A utilização de biofertilizantes se tornou um assunto bastante estudado como alternativa à degradação ambiental e às perdas econômicas geradas pelo uso excessivo de fertilizantes nitrogenados e fosfatados na agricultura. Os organismos utilizados nessas formulações são capazes de promover o crescimento vegetal, não apenas através da fixação biológica de nitrogênio, mas também através de outras características que podem ser benéficas às plantas. Este estudo teve como objetivo isolar bactérias putativamente fixadoras de nitrogênio (diazotróficas) e avaliar a diversidade desses isolados e de algumas características de promoção de crescimento vegetal nos locais amostrados. Os isolados foram obtidos de amostras de raízes de trigo e de solo rizosférico a elas associado de seis localidades produtoras de trigo no Estado Rio Grande do Sul. O isolamento foi realizado pela utilização de meios semissólidos sem nitrogênio e os isolados foram testados quanto a suas habilidades de solubilizar fosfato e produzir sideróforos e compostos indólicos. A identificação dos isolados foi feita através do sequenciamento parcial do gene que codifica a subunidade ribossomal 16S. Os gêneros bacterianos mais abundantes encontrados entre os 346 isolados obtidos foram Pseudomonas, Burkholderia, Rhizobium e Enterobacter. A diversidade das comunidades bacterianas estudadas (H’) se mostrou mais influenciada pelo pH e pelo teor de matéria orgânica do solo, segundo a Análise de Componentes Principais. Apenas 55 isolados foram capazes de solubilizar fosfatos, a maioria pertencente ao gênero Burkholderia e representantes da família Enterobaceriaceae. A capacidade de produzir sideróforos foi encontrada em 209 isolados, enquanto a produção de compostos indólicos foi observada na totalidade dos isolados. Os isolados do gênero Burkholderia foram encontrados comumente relacionados à solubilização de fosfato e produção de sideróforos, sugerindo a importância desse gênero na incorporação de nutrientes pelas plantas. Dez isolados foram selecionados para experimentação in vivo em câmara de crescimento. Os isolados mais eficientes em promover o crescimento da variedade de trigo utilizada foram B. phymatum GM55 e B. phytofirmans BV47. Experimentos em campo estão em andamento para avaliar o potencial dessas linhagens como biofertilizantes. / Biofertilizers usage has become a very well studied subject as an alternative for environmental damage and economic losses caused for the excessive use of nitrogen and phosphate fertilizers in agricultural crops. The organisms used in these formulations are able to promote plant growth not only through biological nitrogen fixation, but also through others beneficial abilities. This study aimed to isolate putative nitrogen fixing bacteria (diazotrophs) and evaluate some of their plant growth promoting traits according to the sampling sites. The isolates were obtained from roots of wheat plants and from the rhizospheric soil associated to them from six wheat producers’ localities in Rio Grande do Sul state. The isolation procedure was conducted with free-nitrogen semi-solid media and the isolates were assayed for their abilities to solubilize phosphates and to produce siderophores and indolic compounds. Isolates’ identification was performed through partial sequencing of ribosomal 16S subunit coding gene. The most abundant genera found among the 346 isolates were Pseudomonas, Burkholderia, Rhizobium, and Enterobacter. Bacterial community diversity (H’) showed to be mostly influenced for pH and organic matter soil content, according to Principal Component Analysis. Only 55 isolates were able to solubilize phosphates, mostly belonging to Burkholderia genus and members of the Enterobaceriaceae family. The ability to produce siderophores was present in 209 isolates, while indolic compounds production ability was present in all isolates. Isolates belonging to Burkholderia genus were found to be usualy related to phosphate solubilization and siderophore production, suggesting the importance of strains belonging to this genus to plant nutrient uptake. Ten isolates were selected to perform an in vivo experiment in cultivation chamber condition. The most effective isolates to promote plant growth in the evaluated parameters were B. phymatum GM55 and B. phytofirmans BV47. Field experiments are under way to evaluate their potential as biofertilizers.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T12:00:03Z No. of bitstreams: 2 TESE Giselle Maria Dias.pdf: 1072424 bytes, checksum: ac6489f7f1872d4efdeca7cad6161b43 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T12:00:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Giselle Maria Dias.pdf: 1072424 bytes, checksum: ac6489f7f1872d4efdeca7cad6161b43 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / O queijo de Coalho é um produto típico da Região Nordeste do Brasil. Em Pernambuco é produzido a partir de leite de vaca cru e representa a principal fonte de renda da Região Agreste do Estado. O presente trabalho teve como objetivo estudar o potencial antimicrobiano e tecnológico de BAL isoladas de queijos de Coalho produzido artesanalmente no Município de Venturosa, Região Agreste do Estado de Pernambuco-Brasil, e determinar as características físico-químicas desses queijos. A microbiota lática foi avaliada através da contagem presuntiva das Unidades Formadoras de Colônia (UFC), isolamento em meio Ágar APT nas temperaturas de 30 e 37°C e identificação bioquímica. A avaliação do potencial antagônico foi realizada pela técnica de difusão em disco frente à Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 6538, enquanto que o potencial tecnológico das BAL foi avaliados através de sua capacidade de acidificar o Leite Desnatado Reconstituído (LDR) a 10% (p/v) após 6 e 24h de incubação, produzir enzimas extracelulares com atividade proteolítica, produzir aroma a partir do metabolismo do citrato e crescer em presença de 3 e 4% (p/v) NaCl. De um total de 349 isolados, 210 (60,17%) foram confirmados como BAL, dentre estas, 76 amostras, todas com morfologia de coco e capazes de coagular o LDR a 12% (p/v) em até 18h de incubação, foram selecionadas para a etapa de identificação bioquímica e para os testes de atividade antagônica e do potencial tecnológico. Dentre as BAL selecionadas foram encontrados os gêneros Enterococcus (37,18%), Lactococcus (19,23%), Streptococcus (25,64%) e Leuconostoc (15,38%). A grande maioria das BAL testadas quanto à atividade antimicrobiana foi capaz de inibir o crescimento de Staphylococcus aureus ATCC 6538 (82,89%) e Escherichia coli ATCC 25922 (88,15%). O acompanhamento da evolução da acidificação pelas BAL, através do pH e acidez titulável, indicou a presença de micro-organismos com diferentes capacidades de acidificação que foram classificados como culturas iniciadoras ou acidificantes rápidas e culturas adjuntas ou acidificantes lentas. A maioria das BAL analisadas foi capaz de produzir enzimas proteolíticas extracelulares (82,89%) e aroma (65,79%) na intensidade forte, moderada, fraca, assim como crescer na presença de altas concentrações de cloreto de sódio. Os resultados físico-químicos caracterizaram o queijo de Coalho como de alta umidade (50,6%), gordo (53,6%) e teor de cloreto de 0,92%. Esses resultados confirmam que as BAL isoladas do queijo de Coalho de Venturosa podem promover a coagulação do leite e criam um ambiente desfavorável para micro-organismos contaminantes, atuar no desenvolvimento das características organolépticas (sabor e aroma) e assegurar a qualidade sanitária e microbiológica desse queijo. O conhecimento da biodiversidade de BAL autóctones do queijo de Coalho de Venturosa e de suas propriedades tecnológicas permitiu avaliar como esses diferentes micro-organismos contribuem nas características organolépticas desse queijo e selecionar BAL com potencial promissor para a elaboração de fermentos láticos destinados a elaboração de queijo de Coalho a partir de leite pasteurizado.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-05-23T18:55:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação PPGCB.Diego Marques.versão final.ficha catalográfica.pdf: 1282275 bytes, checksum: f4bfca3ba7307797524e0ed6deece88a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-23T18:55:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação PPGCB.Diego Marques.versão final.ficha catalográfica.pdf: 1282275 bytes, checksum: f4bfca3ba7307797524e0ed6deece88a (MD5) Previous issue date: 2015-02-28 / FACEPE / O peixe amazônico tambaqui (Colossoma macropomum) é uma das espécies comerciais mais importantes da atividade piscícola no Brasil ocupando a terceira posição no “ranking” nacional. Doenças são as principais causas de perdas em piscicultura intensiva. A pressão que as técnicas de cultivo exercem sobre o organismo do peixe, torna-o suscetível a ação de patógenos. Dentre os patógenos de importância para a piscicultura destacam-se as bactérias pertencentes ao gênero Aeromonas, sendo agentes etiológicos de diversas patologias, com capacidade de gerar surtos de mortalidades em criações de peixes. O nosso grupo de pesquisa identificou iniciamente a lectina presente no soro do tambaqui (ComaSeL). Lectinas são proteínas ou glicoproteínas que se ligam especifica e reversivelmente a carboidratos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar espécies de Aeromonas de tambaquis submetidos a estresse por confinamento, e avaliar o perfil de expressão da lectina presente no soro do peixe frente a desafio com espécies de Aeromonas isoladas do tambaqui. Para o isolamento de Aeromonas foram utilizados três peixes submetidos a estresse de confinamento, (permanência em tanque de 1000 L com a lâmina d’água no limiar do dorso do animal por 96 h) e três peixes utilizados como grupo controle (retirados diretamente do viveiro). O isolamento de Aeromonas foi efetuado do tecido branquial e seguiu procedimento padrão de maceração, diluição do macerado em água destilada esterilizada e semeio em meios específicos. A identificação em nível de gênero e espécie seguiu metodologia padrão de testes fisiológicos e bioquímicos. Para o desafio foram selecionadas duas cepas pertencentes a espécies reconhecidamente patógenas (A. caviae e A. bestiarum). Trinta e seis tambaquis foram divididos em três grupos: infectado 1 (desafiado com A. bestiarum), infectado 2 (desafiado com A. caviae) e o grupo controle. O desafio foi feito com a aplicação de 1 mL de uma suspensão de crescimento recente com concentração final de 1,5 x 108 UFC/mL de cada cepa em seu respectivo grupo, e de 1 mL de solução fisiológica no grupo controle. Nos tempos 0, 24, 48 e 72 h três animais de cada grupo foram sacrificados e amostras de sangue foram coletadas. A lectina foi avaliada através da atividade hemaglutinante específica. Ao total foram isoladas 72 cepas pertencentes ao gênero Aeromonas. A maior parte dos isolados (97%) foi obtida dos peixes submetidos ao estresse, confirmando que o estresse favorece a proliferação de patógenos. Houve prevalência das espécies A. bestiarum (48,6%) e A. caviae (37,5%) que são descritas como causadoras de septicemia por Aeromonas móveis. Em relação ao perfil de expressão da lectina, os tratamentos não apresentaram diferenças significativas entre si. Os tratamentos controle e infectado 1 não variaram significativamente entre os tempos. O tratamento infectado 2 apresentou aumento significativo na atividade hemaglutinante específica a partir de 48 h após a infecção. Comparando a atividade hemaglutinante em cada período para os três tratamentos, observou-se que no tratamento 1, 24 h após a infecção, houve diferença significativa na atividade hemaglutinante. Os resultados indicam que A. caviae e A. bestiarum foram capazes de estimular a expressão de lectinas no soro do tambaqui. / The tambaqui (Colossoma macropomum) is one of the most important commercial species of fish activity in Brazil. It offers a great quality of meat, excellent standard of high growth and hardiness, which favors its creation in intensive fish farming. Diseases are the main causes of losses in intensive fish farming. The pressure that cultivation techniques have on the fish’s body makes it susceptible to pathogens action. Among the pathogens of importance to fish there are the bacteria belonging to the genus Aeromonas, being etiological agents of various diseases, capable of generating mortality outbreaks in fish creations. Our research group identified the lectin there is present in the serum of tambaqui (ComaSeL). Lectins are proteins or glycoproteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The objective of this study was to isolate and identify species of tambaqui’s Aeromonas subjected to stress confinement, and evaluate the expression profile of this lectin in fishs infected with Aeromonas species isolated from tambaqui. For the isolation of Aeromonas were used three fish undergoing stress of confinement, held in 1000 L tank with a water depth in the animal's back the threshold for 96 h, and three slaughtered direct from fish nursery. The isolation of Aeromonas was made of gill tissue and followed standard procedure of maceration, dilution macerated in sterile distilled water and sow in specific media. The identification of the genus and species, followed standard methodology of physiological and biochemical tests. For the challenge were selected two strains of recognized pathogenic species (A. caviae and A. bestiarum). Thirty-six tambaquis were divided into three groups: 1 infected (challenged with A. bestiarum), infected 2 (challenged with A. caviae) and the control group. The challenge was done by applying 1 mL of a recent growth in suspension with a final concentration of 1.5 x 108 CFU / mL for each strain in the respective group, and 1 mL of saline control group. At 0, 24, 48 and 72 h three animals from each group were sacrificed and blood samples were collected. The lectin was evaluated by specific hemagglutination activity assay. In total were isolated 72 strains belonging to the genus Aeromonas. The majority of isolates (97%) was obtained from fish subjected to stress, confirming that stress favors the proliferation of pathogens. The prevalence of A. bestiarum (48.6%) and A. caviae (37.5%) that are described as sepsis-causing by mobile Aeromonas. In relation to the lectin expression profile, the treatments were not significantly different from each other. The control treatments and infected 1 did not vary significantly between the times. Treatment infected 2 showed an increase in specific hemagglutination activity from 48 h after infection. Comparing the hemagglutinating activity of each period for the three treatments, It was observed that the treatment 1, 24 h after infection, there was a significant difference in hemagglutination activity. The results indicate that A. bestiarum and A. caviae were capable of stimulating the expression of lectins in serum tambaqui.

Submitted by Vitor de Carvalho (vitor_carvalho_im@hotmail.com) on 2014-10-29T17:40:41Z No. of bitstreams: 1 Efeito da bacteriocinogenicidade do Lactobacillus sakei 2a na qualidade microbiológica da sardinha - verdadeira (Sardinella brasiliensis) fermentada.pdf: 3904279 bytes, checksum: 241587f332d4f775c615f7812695b638 (MD5) / Rejected by cristiane soares (krikasoares@live.com), reason: falta o link na citação e a data do acesso on 2014-11-21T17:30:05Z (GMT) / Submitted by Vitor de Carvalho (vitor_carvalho_im@hotmail.com) on 2014-11-21T17:54:08Z No. of bitstreams: 1 Efeito da bacteriocinogenicidade do Lactobacillus sakei 2a na qualidade microbiológica da sardinha - verdadeira (Sardinella brasiliensis) fermentada.pdf: 3904279 bytes, checksum: 241587f332d4f775c615f7812695b638 (MD5) / Approved for entry into archive by cristiane soares (krikasoares@live.com) on 2014-12-17T14:34:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Efeito da bacteriocinogenicidade do Lactobacillus sakei 2a na qualidade microbiológica da sardinha - verdadeira (Sardinella brasiliensis) fermentada.pdf: 3904279 bytes, checksum: 241587f332d4f775c615f7812695b638 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-17T14:34:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Efeito da bacteriocinogenicidade do Lactobacillus sakei 2a na qualidade microbiológica da sardinha - verdadeira (Sardinella brasiliensis) fermentada.pdf: 3904279 bytes, checksum: 241587f332d4f775c615f7812695b638 (MD5) Previous issue date: 2003 / Produtos de peixe obtidos por fermentação lática são muito comuns no sudoeste da Ásia. A composição e a qualidade variam consideravelmente apesar de serem produzidos em pequena escala; a fermentação da mistura peixe - sal - carboidrato é dependente da microbiota natural. Neste trabalho, a mistura peixe (Sardinella brasiliensis) - NaCl - glicose foi usada para avaliar os fatores que favorecem a rápida fermentação lática, o rápido decréscimo do pH (< 4,5) e uma rápida multiplicação das bactérias láticas (BL) com redução dos microrganismos deterioradores. Foram avaliados as características da fermentação lática e os principais fatores antimicrobianos produzidos pelo Lactobacillus sakei 2a. O principal fator antimicrobiano identificado foi a habilidade do Lactobacillus sakei 2a para produzir ácidos orgânicos e reduzir o pH do peixe (Sardinella brasiliensis) fermentado. Outro fator, como a produção de bacteriocinas pode ter contribuído para a segurança alimentar, mas sua participação é secundária. A bacteriocina produzida pela cepa (Lactobacillus sakei 2a), isolada a partir de “lingüiça frescal” (embutido de carne tipicamente brasileiro) foi ativa contra Listeria monocytogenes. A detecção das bacteriocinas foi realizada utilizando o sobrenadante, obtido por centrifugação do meio de cultivo, pelo método da difusão em poços, usando Listeria monocytogenes Scott A como microrganismo indicador. As colônias circundadas por uma zona clara de inibição, indicaram a presença de bacteriocinas no meio de cultivo a partir de 4 horas de fermentação, quando o microrganismo encontrava-se na fase exponencial de crescimento. A produção de bacteriocinas foi máxima após 7 horas de incubação e a cultura neste momento apresentou uma carga equivalente a 5 x 107 UFC mL-1. Após este tempo, não houve mais produção de bacteriocinas. A relação de fermentação aumentou na faixa entre 2 e 4% glicose (p/p), ao passo que, com o aumento da concentração de NaCl, de 2 para 6%, houve somente uma pequena relação de redução do pH. De acordo com os objetivos, não houve dificuldades na redução do pH para valores inferiores a 4,5 nas primeiras 48 horas de fermentação. A glicose foi fermentada rapidamente, mas a redução do pH (3,9) foi lenta na sardinha suplementada com 4% glicose e 6% NaCl. A acidez titulável (% ácido lático), após 21 dias de fermentação, atingiu 2,55% (2% glicose) e 2,76% (4% glicose) com 2% NaCl. Com a inoculação do starter (Lactobacillus sakei 2a), foi mantida a qualidade microbiológica (produto); as bactérias deterioradoras reduziram significativamente, provavelmente por causa do baixo valor do pH. Várias pesquisas, relacionadas com a avaliação de microrganismos patogênicos em alimentos; como Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Clostridium sporogenes e Escherichia coli, indicam que estas bactérias desaparecem rapidamente durante a fermentação. A contagem de bactérias em PCA mostrou um aumento até o 70 dia e posteriormente foi reduzindo gradualmente até o final da fermentação para 1,4 x 109 UFC g-1 com 6% NaCl e 2% glicose. Na suplementação com 6% NaCl e 4% glicose, a maior redução foi 6,5 x 109 UFC.g-1. O aumento, no começo da fermentação se deve à presença de bactérias não formadoras de ácidos que gradualmente desaparecem durante o processamento pela transformação do meio em um substrato bastante acidificado. As bactérias láticas ou formadoras de ácidos (FA) predominaram durante todo o período de fermentação e as bactérias não formadoras de ácidos (NFA) permaneceram presentes, apenas, no reduzido estágio inicial da fermentação. Durante os 21 dias de fermentação, houve um aumento na relação entre os teores de nitrogênio protéico e nitrogênio solúveis total, evidenciando a autólise, indicando a formação de diferentes aminas e bases nitrogenadas voláteis. A extensão da proteólise durante a fermentação depende não só da natureza da microbiota como dos parâmetros de processamento, com influencia direta na atividade das proteases e peptidases envolvidas no processo.

O gênero Proteus é caracterizado pela rápida mobilidade, fenômeno denominado swarming . Quanto à homologia de seu DNA, apresenta apenas uma discreta relação com o da Escherichia coli. Freqüentemente relacionado com infecções urinárias, facilitadas pela sua capacidade em degradar uréia, tem sido encontrado colonizando cateteres e sondas vesicais, principalmente a espécie Proteus mirabilis. Devido a sua crescente importância na prática clínica, tanto como agente infeccioso de difícil erradicação, quanto como microrganismo com possibilidade de produzir β-lactamases de espectro expandido, seu controle no ambiente hospitalar tornou-se essencial. A necessidade da correta identificação dessa bactéria estimulou com que métodos de identificação molecular sejam constantemente estudados e aprimorados para essa finalidade. Métodos baseados em PCR têm se mostrado úteis, mas precisam ser validados para a rotina laboratorial. Diversos fatores de patogenicidade, ou seja, características biológicas de Proteus que favorecem a sua participação em processos infecciosos têm sido identificados, tais como: a capacidade de mobilidade e fixação celular, produção de protease, urease e hemolisina. Diversos autores inferem que a correta co-regulação desses fatores de virulência durante a diferenciação de swarming está relacionada com a capacidade de colonizar e invadir o tecido do hospedeiro. Vários estudos sugerem que extratos vegetais podem ser importantes produtos no controle de P. mirabilis ao interferir em sinais de quorum sensing , e consequentemente, na diferenciação celular e expressão de fatores de virulência. Neste sentido, os terpenos, compostos presentes em óleos essenciais, podem representar uma alternativa viável no controle de infecções por esses microrganismos. As proteases microbianas vêm se destacando como importantes fatores de virulência devido a ação direta sobre proteínas do hospedeiro, particularmente imunoglobulinas. O estudo em P. mirabilis tem sido focalizado na protease ZapA (mirabilisina), enzima capaz de degradar IgA, IgG, entre outras proteínas. Trabalhos relatam que não somente ZapA é regulada durante o swarming , mas também hemolisinas, fatores ligados à diferenciação celular e hiperprodução do flagelo. Assim sendo, na presente tese foram avaliados distintos sistemas via PCR (RAPD, ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR e ISSR) para caracterização molecular de isolados clínicos de P. mirabilis, o efeito de monoterpenos sobre a diferenciação celular e a produção de fatores de patogenicidade dessas bactérias, e realizado um estudo bioinformático sobre o complexo de metaloproteases com base no recentemente publicado genoma de P. mirabilis. / O gênero Proteus é caracterizado pela rápida mobilidade, fenômeno denominado swarming . Quanto à homologia de seu DNA, apresenta apenas uma discreta relação com o da Escherichia coli. Freqüentemente relacionado com infecções urinárias, facilitadas pela sua capacidade em degradar uréia, tem sido encontrado colonizando cateteres e sondas vesicais, principalmente a espécie Proteus mirabilis. Devido a sua crescente importância na prática clínica, tanto como agente infeccioso de difícil erradicação, quanto como microrganismo com possibilidade de produzir β-lactamases de espectro expandido, seu controle no ambiente hospitalar tornou-se essencial. A necessidade da correta identificação dessa bactéria estimulou com que métodos de identificação molecular sejam constantemente estudados e aprimorados para essa finalidade. Métodos baseados em PCR têm se mostrado úteis, mas precisam ser validados para a rotina laboratorial. Diversos fatores de patogenicidade, ou seja, características biológicas de Proteus que favorecem a sua participação em processos infecciosos têm sido identificados, tais como: a capacidade de mobilidade e fixação celular, produção de protease, urease e hemolisina. Diversos autores inferem que a correta co-regulação desses fatores de virulência durante a diferenciação de swarming está relacionada com a capacidade de colonizar e invadir o tecido do hospedeiro. Vários estudos sugerem que extratos vegetais podem ser importantes produtos no controle de P. mirabilis ao interferir em sinais de quorum sensing , e consequentemente, na diferenciação celular e expressão de fatores de virulência. Neste sentido, os terpenos, compostos presentes em óleos essenciais, podem representar uma alternativa viável no controle de infecções por esses microrganismos. As proteases microbianas vêm se destacando como importantes fatores de virulência devido a ação direta sobre proteínas do hospedeiro, particularmente imunoglobulinas. O estudo em P. mirabilis tem sido focalizado na protease ZapA (mirabilisina), enzima capaz de degradar IgA, IgG, entre outras proteínas. Trabalhos relatam que não somente ZapA é regulada durante o swarming , mas também hemolisinas, fatores ligados à diferenciação celular e hiperprodução do flagelo. Assim sendo, na presente tese foram avaliados distintos sistemas via PCR (RAPD, ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR e ISSR) para caracterização molecular de isolados clínicos de P. mirabilis, o efeito de monoterpenos sobre a diferenciação celular e a produção de fatores de patogenicidade dessas bactérias, e realizado um estudo bioinformático sobre o complexo de metaloproteases com base no recentemente publicado genoma de P. mirabilis.

Polihidroxialcanoatos são polímeros 100% biodegradáveis produzidos intracelularmente por bactérias, que possuem características semelhantes às de polímeros de origem petrolífera e configuram uma alternativa a estes polímeros, os quais devido ao seu crescente acúmulo na natureza vêm se tornando um grave problema ambiental. O poli(3-hidroxibutirato) (PHB) é um poliéster que faz parte deste grupo, sendo o mais amplamente estudado. Visando o aproveitamento do soro de leite, que é gerado em volumes elevados na produção de queijo, e ainda uma possível redução de custos do processo de produção de PHB, este trabalho avaliou a produção deste polímero por meio das bactérias Alcaligenes latus e Bacillus megaterium. Inicialmente investigou-se o efeito de diferentes concentrações iniciais de lactose e de diferentes tempos de processo, em ensaio realizado em agitador orbital a 35 °C e 200 rpm. Definiu-se também qual das bactérias apresentou melhor desempenho e a concentração inicial de lactose por meio de ensaio em agitador orbital com as mesmas condições mencionadas anteriormente. Estes resultados foram avaliados por meio de planejamento experimental fatorial 2³ sem ponto central. Avaliou-se o efeito da neutralização do meio de cultivo preparado com o sobrenadante obtido após a precipitação ácida das proteínas do soro de leite com hidróxido