelo Brocchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T05:13:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_JacquelineBoldrinde_D.pdf: 5619127 bytes, checksum: 79177e4233fdbb891e6530eb0f3438bd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Escherichia coli patogênica para aves (APEC) é responsável por inúmeras perdas no setor avícola mundial, por causar uma série de doenças nas aves que se apresentam de forma sistêmica ou localizada as quais são, coletivamente, denominadas colibacilose. Os mecanismos de virulência destas linhagens patogênicas para aves e, possivelmente, patogênicas para seres humanos ainda não foram totalmente elucidados. Este trabalho foi desenvolvido com o intuito de estudar genes possivelmente envolvidos com a patogenicidade de uma linhagem APEC causadora de Síndrome da Cabeça Inchada (SCI-07) ONT:H31, a partir de resultados obtidos em um microarranjo realizado in vitro, o qual comparou a linhagem em estudo à linhagem padrão E. coli EHEC 8624 (linhagem enterohemorrágica). Nove genes, detectados como sendo super-expressos no microarranjo, nas condições estudadas, foram selecionados para construção de mutantes nulos e de seus complementos [feoA (transporte de ferro), nirC (transportador de nitrito), flgE ( gancho flagelar), tyrR (regulador de transcrição da síntese de aminoácidos aromáticos), potF (subunidade periplasmática do transportador putrescina), yehD (possível fimbria), bfr (bacterioferrina), csgA ( subunidade principal da curlina) e entD (enteroquelina)]. Os mutantes construídos foram avaliados quanto as suas capacidades de adesão e invasão em cultivos celulares, e quanto ao seu potencial patogênico em aves de um dia de idade em comparação à cepa selvagem. As linhagens ?bfr, ?csgA e ?nirC apresentaram diminuição da capacidade de adesão em fibroblastos de aves (linhagem FEG) em comparação à linhagem selvagem em ambos os modelos adotados: na presença e ausência de alpha-D-mannopyranoside; a linhagem ?potF apresentou diminuição da adesão apenas na ausência de alpha-D-mannopyranoside. Os mutantes ?csgA e ?tyrR apresentaram redução na capacidade de invadir linhagem de células de trato respiratório humano (linhagem Hep-2). Nenhum mutante avaliado mostrou alteração na capacidade de invadir fibroblastos de aves (linhagem CEC-32). Os mutantes ?flgE e ?tyrR mostraram diminuição na capacidade de invadir e sobreviver em macrófagos de aves (linhagem HD11). A motilidade das linhagens mutantes ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC e ?feoA foi aumentada enquanto o mutante ?tyrR mostrou redução de motilidade e o mutante ?flgE tornou-se imóvel. Nenhuma linhagem mutante obtida mostrou a mesma capacidade da linhagem selvagem em causar mortalidade em aves de um dia; ?feoA tornou-se hipervirulenta e todos os demais mutantes apresentaram atenuação em diferentes graus, sendo a linhagem ?entD totalmente atenuada e, portanto, promissora quanto ao seu uso como linhagem vacinal.para o combate à colibacilose em aves, ou como linhagem carreadoras de epítopos presentes em outras linhagens APEC / Abstract: Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) is responsible for significant economic loses in the poultry industry worldwide, by cause a range of systemic or localized diseases in poultry collectively termed colibacillosis. The virulence mechanisms of these pathogenic strains for poultry and possibly pathogenic for humans have not been fully elucidated. This work was developed in order to study genes potentially involved in the pathogenicity of an APEC strain isolated from a Swollen Head Syndrome case (SCI- 07) ONT:H31; since the results obtained in a microarray performed in vitro, which compared the SCI-07 strain to the standard strain E. coli 8624 EHEC (enterohemorrhagic strain). Nine overexpressed genes in microarray under the conditions studied were selected for construction of null mutants and their complements [feoA (iron transport), nirC (nitrite transporter), flgE (flagellar hook), tyrR (transcriptional regulator of the aromatic amino acids biosynthesis), potF (periplasmic putrescine transporter subunit), yehD (putative adhesin), bfr (bacterioferritin), csgA (major curling subunit) and entD (enterochelin)]. The mutants constructed were evaluated for their capacity for adhesion and invasion in cell cultures, and for its pathogenic potential in one-day-old chickens in comparison to the wild type strain (WT). The ?bfr, ?csgA and ?nirC strains showed decreased adhesion capacity on avian fibroblasts (CEF cells) compared to the WT in both models adopted: in the presence and absence of alpha-D-mannopyranoside, the ?potF strain showed decrease on adhesion only in the absence of alpha-D-mannopyranoside. The ?csgA and ?tyrR mutants had reduced ability to invade human larynx cell line (Hep-2 cells). No mutant showed changes in the capacity of invade avian fibroblasts birds (CEC-32cells). The ?flgE and ?tyrR mutants showed decreased ability to invade and survive into avian macrophages (HD11 cells). The motility of mutant strains ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC and ?feoA was increased while the ?tyrR mutant showed reduced motility and the mutant ?flgE became nonmotile. No mutant strain showed the same capacity of the WT in cause mortality in one-day-old chickes; ?feoA became hipervirulenta and all other mutants showed attenuation in different degrees, including the ?entD that was completely attenuated and a promising vaccine candidate strain to combat colibacillosis in poultry, or as a carrier strain of epitopes present in other APEC strains / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular