Chez certains pathogènes, les flavohémoglobines (flavoHbs) jouent un rôle important dans le système de défense des microorganismes en leur conférant une résistance contre le stress nitrosant généré par les cellules du système immunitaire. Dans la mesure où ces protéines sont absentes chez l’homme, plusieurs études ont été réalisées en vue de comprendre le fonctionnement des flavoHbs au niveau moléculaire en les considérant comme des cibles attractives potentielles pour des inhibiteurs sélectifs. L’inactivation de ces enzymes chez les pathogènes entraîne une perte de virulence. Des composés chimiques (dérivés azolés) ont été identifiés comme étant capables d’inhiber leur activité enzymatique et d’affecter les facteurs de virulence bactérienne. Si ces composés sont très utilisés dans le traitement d’infections fongiques cutanées invasives, leur activité antibactérienne potentielle n’est pas encore exploitée.Typiquement, les flavoHbs sont composées de trois domaines : un domaine à hème de type globine, un domaine de site de fixation d’une flavine et un domaine de fixation du substrat de l’enzyme, le NADH. Les structures cristallographiques des flavoHbs montrent que ce sont des protéines capables d'adopter des conformations différentes selon la nature et la présence de ligand de l’hème mais aussi selon l’organisme d’origine. Ces différentes conformations se traduisent par une mobilité d’un seul des trois domaines sans modification majeure des deux autres domaines. Nous avons entrepris, dans ce travail, l’étude de la flavoHb d’une bactérie pathogène, Staphyloccocus aureus (pathogenic bacteria), peu étudiée dans la littérature et sa comparaison avec celle issue de Ralstonia eutropha (bactérie non pathogène), mieux caractérisée, afin de tenter d’apporter des informations nouvelles voire plus spécifiques de leur fonctionnement chez les pathogènes.Le travail présenté dans ce manuscrit décrit tout d’abord la caractérisation fonctionnelle et biochimique de la flavoHb de S.aureus, et approfondi celle de R. eutropha. Du fait de l’absence de structure cristallographique de la flavoHb de S. aureus, nous avons construit un modèle structural théorique en se basant sur l’homologie de séquence forte entre la séquence d’acide aminée de S. aureus et celle de Saccharomyces cerevisiae dont la structure 3D a été récemment déterminée. Dans l’hypothèse où le mécanisme enzymatique des flavoHbs implique une transition entre différentes conformations, les flavoHbs de R. eutropha et S. aureus ont été modifiées génétiquement au niveau du résidu phénylalanine suggéré par l’analyse structurale comme pouvant jouer un rôle dans la transition entre les différentes conformations. Les conséquences de la mutation de Phe396 en Ser ou Ala ont été analysées au regard des activités catalytiques et des propriétés biochimiques de l’enzyme mais aussi des propriétés des transferts d’électrons intramoléculaires entre les groupements prosthétiques (hème et flavine) par différentes techniques spectroscopiques. Ce travail a permis de montrer que l’effet de la substitution du résidu Phe sur les propriétés enzymatiques diffère selon la flavoHb considérée et révèle dans certains cas un site de fixation de substrat autre que le substrat natif. L’effet d’inhibiteurs (dérivés azolés) mais aussi des quinones et de composés aromatiques nitrés sur le fonctionnement des protéines natives et modifiées génétiquement ont été également étudiés dans ce travail, ces derniers composés pouvant agir en tant que "substrats subversifs" pour les flavoHbs, transformant leurs fonctions de protection en fonctions cytotoxiques.L’ensemble de ce travail a montré que, malgré des structures et des séquences protéiques très voisines, les flavoHbs issues de bactéries différentes sont susceptibles de se comporter différemment vis-à-vis de l’introduction d’une même mutation, de l’effet d’un même inhibiteur et peuvent le cas échéant présenter aussi des cycles catalytiques sensiblement différents. / For some pathogens, flavohemoglobins (FlavoHbs) play an important role in the defense of microorganisms by conferring them a resistance against nitrosative stress generated by the immune system cells. Since these protein are absent in human, several studies have been conducted in order to understand the functioning of these proteins at the molecular level, considering them as potential attractive targets for selective inhibitors. Their inactivation results a loss of virulence. Chemical compounds such as azole derivatives have been identified as being capable of inhibiting their enzymatic function and thereby affecting the bacterial virulence factors. If these compounds are widely used in the treatment of invasive fungal skin infections, their potential antibacterial activity is not yet operated.Typically, flavoHbs are composed of three domains: an N-terminal globin domain which harbors a single heme b and a C-terminal ferredoxin reductase-like FAD- and NAD-binding module. The crystallographic structures of flavoHbs show that these proteins are able to adopt different conformations depending on the nature and the presence of heme ligand but also depending on different organisms they are coming from. The different conformations are characterized by a rigid body motion of one of the three domains. We have undertaken in this work, the study of the Staphyloccocus aureus flavoHb, poorly studied in the literature, and compared it to the Ralstonia eutropha flavoHb (non pathogenic bacteria) to provide new and more specific information on behaviors of these proteins derived from pathogens.This PhD work describes first the functional and biochemical characterization of the S. aureus flavoHb. Due to the lack of its crystallographic structure, a theoretical structural model was designed based on the strong sequence homology between the amino acid sequence of S. aureus and Saccharomyces cerevisiae for which the 3D structure was recently determined. We hypothesized that the relative movement of protein domains could be a way to regulate its enzymatic activity by controlling the substrate accessibility. The Phe396 residue (nomenclature according to R. eutropha), suggested by the structural data to play an important role in the enzyme functioning, but also in the equilibrium between different conformations, was substituted by the Ala or Serine amino acids. The effects of the punctual mutations were investigated with respect to the enzyme functioning and biochemical properties. The mutations effect on the internal electron transfer between flavoHbs cofactors (heme and FAD) was also studied by spectroscopic techniques. This work showed that the impact of Phe substitution on the enzymatic properties is different, depending the considered flavoHb and revealed an additional binding site for other substrate than the native one. The effects of azole derivative inhibitors and also quinones and nitroaromatic compounds have been studied on native and genetically modified enzymes functioning. The latter compounds may act as the ‘subversive substrates’ for flavoHb, converting its protective functions into the cytotoxic ones.Taken as a whole, this work showed that, although the protein structures and sequences are similar, the flavoHbs from different bacteria may behave differently towards an identical mutation, an identical inhibitor and could display different catalytic cycles.

Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Student: Bc. Lucie Polenová Supervisor: MUDr. Pavla Paterová Title of diploma thesis: Detection of methicillin - resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Hospital České Budějovice, a. s. and in University Hospital Hradec Králové The resistance of microbes to antibiotics belongs to worldwide health problems. Infections, which are caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), occur mainly in hospitals. It is because of incorrect and excesive consumption of antibiotics. Insufficient observance of hygienic-epidemiological measures helps to spread resistant strains. Background: The aim of the study was to determine the incidence of MRSA strains in two Czech hospitals - in Hospital České Budějovice, a.s. and in University Hospital Hradec Králové. To compare results with figures in the previous years and sort isolated strains by different characteristics in both hospitals. Methods: Results of the study are based on retrospective data analysis from electronic database. All data from hospitalized patients or outpatients during 1.1.2015 - 31.12.2015 with isolation of MRSA were counted. Processing and cultivation of isolates were made by standard microbiology measures. Strains,...

Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.

De todas as influências exógenas que possam alterar a microbiota intestinal, os antimicrobianos são capazes de causar as mais rápidas e drásticas mudanças. O impacto da exposição aos antimicrobianos na microbiota intestinal causa diminuição no número de microrganismos ou mesmo supressão, dependendo do antimicrobiano utilizado, da dose e do tempo de exposição. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar de forma comparativa alguns microrganismos que compõem a microbiota fecal de crianças com e sem antibioticoterapia em idade escolar; bem como avaliar a susceptibilidade aos antimicrobianos e os genes de resistência envolvidos. Foram coletadas amostras fecais não diarreicas de 30 crianças sem antibiótico (controle) e 31 de crianças com antibioticoterapia. Na análise quantitativa foi observada redução no número de cópias por g/fezes de: Bifidobacterium spp., B. fragilis, C. perfringens, E. coli, M. smithii e do filo Firmicutes nas amostras das crianças com antibióticos em relação ao grupo controle, exceto para Lactobacillus spp. e P. distasonis que apresentaram quantificação maior no grupo antibióticos quando comparados com o controle. E. coli foi isolada em 26 (86,7%) crianças controles e em 23 (74,2%) tratadas com antibióticos. A resistência foi verificada para diversas drogas no grupo controle exceto para ciprofloxacina, meropenem e tigeciclina; entretanto o grupo com antibioticoterapia apresentou elevada resistência para todas as drogas avaliadas, caracterizando os isolados desse estudo como MDR. Todos os isolados do grupo controle e antibióticos albergaram diversos genes de resistência, entretanto o gene blaKPC foi o único não detectado nos isolados do grupo controle. Desta forma, nossos dados demonstram que a antibioticoteria causa alterações qualitativas e quantitativas na microbiota intestinal; além disso, a elevada resistência as diversas classes de antimicrobianos das cepas de E. coli, bem como a presença de diversos genes de resistência ressalta a importância de cepas comensais serem MDR e albergarem esses genes. / Of all the exogenous influences that may alter the intestinal microbiota, antimicrobial agents are able to cause the more rapid and dramatic changes. The impact of exposure to antimicrobial agents on intestinal microbiota causes a decrease in the number of certain genera and species, depending on the antimicrobial agent used, dose and duration of exposure. Thus, the aim of this study was to analyze comparatively some microorganisms that composing the fecal microbiota of children with and without antibiotic therapy in school age; and evaluates the antimicrobial susceptibility and resistance genes involved. Stool samples (not diarrhea) were collected of 30 children without antibiotic (control) and 31 children with antibiotic therapy. In quantitative analysis was observed decrease in the number of copies per g/feces: Bifidobacterium spp., B. fragilis, C. perfringens, E. coli, M. smithii and the phylum Firmicutes in samples of children with antibiotic therapy in relation to control group, except Lactobacillus spp. and P. distasonis that showed a higher quantification in the antibiotics group when compared with control group. E. coli was isolated in 26 (86.7 %) children controls and in 23 (74.2 %) children treated with antibiotics. The resistance was verified for several drugs in the control group except for ciprofloxacin, meropenem and tigecycline; however the group with antibiotic therapy showed high resistance to all drugs evaluated, characterizing isolates of this study as MDR. All isolates from control group and antibiotics harbored several resistance genes, however blaKPC gene was the only one not detected in isolates from the control group. Thus, our data demonstrate that the antibiotic therapy cause qualitative or quantitative changes in intestinal microbiota leading to a decrease in the diversity and the elimination of microorganisms; in addition, the high resistance the various classes of antimicrobial of the strains of E. coli, as well as the presence of several genes of resistance highlights the importance of commensal strains are MDR and harboring these genes.

O uso imprudente de antibióticos para o tratamento da mastite bovina pode levar ao aumento da resistência bacteriana e ao comprometimento da eficácia dos tratamentos atuais. Desta maneira, novas alternativas para o tratamento da mastite devem ser procuradas. As actinobactérias são capazes de produzir extratos brutos que contêm metabólitos secundários ativos, que inibem o crescimento de outras bactérias. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a concentração inibitória mínima (CIM) de extratos brutos de actinobactérias para isolados de Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae e Streptococcus uberis, provenientes de 23 rebanhos leiteiros. Estes isolados foram identificados pela cultura microbiológica e por espectrometria de massas. Assim, foi realizada uma triagem, pelo bioensaio colorimétrico, de 15 extratos brutos, previamente testados e identificados, provenientes de actinobatérias isoladas de diferentes ambientes e plantas (caatinga, áreas de reflorestamento e do eucalipto) para 10 isolados de cada espécie causadora de mastite. Em seguida, os extratos Caat 1-54 e Caat P5-8 foram selecionados para determinação da CIM, a 50% (CIM50) e a 90% (CIM90). Para determinar a CIM dos extratos brutos, foram utilizados 20 isolados de cada espécie, totalizando 80 isolados. Foi utilizada a análise de sobrevivência para avaliação dos resultados. O extrato Caat 1-54 apresentou os menores valores de CIM50 e CIM90 para S. aureus (0,39 µg/mL e 6,25 µg/mL, respectivamente) e S. chromogenes (CIM50 = CIM90 = 0,78 µg/mL). O ceftiofur apresentou os menores valores de CIM tanto para Strep. dysgalactiae (CIM50 ≤ 0,048 µg/mL; CIM90 = 100 µg/mL), como para Strep. uberis (CIM50 ≤ 0,19 µg/mL; CIM90 = 0,39 µg/mL). Seguido do ceftiofur, o extrato Caat 1-54 foi o que apresentou menores valores CIM, com apenas uma diluição seriada de diferença entre as CIM50 das duas espécies (1,56 e 0,78 µg/mL para Strep. dysgalactiae e Strep. uberis, respectivamente). O extrato Caat P5-8 apresentou os maiores valores de CIM50 e CIM90 para todas as espécies estudadas (CIM ≥ 25 µg/mL). Os resultados obtidos indicam o potencial dos extratos brutos provenientes de actinobactérias para o tratamento da mastite bovina causada por S. aureus, S. chromogenes, Strep. dysgalactiae e Strep. uberis / The reckless use of antibiotics for the treatment of bovine mastitis can increase bacterial resistance and harm the effectiveness of current treatments. Thus, new alternatives for mastitis treatment must be searched. Actinomycetes are capable to produce crude extracts with secondary active metabolites that inhibit the growth of other bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the minimum inhibitory concentration (MIC) of crude extracts obtained from actinomycetes for Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae and Streptococcus uberis isolated from 23 dairy herds. These bacteria were identified by microbiology culture and mass spectrometry. Thus, the colorimetric bioassay was performed. In this screening 15 crude extracts previously tested and identified, obtained from actinomycetes from different Brazilian environments and plants (caatinga, reforestation areas and eucalyptus) were used for 10 isolates of each mastitis pathogens species. Then the Caat 1-54 and Caat P5-8 extracts were selected to the MIC 50% (MIC50) and 90% (MIC90) determination. Twenty mastitis pathogens isolates of each bacteria species were used. Survival analysis was used to evaluate the results. Caat 1-54 extract presented the lowest values of MIC50 e MIC90 for S. aureus (0.39 µg/mL and 6.25 µg/mL, respectively) and S. chromogenes (MIC50 = MIC90 = 0.78 µg/mL). On the other hand, ceftiofur presented the lowest MIC values for both Strep. dysgalactiae (MIC50 ≤ 0.048 µg/mL; MIC90 = 100 µg/mL) and Strep. uberis (MIC50 ≤ 0.19 µg/mL; MIC90 = 0.39 µg/mL). After ceftiofur, Caat 1-54 presented the highest efficiency against Strep. dysgalactiae and Strep. uberis and MIC50 for both species differed by only one serial dilution (1.56 e 0.78 µg/mL for Strep. dysgalactiae and Strep. uberis, respectively). Caat P5-8 extract presented the highest MIC50 and MIC90 values for all pathogens (MIC ≥ 25 µg/mL). Results indicated the potential of crude extracts from actinomycetes to treat bovine mastitis caused by S. aureus, S. schromogenes, Strep. dysgalactiae and Strep. uberis

Introdução: Isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes estão associados a elevadas taxas de mortalidade. A resistência ao imipenem é uma urgência global, uma vez que é considerado o tratamento de escolha para infecções associadas a bactérias Gram negativas multirresistentes. Assim, elucidar os mecanismos de resistência é de vital importância para realizar um controle epidemiológico efetivo da disseminação deste tipo de isolado. Objetivos: Caracterizar os principais mecanismos de resistência ao imipenem em 76 isolados clínicos brasileiros de Pseudomonas aeruginosa, recuperados em 2004/2007, de 4 centros hospitalares do Estado de São Paulo. Material e métodos: Foram investigados: i) o perfil de resistência com determinação da CIM do imipenem; ii) a detecção de metalo-betalactamases (MBL) através de métodos fenotípicos e genotípicos; iii) a sensibilidade e especificidade do método de dupla difusão do disco na detecção de MBL; iv) a presença de genes codificadores de metilases 16S RNAr e sua associação com fenótipos aminoglicosídeo resistentes; v) alterações da permeabilidade por perda da porina OprD; vi) a presença ou ausência do gene oprD por PCR; vii) triagem fenotípica para expressão de bombas de efluxo através da determinação da CIM de quinolonas, cefalosporinas e carbapenêmicos na presença/ausência de inibidores específicos, realizando uma análise comparativa com o método de disco combinado; viii) os genes associados às bombas de efluxo mexA e mexE, através de PCR; ix) caracterizar a expressão das bombas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, x) a clonalidade dos isolados por tipagem genotípica, através de ERIC-PCR, avaliando a relação genética (dendrograma) e sua associação com o predomínio de um determinado mecanismo de resistência. Resultados: Dentre os isolados de P. aeruginosa resistentes ao imipenem estudados (n=76, CIM50 e CIM90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectivamente) 82% apresentaram um fenótipo de multirresistência. O principal mecanismo de resistência ao imipenem foi a produção de MBL, detectada em 74% dos isolados, e destes, 62% carregavam o gene blaSPM-1 e 12% carregavam o gene blaVIM-like. O método de dupla difusão do disco identificou a produção de MBL em 61% dos isolados. A combinação CAZ/MAA apresentou maior sensibilidade na detecção de MBL associada à SPM-1 (89%), mostrando uma especificidade de 86%. A presença do gene rmtD foi confirmada em 66% das amostras resistentes aos aminoglicosídeos, sendo que a presença concomitante do gene rmtD e do gene blaSPM-1 foi confirmada em 61% dos isolados. A deleção da porina OprD foi observada em 71% dos isolados. Dentre os isolados MBL positivos, 66% apresentaram ausência desta porina e, dentre as amostras MBL negativas, 85% não apresentaram OprD. Assim, para a resistência ao imipenem