O método sorológico \"tissue blot enzyme immunoassay\" foi utilizado para determinar a taxa de colonização dos vasos do xilema por Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) em colmos de 28 variedades de cana-de-açúcar, incluindo a CB47-355, CB41-76 e CB49-260 como padrão resistente, intermediário e suscetível, respectivamente. Para cada variedade, 16 gemas foram tratadas termicamente a 50,5ºC por 2 horas e, em seguida, submetidas a banho fungicida a base de benomyl na dose de 6,5 g do princípio ativo por 10 litros de água. Oito gemas foram imersas por 10 minutos em caldo da CB49-260 sabidamente colonizada por Lxx diluído em água destilada na proporção 1:5 (\"INOCULADO\") e a outra metade em água (\"SADIO\"). Após a inoculação, foram plantados três vasos (repetições) para o tratamento, sendo as plantas mantidas em casa-de-vegetação até a colheita durante 7 meses, quando então 2 colmos de cada vaso foram amostrados para determinar a taxa de colonização dos vasos. A variedade CB47-355 não apresentou nenhum vaso colonizado, enquanto na CB41-76 e CB49-260 a taxa de colonização foi igual a 17% e 76%, sendo classificadas como resistente, intermediária e suscetível, respectivamente, concordando com literatura prévia. Das variedades em teste, 12 comportaram-se como intermediárias e 13 como suscetíveis. No primeiro caso, a %VC variou de 7 a 25 e, nas suscetíveis, de 25,7 a 76. Portanto, o aumento da taxa de colonização é praticamente linear da mais resistente para a mais suscetível, o que é característico de caráter quantitativo. Considerando que nenhuma variedade comercial mostrou-se resistente e que Lxx causa perdas significativas em todos os países produtores de cana-de-açúcar, sugere-se que os programas de melhoramento devem dirigir programas para a seleção de genitores e progênies para obter variedades resistentes. Enquanto isso não ocorre, atenção dever ser dada para o uso de mudas indexadas. / The tissue blot immunoassay (TBIA) for detecting Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) colonized vascular bundles (CVB) were used in determining the reaction of 28 brazilian sugarcane cultivars to ratoon stunting disease (RSD), including CB47-355, CB41-76 e CB49-260 as resistant, intermediate and susceptible standards. For each cultivar, 16 buds were hot water treated at 50,5 oC for 2 hours and protected against root rots with benomyl. Eight buds of each cultivar were than inoculated with infected sap of the CB49-260 diluted 1:5 in water, and the remaining 8 buds were inoculated with distilled water for planting the control plots. The reps of each cultivar were planted in plastic plots at green house. At harvesting, seven months after planting, two stalks were sampled from each plot. The rate of colonization of vascular bandles by Lxx in stalks of each cultivar was determined. Statistical analysis by the univariate clustering method (Scott-Knott) was reliable for grouping genotypes according to their levels of Lxx resistance by the percentage of CVB. The cultivar CB47-355 did not present any CVB, while CB41-76 and CB49-260 presented 17% and 76%, being classified as resistant, intermediate and susceptible, in agreement with previous literature. Among the varieties in test, 12 were intermediates and 13 susceptibles. The percent of CVB among the intermediate and susceptible cultivars varied from 7% to 25% and 25,7 to 76%, respectively. The knowledge of resistance of each cultivar is essential for advising the use of complementary phytossanitary measures to control the disease. Since all cultivars are intermediate or susceptible, the sugarcane breeding programs need specific works for selection and releasing of resistant cultivars. Before this, schemes of nurseries and the use clean seed cane are recommended.

Microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes, podendo ou não apresentar estruturas externas visíveis. Esta interação endófito-planta é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Embora bactérias do gênero Curtobacterium sejam normalmente estudadas como fitopatógenas, este grupo vem sendo isolado como endófito de diferentes espécies vegetais, tais como citros, trevo, arroz, batata, milho, olmeiro, café e álamo. Tais bactérias vem sendo estudada no controle de doenças em pepino, batata e fumo, na promoção de crescimento, interagindo com bactérias promotoras de crescimento (PGPR) e fitopatógenas. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi estudar a variabilidade genética e fisiológica de Curtobacterium sp. isolados endofiticamente de citros, por meio das técnicas moleculares ARDRA, RAPD, AFLP e sequenciamento do gene 16S rRNA, além de características fisiológicas (coloração da colônia, fitopatogenicidade e perfil enzimático). Além dos isolados endofíticos de citros, foram utilizados isolados endofíticos e fitopatogênicos de diversas culturas proveniente de diferentes regiões do Brasil e outros países. Embora a coloração das colônias seja uma característica altamente variável, foi observada correlação, onde os isolados endofíticos de citros apresentaram coloração variando de alaranjado a róseo, enquanto os outros isolados analisados apresentaram coloração amarelada e creme. A análise por ARDRA possibilitou a formação de 4 ribotipos (A, B, C e D), sendo que todos os fitopatógenos foram agrupados no ribotipo D. As análises de variabilidade por meio do RAPD e AFLP permitiram a separação dos isolados bacterianos em 2 grupos principais, endófitos e fitopatógenos, além de mostrar grande variabilidade dentro do grupo de isolados endofíticos de citros. De acordo com os resultados do sequenciamento do gene 16S rRNA, os isolados endofíticos de citros foram agrupados separadamente das demais espécies analisadas. Os resultados do presente estudo demonstram que os isolados endofíticos de citros apresentam genótipo divergente, sugerindo que estes isolados possam pertencer a uma nova espécie ou subespécie de Curtobacterium. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages, presenting or not visible external structures. This interaction microorganisms-plant is specific to certain species of plants and/or bacteria. Although bacteria from genus Curtobacterium genus are normally studied as phytopathogens, this group has been isolated as endophytes from several plants, such as citrus, potato, rice, maize, coffee, elm trees, red clover and poplar. Also, this bacterium has been associated to disease biocontrol in tobacco, cucumber and potato; influencing host growth or interacting with plant growth-promoting rhizobacteria and other phytopathogenic bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the genetic and physiological variability of citrus endophytic strains of Curtobacterium by physiological traits (colony color, pathogenicity and enzymatic profile), as well as molecular techniques, such as ARDRA, RAPD, AFLP and 16S rRNA gene sequencing. In the present study endophytic and phytopathogenic strains from many different plants and regions around the world were used. Although the colony color is a high variable character, correlation was observed, since phytopathogenic strains presented yellow and ivory colors, while endophytes from citrus presented orange and pink colors. Four ARDRA profile (A, B, C, D) were observed in the evaluated population, being all phytopathogenic strains include in the ribotype D. The RAPD and AFLP analysis allocated the endophytes and phytopathogens in two different major groups, besides a high variability inside citrus endophytes cluster. According to 16S rRNA gene sequence analysis, citrus endophytic were clustered in a different group of others Curtobacterium strains. The results of the present study demonstrated that the citrus endophytic strains is a divergent genotype, suggesting that citrus endophytic strains could belong to a new Curtobacterium species or subspecies.

Considerada uma das mais severas doenças em citros, o Huanglongbing (HLB) foi descoberto no Brasil em 2004, e desde então tem causado sérios danos à citricultura do país. Anteriormente conhecida apenas na Ásia e África, atualmente está também presente em vários países do continente Americano. O HLB, no Brasil, é causado pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) e Ca. L. americanus (LAM), sendo a última encontrada apenas neste país. São bactérias gram-negativas, limitadas ao floema, pertencentes ao subgrupo alpha das -proteobacterias. A transmissão desta doença pode ocorrer por enxertia de materiais vegetais infectados, pela planta parasita Cuscuta spp. ou pelo psilídeo-asiático-dos-citros, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Para que o patógeno seja transmitido, há uma interação única que ocorre entre a bactéria e seu inseto vetor, cujo conhecimento auxiliaria no controle e prevenção da doença. Entretanto, vários aspectos da biologia da transmissão de Ca. Liberibacter spp. ainda são desconhecidos. Este trabalho teve por objetivo elucidar alguns aspectos relacionados à aquisição e interação de LAS e LAM com o inseto vetor, D. citri. Um primeiro estudo foi montado para avaliação de qual(s) estágio(s) apresentaria(m) maior eficiência de aquisição. Em seguida, avaliou-se o crescimento e concentração de ambas as bactérias no organismo do inseto em períodos sucessivos após a aquisição. Por fim, investigou-se a possibilidade de aquisição de ambas as bactérias concomitantemente pelo vetor, em períodos de acesso à aquisição iguais e seqüenciais em plantas-fonte de cada umas delas. Observou-se uma maior taxa de aquisição do patógenos por ninfas de 4° e 5° instares, contrastando com uma menor eficiência de aquisição por adultos. Por meio de análises de regressão, verificou-se um crescimento da população bacteriana com o passar do tempo, em insetos que se alimentaram em plantas infectivas ainda nas formas jovens (ninfas), sendo que o mesmo não foi observado para adultos. As bactérias foram detectadas no inseto por sonda específicas de PCR quantitativo apenas 7 dias após o início do período de acesso à aquisição (PAA) e foram detectadas até 40 dias após o PAA. O fato de as bactérias serem detectadas até 6 semanas após sua aquisição e em concentrações crescentes no vetor, caracterizam o tipo de transmissão como persistente propagativa. Este conhecimento é importante para melhor compreensão da epidemiologia e aprimorar o manejo do HLB. / Known as one of the most severe citrus diseases, Huanglongbing (HLB) was first described in Brazil in 2004. Ever since, it has caused serious damages to Brazilian citriculture. Previously known only in Asia and Africa, HLB is now present in several countries in the Americas. In Brazil, HLB is associated with two bacterial species, Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) and Ca. L. americanus (LAM); the latter one was found only in this country. These are gram-negative, phloem-limited bacteria, belonging to the alpha subdivision of the Proteobacteria group. Transmission of these bacteria may occur by grafting with infected plant material, by parasitic plants (Cuscuta spp.), or by the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). The vector transmission process probably involves complex psyllid-pathogen interactions, which should be understood in order to improve management strategies to control HLB. The goal of this research was to study some aspects related to acquisition of LAS and LAM by the insect vector, D. citri. A first study was carried out to determine bacterial acquisition efficiency in relation to vector developmental stages. A second study was set up to investigate if bacterial concentration increases over time in the vector after acquisition by D. citri nymphs and adults. Finally, the possibility of acquisition of both LAS and LAM by a single insect was investigated by submitting D. citri nymphs and adults to sequential and similar acquisition access periods on citrus plants singly-infected with each one of these bacterial species. D. citri nymphs acquired Ca. L. asiaticus and Ca. L. americanus more efficiently than adults. No single insect acquired both bacterial species. Concentration of Ca. L. asiaticus reached higher levels in D. citri when acquired by 4th and 5th instar nymphs. Regression analyses showed an increase in the concentration of Ca. L. asiaticus in D. citri over time after acquisition for insects that acquired the pathogen yet as nymphs, which was not observed when bacterial acquisition occurred only in the adult stage. Both bacterial species were detected in D. citri by quantitative PCR from 7 to 40 days after onset of the acquisition access period. The observation of increasing concentrations of Ca. L. asiaticus in D. citri for several weeks after acquisition indicates that the bacterium is persistent and propagative in the vector. This information allows a better understanding of the transmission process with implications on HLB epidemiology and management.

Huanglongbing é a mais destrutiva doença da citricultura mundial. Seu recente relato no Brasil, em 2004, e a detecção de duas espécies bacterianas associadas à doença -Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus resultaram em poucos estudos do comportamento do Huanglongbing nas condições dos pomares brasileiros. Os objetivos deste trabalho foram (i) comparar a eficiência de infecção por Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus em plantas cítricas inoculadas por meio de enxertia com as duas espécies bacterianas, separadamente, e mantidas sob diferentes temperaturas, e (ii) comparar o progresso temporal e espacial do Huanglongbing causado por ambas as espécies, a partir da infecção natural por Diaphorina citri, tendo plantas de citros ou Murraya paniculata (murta) como fonte primária de inóculo. Para alcançar o primeiro objetivo, dois experimentos foram conduzidos em câmaras de crescimento com temperatura e fotofase controladas. A incidência da doença foi determinada por Real-Time PCR de amostras foliares. As temperaturas mais amenas foram favoráveis à infecção por Candidatus Liberibacter americanus, enquanto que altas temperaturas não afetaram a infecção de Candidatus Liberibacter asiaticus. A eficiência de infecção para esta última espécie foi favorecida nas temperaturas de 17/22°C e 22/27°C (noturna/diurna, respectivamente). Para cumprir com o segundo objetivo, um experimento foi conduzido com diferentes fontes de inóculo, que corresponderam aos seguintes tratamentos: (i) plantas de laranjeira doce da variedade Natal infectadas por Candidatus Liberibacter asiaticus ou Candidatus Liberibacter americanus, (ii) unicamente plantas de Murraya paniculata infectadas por Candidatus Liberibacter americanus e (iii) unicamente plantas de laranjeira doce da variedade Natal infectadas por Candidatus Liberibacter americanus. Cada tratamento foi aplicado em um compartimento isolado de uma casade- vegetação. O primeiro tratamento foi repetido. Em todos os compartimentos, 156 a 158 plantas de laranjeira doce da variedade Valência foram dispostas ao redor das plantas fonte de inóculo. Psilídeos livres das bactérias foram periodicamente confinados em plantas fonte de inóculo e, posteriormente foram liberados na casa-de-vegetação para livre movimentação e multiplicação. Quando as duas espécies bacterianas estavam presentes nas diferentes plantas cítricas utilizadas como fonte de inóculo, houve maior detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus e maior eficiência de aquisição desta espécie bacteriana por psilídeos. Quando somente Candidatus Liberibacter americanus estava presente nas plantas fonte de inóculo, a eficiência de transmissão foi maior quando Murraya paniculata foi utilizada como fonte de inóculo, mostrando que Diaphorina citri pode adquirir naturalmente Candidatus Liberibacter 12 americanus de Murraya paniculata e transmiti-la para plantas cítricas. A eficiência de aquisição da espécie Candidatus Liberibacter americanus também foi maior tendo Murraya paniculata como planta fonte de inóculo e não citros. / Huanglongbing is the most destructive disease of citrus worldwide. There are few studies on the behavior of Huanglongbing in the Brazilian orchards conditions due to the recent report in Brazil, in 2004. Two bacterial species were associated with the disease in Brazil: Candidatus Liberibacter asiaticus and Candidatus Liberibacter americanus. The aims of this work were (i) to compare the efficiency of infection by Candidatus Liberibacter asiaticus and Candidatus Liberibacter americanus in citrus graft-inoculated plants with both bacterial species, separately, and kept under different temperatures, and (ii) to compare the spatio-temporal progress of Huanglongbing caused by both species, naturally transmitted by Diaphorina citri, having infected citrus plants or Murraya paniculata (jasmine orange) as primary inoculum sources. To achieve the first objective, two experiments were carried out in plant growth chambers with controlled temperature and light. Disease incidence in the inoculated plants was determined by Real-Time PCR of the leaf samples. The milder temperatures were favorable to Candidatus Liberibacter americanus infection, while the higher temperatures did not affect the infection by Candidatus Liberibacter asiaticus. The infection by this latter species was favored by temperatures of 17/22ºC and 22/27°C (night/day, respectively). To achieve the second objective, an experiment was carried out with different sources of inoculum, corresponding to the following treatments: (i) Natal sweet orange plants infected by Candidatus Liberibacter asiaticus or Candidatus Liberibacter americanus, (ii) only Murraya paniculata plants infected by Candidatus Liberibacter americanus and (iii) only Natal sweet orange plants infected by Candidatus Liberibacter americanus. Each treatment was applied in an isolated compartment of a screenhouse. The first treatment was repeated. In all of the compartments, from 156 to 158 Valencia sweet orange plants were located around the source of inoculum plants. Psyllids free of the bacteria were periodically confined in source of inoculum plants and, after this period, they were set free, and allowed to the free movement and multiplication inside the screenhouse. When both bacterial species were present in the different citrus plants as source of inoculum, there was higher detection of Candidatus Liberibacter asiaticus than Candidatus Liberibacter americanus and higher acquisition efficiency of the former bacterial species than the later by psyllids. When only Candidatus Liberibacter americanus was present in the source of inoculum plants, the higher transmission efficiency was reached when Murraya paniculata served as source of inoculum, showing that Diaphorina citri can naturally acquire Candidatus Liberibacter americanus from Murraya paniculata and transmit it to citrus plants. The acquisition efficiency of the 14 Candidatus Liberibacter americanus species was higher with Murraya paniculata as source of inoculum than with citrus plants was the source of inoculum.