de amônio (NH4OH), hidróxido de potássio (KOH) e hidróxido de sódio (NaOH) (soluções 10% m/v) por meio de análise estatística de um fator a vários níveis (ANOVA). Ainda, foram comparados (por meio de ANOVA) quatro meios de cultivo (produzidos com lactose, soro de leite, sobrenadante obtido após a precipitação ácida das proteínas do soro de leite, lactose extraída por processos de separação por membranas) por meio de ensaio em agitador orbital nas mesmas condições previamente mencionadas. O meio que proporcionou maior concentração final de PHB foi utilizado em ensaio em biorreator de bancada, a 35 °C e pH controlado em 6,5. Na primeira fase, identificou-se que para a bactéria A. latus a concentração inicial de lactose mais adequada foi a de 20 g.L-1, com produção máxima de PHB de 0,55 g.L-1 em 12 horas, enquanto que para a bactéria B. megaterium foi de 16 g.L-1, com produção máxima de PHB de 0,095 g.L-1 também em 12 horas. Com a posterior análise estatística, verificou-se que não houve diferença significativa na geração de produto com as concentrações iniciais de lactose de 16 e 20 g.L-1. A bactéria que proporcionou maior produção de polímero foi a A. latus, enquanto o meio foi o composto pelo sobrenadante obtido após a precipitação ácida das proteínas do soro de leite (neutralizado com hidróxido de amônio - melhor resultado na neutralização). No ensaio em biorreator de bancada (TecBio 7,5, Tecnal, Brasil), constatou-se que o tempo total de processo foi de 11,6 horas, com máxima velocidade específica de crescimento de 0,428 h-1, máxima velocidade específica de formação de produto de 0,026 g.L-1.h-1, máxima velocidade específica de consumo de substrato de 1,036 g.L-1.h-1, fator de rendimento em células de 0,211 g.g-1, fator de rendimento em produto de 0,024 g.g-1 e produtividade volumétrica de 0,014 g.L-1.h-1. Ainda, por meio de caracterização do PHB extraído e do PHB padrão por calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria e espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier, verificou-se que o polímero produzido possui propriedades semelhantes às do padrão, demonstrando que a produção de PHB por A. latus e B. megaterium utilizando soro de leite é factível. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Polyhydroxyalkanoates are 100% biodegradable polymers produced intracellularly by bacteria, and have characteristics similar to petroleum-based polymers. They emerge as an alternative to recalcitrant polymers, that because of its growing accumulation in nature are becoming a serious environmental problem. Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) is a polyester which is part of this group, being the most studied. In order to utilize whey, which is generated in large volumes in cheese production, and also to enable a possible cost reduction of the PHB production process, this study evaluated the production of this polymer by Alcaligenes latus e Bacillus megaterium. First of all, the effect of different initial lactose concentrations and different process times were investigated in an orbital shaker at 35 °C and 200 rpm. In addition, it was defined which bacteria showed best results and also the appropriate initial lactose concentration in an orbital shaker in the same conditions mentioned. The results were evaluated by a factorial 2³ (without central point) experimental design. The neutralization of the medium (prepared with the supernatant obtained after the acid protein precipitation of whey) with ammonium hydroxide (NH4OH), potassium hydroxide (KOH) and sodium hydroxide (NaOH) (10% w/v solutions) was evaluated by a one factor statistical analysis (ANOVA). Also, four culture mediums (lactose, whey, supernatant obtained after acid protein precipitation of whey, lactose obtained by membrane filtration of whey) were compared through an experiment in orbital shaker in the same conditions used before. The results were also evaluated by a one factor statistical analysis. The medium with the best results was used in a bioreactor experiment, at 35 °C and pH controlled at 6.5. For A. latus the most appropriate initial lactose concentration was 20 g.L-1, with a maximum PHB concentration of 0.55 g.L-1 in 12 hours. For B. megaterium, the initial lactose concentration was 16 g.L-1, and a maximum PHB concentration of 0.095 g.L-1 also in 12 hours. With the posterior statistical analysis it was seen that there was no significant difference in PHB production with initial lactose concentrations of 16 and 20 g.L-1. A. latus showed better results for PHB production, while the best medium was the one produced with the supernatant obtained after acid protein precipitation of whey (neutralized with ammonium hydroxide - best neutralization results). In the bioreactor experiment was observed that the total process time was 11.6 hours, with a maximum specific growth rate of 0.428 h-1, maximum specific product formation rate of 0.026 g.L-1.h-1, maximum specific substrate consumption rate of 1.036 g.L-1.h-1, cell yield of 0.211 g.g-1, PHB yield of 0.024 g.g-1 and volumetric productivity of 0.014 g.L-1.h-1. Finally, it was seen, through the polymer characterization by differential scanning calorimetry, thermogravimetry and Infrared Spectroscopy with Fourier transform, that the produced polymer has similar characteristics to those of the standard PHB, showing that the production of PHB by A. latus and B. megaterium using milk whey is feasible.

