Parkinson's disease is characterized by progressive degeneration of substantia nigra (SN) and subsequently loss of the nigrostriatal circuit. Many strategies have attempted to reconstruct this circuit but failed to satisfy clinical trials. The inhibitory environment of the adult CNS and the long distance between the SN and the striatum make true reconstruction difficult. To reconstruct this circuit, we used a transplant-pathway targeting model. Several putative pathway targeting molecules were examined for their ability to direct the growth of axons from a dopaminergic transplant. For a proof-of-principle study, adenoviral and lentiviral encoded glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), GDNF-receptor alpha1 (GFRa1 ), or netrin-1 were injected along the corpus callosum individually or in combination. Treatment with individual factors leads to modest growth with few axons extending the entire length of the pathway. Combined treatment with either GDNF/GFRa1 or GDNF/netrin-1 induced the most robust growth towards the contralateral striatum. GDNF/netrin-1 showed the most consistent growth, with about 80% of the axons growing to the farthest injection site on the contralateral side. To determine if this combination of guidance molecules could be used to reconstruct the nigrostriatal pathway, we examined axon outgrowth from transplants placed within the SN in the 6-0HDA-Iesioned hemiparkinsonian animal model. A pathway from the SN to the striatum was made by injecting lentivirus encoding either GDNF and netrin-1 or GDNF and GFRa1, along the internal capsule, from the SN to the striatum. In another cohort of animals lentivirus encoding GFP was used as a control. A piece of embryonic VM tissue was transplanted into the SN two weeks after lentivirus injections. Compare to the GFP control group, a significantly greater number of dopaminergic axons grew from the transplants towards the striatum ten weeks after transplantation. Retrograde tract tracing showed the dopaminergic axons were from A9 cells in the transplant. Behavioral studies showed a significant reduction in number of amphetamine-induced rotations in GDNF/netrin-1 treated animals. Functional recovery strongly correlated with the number of dopaminergic fibers growing out from the transplant. This study shows that a functional nigrostriatal pathway can be reconstructed by guiding axonal growth from the dopaminergic neurons transplanted in the SN along a preformed growth-supportive pathway extending into the striatum. Refinement of this technique could be beneficial for PD patients in the future.

La nutrition au cours de la période postnatale précoce programme l’activité de l’axe somatotrope à l’âge adulte (GH/IGF-1). Une altération de la nutrition chez les souriceaux au cours de la lactation altère la croissance staturo-pondérale de façon permanente et augmente leurs susceptibilités à développer des pathologies cardio-métaboliques à l’âge adulte. La restriction au cours de la lactation induit une diminution des taux plasmatiques en IGF-1 et en leptine. Ceci est associé à une diminution transitoire de l’innervation de l’éminence médiane par les neurones GHRH, ce qui induit une hypoplasie hypophysaire permanente en cellules somatotropes. Durant ma thèse, j’ai étudié l’impact de la nutrition périnatale sur la mise en place de l’axe somatotrope, notamment les mécanismes impliqués dans la régulation du développement des neurones GHRH. Les cultures d’explants de noyaux arqués issus de souriceaux normalement nourris indiquent que l’IGF-1 stimule de façon préférentielle la croissance axonale des neurones GHRH par l'intermédiaire des voies PI3K/AKT et MAPK. La leptine présenterait quant à elle un effet plus global sur les neurones du noyau arqué, stimulant la croissance axonale des neurones GHRH et des neurones orexigène à NPY/AgRP. Les neurones GHRH issus de souris restreintes sont quant à eux résistants à la stimulation de la croissance axonale par l’IGF-1 ou la leptine. Concernant l’IGF-I, cette résistance est associée à une altération des capacités de phosphorylation de la voie PI3K/AKT, tandis que celles de l’IGF-1R et de la voie MAPK ne sont pas altérées. / Nutrition during lactation programs the activity of the somatotropic axis (GH/IGF-1). Alteration of nutrition during the early postnatal period in mice induces increased susceptibility to develop cardiovascular and metabolic pathologies later in life. Nutritional restriction during lactation permanently alters growth of mice. Ten days old restricted pups present decreased plasmatic level of IGF-1 and Leptin. They also present a transient alteration of median eminence innervation by GHRH neurons, which induce a permanent somatotroph cells (GH) hypoplasia in pituitary. The aim of my thesis was to study the impact of nutrition during the perinatal period on the programming of the somatotropic axis, notably the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of GHRH neuronal development. In vitro cultures of arcuate nucleus explants of hypothalamus from normally fed pups indicate that IGF-1 preferentially stimulates axonal growth of GHRH neurons by its signaling pathways PI3K/AKT and MAPK. Leptin present a more global effect and is able to stimulate axonal growth of arcuate nucleus neurons, including GHRH and AgRP neurons. GHRH neurons from restricted pups are resistant to the stimulation of axonal growth by IGF-1 or leptin. Regarding IGF-1, this resistance is associated with an alteration of phosphorylation capacities of the PI3K/AKT pathway, whereas those from IGF-1R and MAPK are not altered.

L’émergence de la notion selon laquelle la réponse inflammatoire exercerait des effets bénéfiques dans la pathologie ischémique cérébrale, en particulier au cours de la phase de récupération fonctionnelle nous a conduit à étudier l’implication des cellules microgliales dans le déclenchement des mécanismes de neuroplasticité post-ischémique. Notre étude a été réalisée chez le Rat soumis à une ischémie focale permanente induite par photothrombose. L’activation microgliale a été modulée par un traitement au 3-aminobenzamide (3-AB), un inhibiteur spécifique de la poly(ADP-ribose)polymérase-1, jouant un rôle prépondérant dans l’activation de ces cellules. Nos données montrent que le 3-AB entraîne une diminution importante de l’activation microgliale aux temps courts associée à plus long terme à une réduction de l’expression de la synaptophysine et de GAP-43, respectivement marqueurs des processus de synaptogenèse et croissance axonale. L’ensemble de ces données indique donc que les cellules microgliales constituent effectivement des acteurs cellulaires essentiels de la neuroplasticité post-ischémique. Le Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) se révélant un candidat potentiellement capable de promouvoir de tels changements, nous avons pu mettre en évidence que ces cellules représentaient de façon précoce une source importante de BDNF. Ces résultats ont été confirmés par la nette diminution des taux de BDNF mesurés dans les zones corticales lésionnelles et péri-lésionnelles des animaux traités par le 3-AB. Dans un deuxième temps, le métabolisme complexe de cette neurotrophine à travers l’existence de deux formes, pro- et mature, aux effets biologiques opposés, nous a conduit à réaliser une étude spatio-temporelle des expressions post-ischémiques du BDNF total (ELISA), pro- et mature (Western blotting). Aux temps courts (4-24 h), les expressions du BDNF total, pro- et mature sont augmentées dans les territoires corticaux lésés, péri-lésionnels et homotopiques tandis qu’aux temps longs (8-30 j), le BDNF total reste accru dans les régions distantes de la zone infarcie (hippocampes et cortex contralatéral). Concernant les expressions des formes pro- et mature, nos résultats indiquent une augmentation entre 8 et 30 j uniquement dans les territoires hippocampiques. D’un point de vue cellulaire, le BDNF est exprimé du côté ipsilatéral dans les neurones et les cellules non neuronales tandis que du côté contralatéral, l’expression est limitée aux neurones. Nos résultats tout en faisant apparaître des divergences importantes dans les variations d’expressions du BDNF total (ELISA) et des différentes formes (Western blotting) indiquent que la mesure du BDNF total doit être couplée à une étude permettant de discriminer les deux formes. De plus, tout en confirmant l’implication de cette neurotrophine dans les mécanismes adaptatifs induits en réponse à une ischémie cérébrale, ces données suggèrent que les territoires distants de la zone lésée jouent un rôle majeur dans ces processus. / Evidences showing that under certain circumstances, inflammatory response could be neuroprotective and could also promote adult neurogenesis are growing. In this context, the objective of this work was to investigate the impact of microglial cells in the neuroplastic events. Rats were subjected to photothrombotic ischemia and microglial cells activation was blocked by the mean of poly(ADP-ribose)polymérase-1 (PARP-1) inhibition using 3- aminobenzamide (3-AB) since this protein has been shown to play a major role in this activation. Our results show that PARP-1 activity reduction was associated with a strong repression of the acute microglial activation. Beside, 3-AB treated animals exhibited a decrease in synaptophysin (synaptogenesis) and GAP-43 (axonal growth) expressions. Taken together, our data argue for a supportive role of microglial in adaptive brain plasticity events. According to the preponderant contribution of BDNF in these events, assessment of its cellular localization was performed, and confirmed that these cells represent a significant source. Beside, BDNF immunoreactivity (IR) in microglial cells and BDNF levels in the lesioned and surrounding lesioned areas were found decreased in 3-AB treated animals. However, since this neurotrophin can exert ambivalent biological actions through pro- versus mature forms, we investigate the proper effect of cerebral ischemia on total (Elisa), pro- and mature (Western blotting) expressions. Our results show that total, pro- and mature BDNF expressions are augmented in the early times (4-24h) of ischemia within the lesioned, the surrounding non lesioned and the contralateral cortical areas. At longer time points, total BDNF was still increased at 8d in regions distant from the lesion (hippocampi and contralateral cortex) while pro- and mature forms rise between 8d to 30d in hippocampic territories only. In term of cellular distribution, BDNF-IR was found in neurons but also in non neuronal cells ipsilaterally whereas in the opposite side BDNF staining was restricted to neurons. Our data while raising the question of the pertinence of total BDNF expression in a context of studying its supportive potential action indicate that such assessment has to be coupled with the discrimination of both forms. In addition, our data confirm the important role of BDNF in post-stroke adaptive mechanisms and argue in favour of an important contribution of the hippocampal territory and of the contralateral hemisphere in BDNF related post-stroke neuronal circuit remodelling suggesting that strategies targeting this hemisphere are likely to mediate functional compensation.

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Pendant le développement du système nerveux embryonnaire, des niveaux élevés d'énergie sont nécessaires à la croissance axonale des neurones et des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) vers leurs cibles cérébrales. Cette demande énergétique entraîne une augmentation des concentrations de lactate, ligand du récepteur GPR81/HCAR1. Cependant, le rôle du lactate et de son récepteur au cours du développement du système nerveux central (CNS) a été négligé. Ce mémoire de maitrise rapporte la présence du récepteur GPR81 sur des neurones (CGR) pendant le développement embryonnaire et à l’âge adulte chez la souris. L’effet d’activation du GPR81 par manipulation pharmacologique permet de réguler la morphologie des cônes de croissance et augmente la croissance axonale des CGR sur les explants de rétine in vitro. L’utilisation de souris transgénique gpr81-/- rendant le récepteur GPR81 déficient nous a permis de confirmer ces résultats. De plus, l’injection in vivo de CTb-Alexa Fluor 555 dans l’œil gauche et de CTb-Alexa Fluor 647 dans l’œil droit a permis de visualiser les projections des CGR dans le cerveau des souris gpr81+/+ et gpr81-/-. Les souris gpr81- /- présentent une diminution dans les projections ipsilatérales des CGR dans le corps géniculé latéral dorsal (CGLd). Toutefois, l’acuité visuelle testée à l’aide du réflexe oculomoteur ainsi que la sensibilité de la rétine suivant des flashs lumineux de différentes intensités mesurée par électrorétinogrammes (ERG) n’ont pas été modifiés chez les souris gpr81-/-. Ces résultats suggèrent un rôle important du récepteur GPR81 au niveau anatomique pendant le développement du système nerveux visuel. / During the development of the embryonic nervous system, high energy levels are required for the axonal growth of neurons and retinal ganglion cell axons (RGCs) to their brain targets. This energy demand leads to an increase in the concentrations of lactate, a ligand for the GPR81 / HCAR1 receptor. However, the role of lactate and its receptor in the development of the central nervous system (CNS) has been overlooked. This manuscript reports, the presence of the GPR81 receptor on neurons (RGCs) during embryonic development and into adulthood in mice. The activating effect of GPR81 by pharmacological manipulation helps to regulate the morphology of growth cones and increases axonal growth of RGCs on retinal explants in vitro. The use of gpr81-/- transgenic mice rendering the GPR81 receptor deficient enabled us to confirm these results. In addition, in vivo injection of CTb-Alexa Fluor 555 in the left eye and CTb-Alexa Fluor 647 in the right eye made it possible to visualize the projections of RGCs in the brains of gpr81+/+ and gpr81-/- mice. The gpr81-/- mice show a decrease in ipsilateral projections of RGCs in the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN). However, the visual acuity tested by the oculomotor reflex as well as the retinal sensitivity following light flashes of different intensities measured by electroretinograms (ERGs) were not modified in gpr81-/- mice compared to the wildtypes. These results suggest an important role of the GPR81 receptor at the anatomical level during the development of the visual nervous system.

Im Gegensatz zum peripheren Nervensystem (PNS) ist die Regenerationsfähigkeit im adulten zentralen Nervensystem (ZNS) von Vertebraten sehr eingeschränkt. Diese eingeschrängte Regenerationsfähigkeit wird im Wesentlichen durch das Vorhandensein von Myelin im adulten ZNS determiniert. Einerseits ist dieses Lipid für die Stabilisierung und Ernährung von Axonen sowie für die schnelle Reizweiterleitung unbedingt notwendig, andererseits stellt es den größten Inhibitor axonaler Regeneration dar. Myelin ist außerdem Zielstruktur diverser ZNS Pathologien, wie z.B. der Multiplen Sklerose. Für das Verständnis dieser Pathologien sowie der auswachsinhibitorischen Wirkung von Myelin wurde der Hippocampus als eine der plastischten ZNS Regionen gewählt. Dazu waren genaue Kenntnisse der Myeloarchitektur dieses Gebietes notwendig. Nach Etablierung einer zuverlässigen Detektierung für Myelin konnten in der vorliegenden Arbeit detailliert Myelinisierungsvorgänge im sich entwickelnden, im adulten und im deafferenzierten Hippocampus der Ratte analysiert werden. Während der Entwicklung erreichen die ersten entorhinale Axone den Hippocampus bereits am embryonal Tag 17 (E17); Myelin kann jedoch erst am postnatal Tag 17 (P17) lichtmikrokopisch nachgewiesen werden. Die Anzahl myelinisierter Fasern erreicht um den P25 ein Verteilungsmuster, welches dem von adulten Tieren gleicht. Nach Entorhinaler Cortex Läsion (ECL), bei der die Durchtrennung des Tractus perforans (PP) eine Denervation des Hippocampus bewirkt, kommt es zu einem langanhaltenden Verlust von Myelin. Zehn Tage nach Läsion (10 dal), also zum Zeitpunkt maximaler Aussprossung (Sprouting), kommt es zu einem Wiederkehren myelinisierter Fasern. Mehrere myelin-assoziierte Proteine, mit wachstumshemmenden Eigenschaften sind bekannt, wie z.B. die Familie der Nogo Gene (Nogo; englisch, kein Durchkommen). Diese werden ganz entschieden für den Verlust der Regenerationsfähigkeit des adulten ZNS verantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wird die Expression der drei Nogo Gene (Nogo-A, -B, - C) und deren Rezeptor (Ng66R) während der postnatalen Entwicklung, im adulten ZNS sowie nach Läsion beschrieben. Ein erster überraschender Befund war die neuronale Expression der Nogos, die bisher nur in Oligodendrocyten nachgewiesen worden war. Zu einem Zeitpunkt, an dem entorhinale Fasern bereits in den Hippocampus eingewachsen, aber noch nicht myelinisiert sind (P0), wird Nogo-A, -B und Ng66R mRNA mit Ausnahme der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus in allen Zellschichten des sich entwickelnden Hippocampus detektiert. Nogo-C und myelin basic protein (MBP) mRNA, werden erst am P15 expremiert, zu einem Zeitpunkt also, an dem myelinisierte Fasern erstmalig im Hippocampus auftreten. MBP wird ausschließlich in glialen, Nogo-C hingegen hauptsächlich in neuronalen Zellen exprimiert. Nach Deafferenzierung zeigt sich eine dynamische und Isoform- spezifische Regulation aller Nogo Transkripte. So zeigen die als erste von der Deafferenzierung betroffenen Körnerzellen zu Beginn der Waller`schen Degeneration sowie der neuronalen und glialen Antwort, eine starke Erhöhung aller Nogo Transkripte. Zum Zeitpunkt der maximalen Aussprossung kam es zu einem signifikanten Abfall der Nogo-C und Ng66R mRNA Expression, währendessen Nogo-A und Nogo-B bereits wieder das Kontrollniveau erreicht hatten. Vor allem im contralateralen Hippocampus, dem Hauptquellgebiet sproutender Fasern, imponierte die Runterregulation von Ng66R mRNA und zeigte erst nach Abschluß von axonalen Sproutingprozessen und der Synapsenformation wieder vergleichbare Werte mit den Kontrolltieren. Diese Korrelation der erniedrigten Ng66R Expression im contralateralen Hippocampus und dem axonalen Einwachsen in den deafferenzierten Hippocampus, läßt eine reduzierte axonale Ansprechbarkeit auf den Neuriten-Auswachshemmer Nogo-A vermuten, da bekannt ist, dass Axone, die kein Ng66R exprimieren, nicht durch die Nogo Gene im Wachstum gehemmt werden. Zusammenfassend kommt es während der Entwicklung und in der Reorganisationsphase zu einer spezifischen und geordneten Myelinisierung im Hippocampus. Die neuronale Expression von Nogo- A, -B und -C in einer so plastischen ZNS- Region unterstützt die Hypothese, dass den Nogo- Genen neben der reinen Hemmung von axonalen Auswachsen weitere Funktionen zuzuordnen sind. So scheinen sie vor allem während der Entwicklung und während der Stabilisierungsphase der hippocampalen Reorganisation eine wichtige Rolle einzunehmen. Die hier dargestellten Daten zeigen auf, dass vor einem therapeutischen Einsatz von Nogo- Antagonisten nach Schädigung deren Verträglichkeit bzw. unerwünschte Nebeneffekte ausgeschlossen werden müssen. / Compared to the peripheral neuronal system (PNS) the reorganisation capacity in the adult central neuronal system (CNS) is highly restricted. One important reason for the lack of reorganisation is the existence of myelin in the CNS. Myelin is crucial for the stabilization of axonal projections in the developing and adult mammalian brain. However, myelin components also act as a non-permissive and repellent substrate of outgrowing axons. In these thesis the appearance of mature, fully myelinated axons during hippocampal development and following entorhinal cortex lesion with the myelin-specific marker Black Gold is reported. Althrough entorhinal axons enter the hippocampal formation at the embryonic day 17, light and ultrastructural analysis revealed that mature myelinated fibres in the hippocampus occur in the second postnatal week. During postnatal development, increasing numbers of myelinated fibers appear and the distribution of myelinated fibers at postnatal day 25 was similar to that found in the adult. After entorhinal cortex lesion, a specific anterograde denervation in the hippocampus takes place, accompanied by a long- lasting loss of myelin. Quantitative analysis of myelin and myelin breakdown products at different time points after lesion revealed a temporally close correlation to the degeneration and reorganisation phases in the hippocampus. In conclusion, it could be shown that the appearance of mature axons in the hippocampus is temporally regulated during development. Reappearing mature axons were found in the hippocampus following axonal sprouting. Various myelin-associated proteins, with neurite inhibition properties are known. One is the family of Nogo genes (no go). They are distinctly responsible for the lack of reorganisation. In these thesis the expression pattern of Nogo-A, Nogo-B, Nogo-C and Nogo-66 receptor (Ng66R) mRNA during hippocampal development and lesion induced axonal sprouting is reported. The first surprising result was the neuronal expression of all Nogos, who were supposed to be only expressed by oligodendrocytes. Nogo-A, Nogo-B and Ng66R transcrips preceded the process of myelination and were highly expressed at postnatal day zero (P0) in all principal hippocampal cell layers, with the exception of dentate granule cells. Only a slight Nogo-C expression was found at P0 in the principal cell layers of the hippocampus. During adulthood, all Nogo splice variants and their receptor were expressed in the neuronal cell layers of the hippocampus, in contrast to the myelin basic protein mRNA expression pattern, which revealed a neuronal source of Nogo gene expression in addition to oligodendrocytes. After hippocampal denervation, the Nogo genes showed an isoform-specific temporal regulation. All Nogo genes were strongly regulated in the hippocampal cell layers, wheras the Ng66R transcrips showed a significant increase in the contralateral cortex. These data could be confirmed on protein levels. Futhermore, Nogo-A expression was up-regulated after kainat- induced seizure. These data show that neurons express Nogo genes with a clearly distinguishable pattern during development. This expression is further dynamically and isoform-specifically altered after lesioning during the early phase of structural rearrangements. Thus, these results indicate a role for Nogo-A, -B and –C during development and during stabilisation phase of hippocampal reorganization. Taken together with these data, the findings that neurons in a highly plastic brain region express Nogo genes supports the hypothesis that Nogo may function beyond its known neuronal growth inhibition activity in shaping neuronal circuits.

Résumé confidentiel / Confidential abstract