O patógeno Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae causa a mancha oleosa ou bacteriose do maracujazeiro, uma doença que acarreta prejuízos à cultura em decorrência da baixa produção de frutos, podendo causar a morte das plantas. Uma coleção de 87 isolados deste patovar, oriundos de 22 cidades dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Paraná e do Distrito Federal, foi usada para estudar a diversidade genética por rep-PCR e AFLP. Nove isolados de outros patovares foram incluídos nas análises genéticas. A técnica rep-PCR revelou pouca diversidade entre os isolados do patovar passiflorae, mas diferenciou, claramente, os diferentes patovares. Todavia, a técnica AFLP revelou considerável diversidade genética entre os isolados do patovar passiflorae. A análise molecular da variância mostrou que a maior parte da diversidade (49,4%) se encontra entre as cidades de coleta. O agrupamento gerado com base nos coeficientes de similaridade e os resultados do teste de atribuição pelo programa Structure revelaram clusters genotípicos homogêneos. Isto evidencia que a variação está mais associada à geografia, ou seja, às cidades de coleta, e que o fluxo desses isolados é pequeno. Cinco conjuntos de primers foram desenhados para a detecção do patógeno em plantas. Desses, um conjunto de primers foi desenhado a partir da seqüência intergênica 16S-23S rRNA e se mostrou específico para o patovar passiflorae. Nenhum amplicon foi detectado nos patovares controles. O restante dos primers foi desenhado a partir do seqüenciamento de locos de AFLP, monomórficos para o patovar passiflorae e ausentes nos demais patovares. Estes primers não foram totalmente específicos; no entanto, todos podem ser recomendados para o diagnóstico da mancha oleosa, uma vez que não há registros de outras Xanthomonas em pomares de maracujá. / The pathogen Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae is responsible for the bacterial leaf spot of passion fruits, a disease that provokes commercial losses due to low levels of fruit production and even plant death. A group of 87 isolates of this pathovar, collected from 22 localities of São Paulo, Minas Gerais and Paraná States as in the Federal District was used to evaluate the genetic diversity based on rep-PCR and AFLP. Isolates from other nine pathovars were included in the genetic analyses. Low level of genetic diversity was revealed by the rep- PCR technique, which clearly distinguished the different pathovars. However, considerable diversity between isolates of the pathovar passiflorae was revealed by the AFLP technique. The analysis of molecular variance showed that differences between localities contributed to most part of the variance (49.4%). Groups generated based on similarity coefficients as well as results produced by the software Structure assigning isolates to groups, revealed homogeneous genotypic clusters. This confirms that variance is associated with geographic origin e.g. sampling localities, and that flow of isolates is restricted among localities. Five primer sets were designed for pathogen detection in plants; a primer set was designed for PCR amplification of the intergenic sequence 16-23S rRNA, which was shown to be specific to the pathovar passiflorae. No amplicons were detected in the controls. The remaining primers were designed after sequencing AFLP bands that were monomorphic within the pathovar passiflorae but absent in the other pathovars. These primers were not absolutely specific but all could be recommended for diagnosis of leaf spot as there is no report on the occurrence of other Xanthomonas species in passion fruit orchards.