Glicerol é um álcool gerado na produção de biodiesel, que corresponde 10% em relação ao biocombustível. Devido à crescente produção de biodiesel, pode ser utilizado como substrato para a obtenção de outros compostos, como o 2,3-butanodiol, através de vias fermentativas. Esta substância, que tem potencial de aplicação industrial e como combustível, pode ser obtida pela fermentação de glicerol pela bactéria anaeróbia facultativa Klebsiella oxytoca. Neste trabalho foram avaliados parâmetros e condições operacionais para o cultivo de K. oxytoca ATCC 8724, visando à obtenção de 2,3- butanodiol a partir de glicerol. Em razão do equilíbrio observado entre 2,3-butanodiol e acetoína, em proporção significativamente maior para o primeiro, no metabolismo fermentativo de K. oxytoca, a discussão dos resultados deste trabalho levam em conta a soma das concentrações destes compostos. Os resultados indicaram que este microrganismo metaboliza eficientemente o glicerol, visto que a velocidade média de crescimento celular neste substrato, em 8 horas de cultivo em frascos sob agitação, foi de 0,44 g/L/h, superior à obtida com glicose (0,38 g/L/h) nas mesmas condições. Observou-se que para substratos sacaríneos, que o metabolismo microbiano pode ser dividido em duas fases: na primeira fase, sem limitação de oxigênio, ocorre acentuado crescimento celular, em razão da prevalência da respiração, que resulta em substancial ganho energético para o microrganismo, enquanto na segunda fase, com limitação de oxigênio dissolvido, o fluxo de carbono é cada vez mais dirigido à formação de produtos de fermentação. Assim, em ensaios em regime descontínuo conduzidos em biorreator de bancada, o uso de uma velocidade característica de transferência de oxigênio (OTR) intermediária, da ordem de 17 mmol/L/h, proporcionou resultados superiores em termos de produção de 2,3-butanodiol, com conversão de 60 g/L de glicerol em 17,3 g/L do produto. Em regime descontínuo, a mais alta conversão de glicerol em produto foi alcançada com concentração inicial de substrato de 129 g/L, sendo produzidos, em 48 horas, 53,6 g/L de 2,3-butanodiol, o que significa um rendimento superior a 83% em relação ao máximo teórico. Com concentrações iniciais de glicerol de até 60 g/L, não foi constatado efeito inibitório sobre o crescimento celular. Por outro lado, o uso de 160 g/L de glicerol inicial levou a uma drástica redução do rendimento do processo (apenas 56,3%) e a uma concentração residual de substrato de 98 g/L, após 72 de cultivo. Com a condução do processo em regime descontínuo alimentado, como alternativa para contornar os efeitos de inibição pelo substrato, resultados expressivos foram alcançados com a massa de glicerol equivalente à que seria necessária para ter-se 202 g/L em regime descontínuo. Nestas condições, 92,1 g/L de 2,3-butanodiol e rendimento de 92,6%, foram alcançados, em 84 horas de fermentação. Os resultados revelam, o grande potencial de uso de glicerol como substrato para a produção de 2,3-butanodiol em escala industrial. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Glycerol is a by-product of biodiesel production, which accounts for approximately 10% of the biofuel. Since a large volume of it is formed in industry, glycerol could be used as a substrate to obtain other compounds, such as 2,3-butanediol, through fermentative routes. This substance, which has potential for application in industry and as fuel, can be obtained by glycerol fermentation with the facultative anaerobe bacterium Klebsiella oxytoca. In this work, parameters and operational conditions for the cultivation of K. oxytoca ATCC 8724, envisaging 2,3-butanediol production from glycerol, were assessed. Due to the equilibrium between 2,3-butanediol and acetoin, in a significantly higher proportion for the first product, in the fermentative metabolism of K. oxytoca, the discussion of this work takes in account the sum of concentrations of these compounds. The results have shown that the microorganism is able to efficiently metabolize glycerol once cell growth rate on this substrate, after 8 hours of cultivation in shake flasks, was 0.44 g/L/h, higher than that obtained with glucose (0.38 g/L/h) under the same conditions. As previously described for saccharides, it was observed that the microbial metabolism can be divided into two phases: in the first phase, without limitation of oxygen, an intense cell growth occurs due to the prevalence of respiration, that results in a substantial gain of energy for the microorganism, whereas in the second phase, under oxygen limitation, most of carbon flux is driven to the formation of fermentation products. Thus, in batch runs carried out in a bench bioreactor, the use of an intermediate characteristic oxygen transfer rate (OTR) of about 17 mmol/L/h, led to superior results in terms of 2,3-butanediol production, with conversion of 60 g/L of glycerol to 17.3 g/L of product. In batch mode, the highest conversion of glycerol to product was achieved with 129 g/L of initial substrate concentration, with the production of 53.6 g/L 2,3-butanediol, in 48 hours, which means a yield of 83% in relation to the theoretical maximum. With initial glycerol concentrations up to 60 g/L, no inhibitory effect on cell growth was observed. On the other hand, the use of 160 g/L of glycerol led to a drastic decrease in the process yield to 56.3% and to a residual concentration of substrate of 98 g/L after 72 h of cultivation. By carrying out the process in fed-batch mode, as an alternative to overcome the substrate inhibitory effects, remarkable results have been attained with the mass of glycerol that would be needed to have an initial concentration of 202 g/L in batch mode. Under these conditions, a final concentration of 92.1 g/L of 2,3-butanediol, corresponding to a yield of 92.6%, was achieved after 84 hours of fermentation. The results show clearly the high potential of the use of glycerol as a substrate for 2,3- butanediol production in industrial scale.