A Clorose Variegada dos Citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, é atualmente a doença de maior incidência no Estado de São Paulo. A incidência e a severidade da doença são maiores nas regiões Norte e Noroeste do Estado, onde o clima é predominantemente quente e com déficit hídrico, principalmente no inverno. Embora não haja nada comprovado, alguns estudos indicam que o déficit hídrico aumenta a severidade dos sintomas nas plantas afetadas pela CVC. Além disso, até hoje não foi estabelecida uma função que relacione doença e dano. Dessa forma, o estudo presente objetivou avaliar o efeito de diferentes níveis de irrigação no progresso poliético da CVC, avaliar métodos de avaliação da doença e determinar uma função de dano para a CVC. Para isso, um experimento foi instalado no município de Bebedouro, região Norte do Estado de São Paulo sob o delineamento blocos ao acaso no esquema fatorial 3 x 2, com os seguintes tratamentos: sem irrigação, irrigado com 50% e 100% da evapotranspiração da cultura (ETc), combinados com inoculação natural e artificial de X. fastidiosa. Cada parcela foi constituída de 6 plantas úteis, havendo 4 repetições de cada tratamento, totalizando 144 plantas úteis. As variáveis quantificadas em cada árvore do experimento foram: (a) produção, considerando frutos assintomáticos e sintomáticos, no período de 2006 a 2008 e produção total referente às safras 2001 a 2005; (b) intensidade da doença, através da incidência de ramos com sintomas da CVC e utilizando uma escala descritiva; (c) vigor da planta, estimado pela medida da altura da planta, diâmetro da copa, diâmetro do tronco, volume de copa e do índice de área foliar (IAF). O modelo monomolecular foi utilizado para descrever o progresso poliético da incidência da CVC, no período de 2006 a 2008, para todos os tratamentos. A partir desse modelo foi possível observar que plantas sem irrigação apresentam maior incidência de ramos com sintomas que plantas irrigadas a 100% da ETc, principalmente quando inoculadas de forma artificial. Esse resultado ficou ainda mais evidenciado quando se avalia o número de frutos com sintomas (ø < 50mm) da CVC por tratamento. Também foi possível observar que os sintomas nas plantas são distribuídos de forma irregular, apresentando um gradiente decrescente significativo da parte superior para inferior. As variáveis relacionadas ao vigor da planta, na sua maioria, não apresentaram relação alguma com a produção em todos os tratamentos. De modo geral, as plantas do tratamento irrigado a 100% da ETc combinado com inoculação natural apresentaram maior produção total, considerando as safras de 2001 a 2008. A relação entre CVC e dano pode ser descrita pela equação (y=114,067*exp(-0,017555)*x) onde y é a produção da planta em Kg e x a incidência de ramos com CVC em porcentagem. A escala descritiva não permitiu avaliação precisa e apresentou baixa correlação entre os avaliadores, o contrário foi observado realizando a avaliação da CVC através da incidência de ramos com sintomas. / The Citrus Variegated Chlorosis (CVC) caused by the bacteria Xylella fastidiosa is nowadays the disease with the most incidence in the state of São Paulo. The incidence and severity of the disease are greater in the Northern and Northwestern regions of the state where the climate is predominately warm and presents a water deficits especially in the winter. Although there is no definite proof, some studies indicate that the water deficits increases the severity of the symptoms in plants affected by the CVC. Besides, up to the present there has not been a function which relates the damage to an intensity of the disease. In that manner, the present study has been conducted in order to evaluate the effect of different irrigation levels on the polyetic progress of the CVC as well as to study methods of assessment of the disease and determine the relationship between disease intensity and yield. In order to carry out this study, an experiment was conducted in the city of Bebedouro north of São Paulo state. The experimental design was in randomized blocks in a 3 x 2 factorial scheme with the following treatments: no irrigation, irrigated with 50% and 100% of the evapotranspiration of the crop (ETc), combined with natural and artificial inoculation of X. fastidiosa. Each group was made of 6 useful plants, with 4 repetitions for each treatment, totalizing 144 useful plants. The variables quantified in each tree of the experiment were: (a) (a) yield, considering asymptomatic and symptomatic fruit in the period 2006 to 2008 and total yield on the crops from 2001 to 2005; (b) intensity of the disease through incidence of branches with symptoms of CVC and using a descriptive scale; (c) plant vigor, estimated through measure of height, crown diameter, trunk diameter, canopy volume and of the leaf area index (LAI). The monomolecular model was used to describe the polyetic progress of CVC incidence between 2006 and 2008 for all treatments. From this model it was possible to observe that plants without irrigation present greater incidence of branches with symptoms than the ones irrigated at 100% of ETc, especially when inoculated in an artificial manner. This result was even more evident when the number of fruit with symptoms is evaluated (ø < 50mm) of CVC per treatment. It was also possible to observe that the symptoms in the plants are scattered in an irregular way, presenting a significant decreasing rate from the upper to the lower part. Most of the variables related to the plant vigor did not present any relation to the production in all treatments. In general, the plants from the irrigated treatment at 100%of ETc combined with natural inoculation presented more total yield considering the harvests from 2001 to 2008. The relationship between CVC and damage can be described by the equation (y=114,067*exp(-0,017555)*x) where y is the plant yield in Kg and x is the incidence in percentage of branches with CVC. The descriptive scale did not allow accurate assessment and showed a low correlation between the raters, the opposite was observed performing the assessment of CVC through the incidence of branches with symptoms.

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças mais ameaçadoras para citricultura mundial e, até o momento, não foi encontrada resistência na base genética do gênero Citrus. A doença é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp., endêmica de floema. Portanto, na busca por uma planta transgênica resistente ao HLB é desejável avaliar construções gênicas em que o gene de interesse se expresse preferencialmente na região em que a bactéria coloniza a planta, ou seja, no floema. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens, de citrange Carrizo [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cultivares Hamlin, Valência e Pêra, contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), para verificar se esses promotores regulam a expressão do gene repórter na região do floema. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro e como agente de seleção de regeneração de plantas transgênicas foi utilizado o gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina. Dos brotos regenerados foi coletada uma amostra de material para a realização do ensaio histoquímico com X-GLUC. Os brotos que formaram coloração azulada confirmaram a integração do transgene, sendo esses enxertados em porta enxertos previamente germinados e estiolados in vitro. A partir do número de explantes introduzidos, número explantes responsivos, número de brotos regenerados e número de brotos regenerados GUS positivos calculou-se a eficiência de transformação genética dos experimentos. Para a confirmação da transformação genética de laranja Hamlin foram realizadas análises de PCR e Southern blot de três plantas GUS positivas aclimatizadas. Também foram feitos cortes histológicos manuais para melhor visualização da reação histoquímica de GUS das plantas de laranja Hamlin Southern blot positivas. Todos os experimentos de transformação regeneraram pelo menos um broto GUS positivo. As plantas de laranja Hamlin analisadas por PCR e Southern blot analisadas foram confirmadas como transformadas com uma inserção do transgene. Plantas nas quais foram realizados cortes histológicos indicaram expressão diferencial das construções gênicas no floema. / Huanglongbing (HLB) is one of the most threatening diseases to worldwide citriculture and till the present moment, no resistance has been found in citrus genetic basis. This disease has Candidatus Liberibacter spp. as the pathogenic agent, an endemic phloem bacterium. Therefore, in the search for a transgenic plant resistant to HLB, it is desirable to evaluate constructions in which the gene of interest is expressed, preferentially, in tissues where the bacteria grow, i.e., in the phloem. Therefore, this work aimed to obtain transgenic plants of Carrizo citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck], and of Hamlin, Valencia, and Pera sweet oranges [Citrus sinensis (L.) Osbeck], via Agrobacterium tumefaciens, containing uidA (GUS) gene, controlled by the promoters Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), in order to check if these promoters drive the reporter gene expression in the phloem. For the transformation, in vitro germinated seedlings epicotil segments were used. The gene nptII, which confers resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selective system. From the regenerated shoots, a tissue sample was collected to perform the X-GLUC histochemical analysis. The regenerated shoots colored in blue were considered transgenic, and these were grafted on in vitro grown rootstocks. The transformation efficiency of each experiment was calculated based on the number of introduced explants, responsive explants, number of regenerated shoots, and number of GUS positive regenerated shoots. In order to confirm the genetic transformation of Hamlin sweet orange, PCR and Southern blot analyses of three positive GUS acclimatized plants were performed. Anatomic slices for better visualization of blue color formed by GUS reaction were also made. All transformation experiments regenerated at least one GUS positive shoot. Plants of Hamlin sweet orange analyzed by PCR and Southern blot are transformed and have one transgene insertion. Anatomical analyses indicated preferential expression of the transgenes in the phloem.

A Escaldadura das Folhas da Ameixeira (EFA) é a principal doença da cultura no Brasil, sendo causada pela bactéria Xylella fastidiosa e transmitida entre plantas pela ação de insetos vetores, mas há carência de informações sobre a identidade dos vetores e plantas hospedeiras para estirpes de X. fastidiosa causando EFA. Objetivando subsidiar uma proposta de manejo da EFA, foram realizados estudos sobre a transmissão de X. fastidiosa por vetores em ameixeira, identificação de plantas hospedeiras da bactéria em vegetação de cobertura dos pomares que possam servir como fontes de inóculo, capacidade de colonização de estirpes de ameixeira, cafeeiro e citros em inoculações cruzadas e validação da técnica de inoculação mecânica como método de avaliação de resistência de cultivars a X. fastidiosa em programas de melhoramento de ameixeira. Inicialmente, por meio de testes de colonização por X. fastidiosa foram identificadas Ocimum basilicum, Vernonia condensata e Pentas lanceolata como plantas não hospedeiras da bactéria, permitindo a criação de cigarrinhas sadias que foram utilizadas nos ensaios de transmissão. As cigarrinhas Macugonalia cavifrons, M. leucomelas e Sibovia sagata (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae) foram identificadas como vetoras de X. fastidiosa em ameixeira com eficiência de transmissão por indivíduo variando de 12 a 21%. Para identificação de hospedeiros alternativos do patógeno, avaliaram-se 12 espécies herbáceas (folhas e raízes) predominantes na vegetação de cobertura de pomares de ameixeira com elevada incidência de EFA, sendo dois no município de Videira, SC e três no município de Jarinú, SP. Amostras de nove delas (Bidens pilosa, Lepidium ruderale, Lolium multiflorum, Plantago major, Parthenium hysterosphorus, Raphanus sativus, Rumex sp., Solanum americanum e Vernonia sp. foram positivas para X. fastidiosa em folhas e/ou raízes, pelo teste de reação de polimerase em cadeia (PCR), Testes de inoculação mecânica com um isolado de X. fastidiosa de ameixeira comprovaram a capacidade dessa estirpe bacteriana em colonizar plantas de B. pilosa, L. ruderale, R. sativus e