Esta dissertação analisa o meio ambiente do trabalho no Brasil, dando especial ênfase para o trabalho na construção civil, através da análise de dados oficiais sobre os acidentes de trabalho e as doenças profissionais deste setor, bem como suas principais irregularidades e as formas de combatê-las. Além disso, também é analisada a aplicação dos Princípios de Direito Ambiental na promoção de um meio ambiente de trabalho saudável e adequado no setor da consA criação de suínos representa uma importante atividade econômica, sendo o Brasil o quarto exportador de carne suína. O aumento da participação brasileira no mercado externo depende da adequação às normas internacionais de qualidade microbiológica nos produtos. Entre os microrgansmos encontrados em carnes suínas destacam-se as bactérias dos gêneros Salmonella, Escherichia,, Yersinia, Aeromonas, Listeria, Staphylococcus, Campylobacter, Bacillus, Clostridium. Aeromonas é um gênero de bactérias enteropatogênicas emergente encontrado no trato intestinal de divesos animais, incluindo o porco. No presente trabalho foi avaliada a ocorrência de Aeromonas em carcaças suínas na entrada de abate, utilizando plaqueamento e PCR do gene lipA. Os isolados foram classificados através de testes bioquímicos e RFLP-PCR 16S rRNA, e avaliados quanto à resistência a antibióticos e fatores de virulência. Os resultados obtidos mostraram que a amplificação por PCR do gene lipA representa um método rápido, eficiente e sensível de determinação da presença de Aeromonas em amostras de origem animal. Elevada incidência de Aeromonas foi constatada tanto por PCR-lipA (97%), quanto por plaqueamento (86,7%). As contagens bacterianas em carcaças suínas foi da ordem de 1 a 4 logUFC/100cm2. As espécies de Aeromonas mais prevelentes em suínos foram A. media (35,7%), A. hydrophila (26,2%) e A. caviae (21,4%). A maior parte dos isolados apresentaram produção de mais de um fator de virulência, indicando o seu potencial patogênico. A alta frequência observada de isolados resistentes a sulfametoxazol/trimetoprima e tetraciclina é indicativo do uso indiscriminado destes antibióticos durante a criação de suínos. De um modo geral os dados reforçam a necessidade de avaliação de Aeromonas em amostras animais e alimentos derivados, assim como o potencial do PCR-lipA na determinação qualitativa destas bactérias. / Pork production represents a very important economic activity in South Brazil. Today, Brazil hold the forth place in pork meat international marker. The expansion of Brazilian exports depends of the adequation to the international roules of microbiological quality. Among the microorganisms currently found in porc meat, the most importants belong to the genera: Salmonella, Escherichia,, Yersinia, Aeromonas, Listeria, Staphylococcus, Campylobacter, Bacillus, Clostridium. Aeromonas is a genus of emmergent enteropathogenic bacteria found in the intestinal tract of several animals, including pigs. In the present work it was evaluated the occurrence of Aeromonas in carcasses of pig using plating and PCR-lipA methods. The isolates were classified by biochemical tests and RFLP-PCR 16S rRNA, and evaluated for antibiotic resistance and the production of virulence factors. The results obtained showed that PCR amplification of lipA gene represents a rapid, efficient and sensible method to determine the presence of Aeromonas in animal samples. High incidence of Aeromonas in carcasses of pig was verified both by PCR-lipA (97%), and a conventional plating method (86.7%). Bacterial counts in carcasses of pig ranged from 1 to 4 logUFC/100cm2. The most prevalente Aeromonas species isolated from carcasses of pig were A. media (35,7%), A. hydrophila (26,2%) and A. caviae (21,4%). Most isolates showed the production of more than one virulence factor, indicating their pathogenic potential. The hig frequency of sulfametoxazol/trimetoprima and tetraciclina resistant isolates is an indicative of the indiscriminate use of these antibiotics during pig production. In general, the present results reinforce the necessity of Aeromonas evaluation in animal samples and derived products, as well as the potential of PCR-lipA in the qualitative determination of Aeromonas.

Made available in DSpace on 2018-08-24T22:53:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_3675_diss Juliana.pdf: 4174281 bytes, checksum: 40690dc877ba0b06aad6080f933e9ad2 (MD5) Previous issue date: 2009-07-17 / As áreas costeiras promovem benefícios diversos à população, porém, são largamente afetadas pelo influxo de esgoto sanitário sem tratamento, acarretando em prejuízo para a saúde da população. A contaminação por patógenos emergentes, tais como os vírus entéricos, é um agravante. Estes patógenos, podem ser encontrados em diversos ambientes, sobreviver por longos períodos, e causar diversas doenças. O sistema estuarino da Baía de Vitória, local de estudo deste trabalho, é um exemplo de área costeira afetada. Por isso, buscou-se avaliar a qualidade microbiológica da água e de mexilhões (sururu do mangue - Mytella guyanensis) em área de manguezal do sistema estuarino da Baía de Vitória, analisando 3 locais de coleta de água desse estuário ao longo de 14 meses de monitoramento (fevereiro/2008 a março/2009). Foram avaliados parâmetros físico-químicos (pH, turbidez, condutividade elétrica e Sólidos Dissolvidos Totais SDT), bacteriológicos (Coliformes Totais (CT) e E. coli) e virológicos (adenovírus, rotavírus e norovírus GII). Os vírus entéricos foram detectados por meio da técnica de PCR. Os resultados das análises físico-químicas revelaram maiores valores de turbidez e menores de condutividade e SDT nos meses mais chuvosos, especialmente no ponto mais próximo ao rio. Os resultados das análises bacteriológicas revelaram elevada contaminação do sururu, com densidades de até 106 NMP/25g de CT. Nas amostras de água, foram observadas densidades de até 105 NMP/100mL de CT, no ponto de coleta mais próximo ao cais do bairro. Valores mais elevados foram obtidos após eventos chuvosos. Quanto aos resultados das análises virológicas, adenovírus (AdV) foram detectados em 76,7% das amostras de água e de rotavírus (RV) em 88,1%. Nas amostras de sururu, AdV e RV foram detectados em 100% das amostras, evidenciando sua capacidade de concentrar partículas do meio circundante. O norovírus foi detectado em 4,8% das amostras de água e não foi detectado no sururu. A elevada contaminação fecal observada em pontos do estuário e do sururu indicam que esta área está sob impacto antropogênico. Assim, esta pesquisa torna-se um importante auxílio à decisões de implantação de medidas de proteção a este ambiente e na prevenção de surtos relacionados ao consumo de moluscos bivalves contaminados.