S. americanum. Estudos de inoculação cruzada demonstraram que isolados de X. fastidiosa de citros são capazes de colonizar cafeeiro, embora em menor proporção que isolados de cafeeiro. Um isolado de ameixeira foi capaz de colonizar citros e cafeeiro, sendo que em citros a proporção de plantas infectadas foi maior. Isolados de X. fastidiosa de citros e cafeeiro não colonizam plantas de ameixeira, sendo estas colonizadas apenas pelos isolados homólogos. Estudos de inoculação mecânica de dois isolados de X. fastidiosa de ameixeira em diferentes cultivares dessa planta hospedeira, expressaram resultados corroborativos com a pré-caracterização da resistência das cultivares, validando a técnica para uso em programas de melhoramento, com melhor precisão nos resultados e ganho de tempo na avaliação de resistência à EFA. / The Plum Leaf Scald (PLS) is the main disease of plum crop in Brazil being caused by the bacterium X. fastidiosa, which is transmitted among plants by insect vectors. However, additional information is needed about the identity of vectors and host plants of X. fastidiosa isolates that cause PLS. In order to subsidize PLS management proposal, studies on X. fastidiosa vector transmission in plum, identification of host plants from orchard vegetation cover that can be source of inoculum, bacterial colonization of strains isolated from plum, coffee and citrus in cross inoculations, and validation of mechanical inoculation technique as method for assessing resistance of plum varieties against X. fastidiosa in breeding programs, were carried out. Firstly, studies of colonization by X. fastidiosa revealed that three plants are non-hosts: Ocimum basilicum, Vernonia condensata and Pentas lanceolata, allowing the maintenance of healthy leafhoppers colonies. The sharpshooters Macugonalia cavifrons, M. leucomelas and Sibovia sagata were confirmed as vectors of X. fastidiosa in plum with transmission efficiency per individual ranging from 12 to 21%. In order to identify alternative hosts of the bacterium in plum orchards, 12 plant species (leaves and roots), which are predominant in the vegetation from orchards where PLS incidence is high, two of them being located at Videira - SC and three at Jarinu - SP, were chosen to be tested. Samples of leaves and/or roots from nine plant species (Bidens pilosa, Lepidium ruderale, Lolium multiflorum, Plantago major, Parthenium hysterosphorus, Raphanus sativus, Rumex sp., Solanum americanum and Vernonia sp.) were positive for X. fastidiosa by Polymerase Chain Reaction (PCR). Mechanical inoculation tests using a plum isolate of X. fastidiosa showed the capacity of this strain in colonizing the plants B. pilosa, L. ruderale, R. sativus and S. americanum. Studies on cross inoculation demonstrated that citrus X. fastidiosa isolates are able to colonize coffee plants, although in lower intensity than strains isolated from coffee. A plum isolate was able to colonize citrus and coffee plants, but the proportion of infected plants was higher in citrus. On the other hand, isolates of X. fastidiosa from citrus and coffee do not colonize plum plants and these were only colonized by homologous isolates. Studies on mechanical inoculation of two plum strains of X. fastidiosa in different plant cultivars revealed a pre-characterization on the resistance of these cultivars, validating the technique for use in breeding programs with a better precision in results as well as saving time on the assessment of resistance against PLS.

O raquitismo das soqueiras da cana-de-açúcar (RSD) é causado pela bactéria Leifsonia xyli subp. xyli (Lxx), sendo uma das principais doenças dessa cultura. O seqüenciamento do genoma da Lxx trouxe novas perspectivas para um melhor entendimento de sua biologia, permitindo a elaboração de suposições sobre seus mecanismos de patogenicidade e adaptação. Estudos preliminares realizados em nosso laboratório mostraram que a adição de fluido vascular de cana-de-açúcar no meio de cultura promove um crescimento mais rápido da bactéria in vitro. Esses resultados levantaram a hipótese de que alguma substância sinalizadora presente no fluido vascular poderia ativar ou reprimir genes da bactéria relacionados ao reconhecimento do hospedeiro. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar in vitro o perfil de expressão gênica de possíveis genes relacionados à patogenicidade e adaptação de Lxx quando cultivada em presença de fluido vascular de cana-de-açúcar em períodos de cinco e vinte minutos. Desta forma, duas variedades de cana-de-açúcar, uma suscetível e outra resistente a Lxx, foram analisadas. O nível transcricional dos genes de interesse foi avaliado por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) pelo sistema SYBR® Green. Os genes hipotéticos de patogenicidade estudados codificam para uma celulase (celA) e uma protease (pat-1), que são homólogos a genes de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Os genes supostamente envolvidos na adaptação ao hospedeiro foram os envolvidos na produção de peroxidase (per) e arginase (arg), relacionados com a resistência ao estresse oxidativo e supressão dos mecanismos de defesa do hospedeiro, respectivamente. No tratamento com fluido vascular da variedade suscetível apenas os genes celA e arg tiveram expressão induzida após cinco minutos de exposição ao fluido. Em presença de fluido vascular da variedade resistente, os genes celA e pat-1 foram positivamente regulados somente no período de cinco minutos, enquanto que o gene arg manteve regulação positiva nos dois períodos observados. O gene per foi reprimido em todos os tratamentos, exceto em fluido vascular da variedade resistente por vinte minutos. No período de vinte minutos, com exceção do gene celA todos os outros genes tiveram a expressão negativa em presença de fluido vascular da variedade suscetível. Estes resultados indicam que substâncias presentes no fluido de cana-de-açúcar atuam como sinais reguladores da expressão gênica em Lxx e esta regulação talvez seja necessária para adaptação e consequentemente colonização no hospedeiro. / Sugarcane ratoon stunting disease (RSD) is a major disease in that crop and is caused by the bacteria Leifsonia xyli subp. xyli (Lxx). Its genome sequencing brought new perspectives for a better understanding of its biology, allowing the elaboration of suppositions concerning its pathogenicity and adaptation mechanisms. Preliminary, studies showed that the addition of 20% vol / vol of sugarcane vascular fluid in the cultivation medium promotes a faster growth of the bacteria in vitro. These results raise the hypothesis that some signalizing molecule/substance in the vascular fluid does activate or repress the bacteria genes related to the host´s recognition.Therefore, the objective of this study was to analyze in vitro the profile of gene expression of possible related genes to pathogenicity and adaptation of Lxx when cultivated in the presence of sugarcane vascular fluid in periods of five and 20 minutes. Two sugarcane varieties where analyzed, one susceptible and one resistant to Lxx. The transcription of the genes of interest was evaluated by quantitative real time PCR (RT-qPCR) by the SYBR® Green system. The hypothetic pathogenicity genes studied encode a cellulase (celA) and a protease (pat-)1, that are homologous to the Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis genes. The genes supposedly involved in the adaptation to the host where the ones involved in the production of peroxidase (per) and arginase (arg), related to the resistance of the oxidative stress and suppression of the host\'s defense mechanisms, respectivelyWith the Lxx susceptible variety\'s vascular fluid, only celA and arg genes had their expression induced after a five minutes exposure to the fluid. In presence of the resistant variety\'s vascular fluid, celA and pat-1 genes where positively regulated only in the exposure period of five minutes, while the arg gene maintained a positive regulation in both observed periods. The per gene was repressed in all treatments, except in the presence of the resistant variety\'s vascular for 20 minutes. In the 20 minutes period, with the exception of the celA gene, the other genes had negative expression in the presence of vascular fluid of the susceptible variety. These results indicate that substances present in the sugarcane fluid act as regulating signals for the Lxx gene expression and this regulation may be necessary for the adaptation and consequently colonization on the host.

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças mais ameaçadoras para citricultura mundial e, até o momento, não foi encontrada resistência na base genética do gênero Citrus. A doença é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp., endêmica de floema. Portanto, na busca por uma planta transgênica resistente ao HLB é desejável avaliar construções gênicas em que o gene de interesse se expresse preferencialmente na região em que a bactéria coloniza a planta, ou seja, no floema. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens, de citrange Carrizo [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cultivares Hamlin, Valência e Pêra, contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), para verificar se esses promotores regulam a expressão do gene repórter na região do floema. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro e como agente de seleção de regeneração de plantas transgênicas foi utilizado o gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina. Dos brotos regenerados foi coletada uma amostra de material para a realização do ensaio histoquímico com X-GLUC. Os brotos que formaram coloração azulada confirmaram a integração do transgene, sendo esses enxertados em porta enxertos previamente germinados e estiolados in vitro. A partir do número de explantes introduzidos, número explantes responsivos, número de brotos regenerados e número de brotos regenerados GUS positivos calculou-se a eficiência de transformação genética dos experimentos. Para a confirmação da transformação genética de laranja Hamlin foram realizadas análises de PCR e Southern blot de três plantas GUS positivas aclimatizadas. Também foram feitos cortes histológicos manuais para melhor visualização da reação histoquímica de GUS das plantas de laranja Hamlin Southern blot positivas. Todos os experimentos de transformação regeneraram pelo menos um broto GUS positivo. As plantas de laranja Hamlin analisadas por PCR e Southern blot analisadas foram confirmadas como transformadas com uma inserção do transgene. Plantas nas quais foram realizados cortes histológicos indicaram expressão diferencial das construções gênicas no floema. / Huanglongbing (HLB) is one of the most threatening diseases to worldwide citriculture and till the present moment, no resistance has been found in citrus genetic basis. This disease has Candidatus Liberibacter spp. as the pathogenic agent, an endemic phloem bacterium. Therefore, in the search for a transgenic plant resistant to HLB, it is desirable to evaluate constructions in which the gene of interest is expressed, preferentially, in tissues where the bacteria grow, i.e., in the phloem. Therefore, this work aimed to obtain transgenic plants of Carrizo citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck], and of Hamlin, Valencia, and Pera sweet oranges [Citrus sinensis (L.) Osbeck], via Agrobacterium tumefaciens, containing uidA (GUS) gene, controlled by the promoters Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), in order to check if these promoters drive the reporter gene expression in the phloem. For the transformation, in vitro germinated seedlings epicotil segments were used. The gene nptII, which confers resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selective system. From the regenerated shoots, a tissue sample was collected to perform the X-GLUC histochemical analysis. The regenerated shoots colored in blue were considered transgenic, and these were grafted on in vitro grown rootstocks. The transformation efficiency of each experiment was calculated based on the number of introduced explants, responsive explants, number of regenerated shoots, and number of GUS positive regenerated shoots. In order to confirm the genetic transformation of Hamlin sweet orange, PCR and Southern blot analyses of three positive GUS acclimatized plants were performed. Anatomic slices for better visualization of blue color formed by GUS reaction were also made. All transformation experiments regenerated at least one GUS positive shoot. Plants of Hamlin sweet orange analyzed by PCR and Southern blot are transformed and have one transgene insertion. Anatomical analyses indicated preferential expression of the transgenes in the phloem.