foi confirmada a contribuição de dois mecanismos, mediados pela presença de MBL e ausência de porina OprD. Em 13% (10/76) isolados, a deleção da porina OprD esteve associada à presença de seqüências de inserção (SI) em uma região anterior ao gene oprD. Por outro lado, a ausência de amplificação da região 736/1394 do gene oprD, em 11% (9/76) dos isolados, sugeriu a presença de polimorfismos. O gene mexA esteve presente em 92% dos isolados, enquanto que o gene mexE esteve presente em 82% dos isolados. A triagem de bombas de efluxo por disco combinado e análise da CIM na presença de reserpina, CCCP e PAβN, utilizando levofloxacina, meropenem, aztreonam, imipenem ou levofloxacina, não teve correlação com a superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEF-OprN. Ambos os métodos careceram de especificidade e sensibilidade quando comparados ao PCR em tempo real. A superexpressão dos sistemas mexA e mexE foi confirmada em 35% (7/20) isolados MBL negativos, enquanto que 11% (6/56) isolados MBL positivos apresentaram superexpressão do gene mexA ou mexE, sendo que 7% (4/56) isolados MBL positivos superexpressaram ambos os genes. A superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEFOprN como único mecanismo de resistência ao meropenem e imipenem foi confirmada em 10% (2/20) dos isolados MBL negativos. Nos 76 isolados, a tipagem genotípica por ERIC-PCR, identificou a presença de 24 clusters (considerando 90% de similaridade na análise do dendrograma). Conclusão: A convergência de múltiplos mecanismos de resistência em P. aeruginosa parece ser um evento favorável para a seleção de clones endêmicos multirresistentes disseminados na região Sudeste do Brasil. / Introduction: Clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are associated with high mortality rates. Resistance to imipenem is a global concern, since it is a drug of choice for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Thus, research on resistance mechanisms is crucial to carry out an effective program for infection control and epidemiology of imipenem-resistant strains. Objective: to characterize the major mechanisms of imipenem resistance in 76 clinical isolates of P. aeruginosa recovered from clinical samples collected, from 2004 to 2007, in four hospitals in the State of São Paulo, Brazil. Material and methods: Isolates were screened for: i) resistance profile to antibacterial agents, determining the MIC of imipenem; ii) the detection of metallo-beta-lactamase (MBL) by phenotypic and genotypic methods, iii) MBL detection by using a double-disk diffusion test (D-test), determining the sensitivity and specificity of the assay; iv) the presence of genes encoding 16S rRNA methylases and their association with aminoglycoside-resistant phenotypes, v) changes in the bacterial permeability due to porin (OprD) loss; vi) the presence or absence of the oprD gene by using PCR; vii) phenotypic expression of efflux pumps by determining the MIC of quinolones, cephalosporins and carbapenems in the presence/absence of specific inhibitors, performing a comparative analysis with a combined-disk method, viii) genes encoding efflux pumps proteins (mexC and mexX) by PCR; ix) MexAB-OprM and MexEF efflux pumps expression; x) clonal relatedness, by ERIC-PCR genotyping, regarding the predominance of major resistance genotypes. Results: Among imipenem-resistant P. aeruginosa strains (n=76, MIC50 e MIC90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectively) 82% showed a multidrug-resistant phenotype. The main mechanism of imipenem resistance was the MBL production detected in 74% strains, of which 62% harbored the blaSPM-1 gene, and 12% harbored the blaVIM-like gene. The D-test identified MBL production in 61% strains. In this regard, CAZ/MAA was the most sensitive combination for MBL detection associated to SPM-1 enzyme (89%), exhibiting 86% specificity. The presence of the rmtD 16S rRNA methylase gene was confirmed in 66% aminoglycoside-resistant strains. Moreover, presence of both rmtD and blaSPM-1 genes was identified in 61% strains. Loss of OprD porins was observed in 71% strains. In this regard, 66% MBL positive strains and 85% MBL negative strains showed OprD loss. Thus, MBL production and OprD loss contributed to imipenem resistance in P. aeruginosa. Most likely, in 13% (10/76) strains the porin loss was associated to insertion sequences (SI) inserted upstream of the oprD gene. On the other hand, in 11% (9/76) strains the absence of a PCR product targeting the 736/1394 region of the oprD gene, suggested the presence of polymorphisms. The mexA gene was identified in 92% strains, whereas the mexE gene was identified in 82% strains. Results obtained from efflux pump screening by using a combined-disk assay and MIC determination in the presence of reserpine, CCCP e PABN (using levofloxacin, meropenem, aztreonam or imipenem) was not correlated with results obtained from MexAB-OprM and MexEF-OprN overexpression analysis by RT-PCR. In this regard, both combined-disk and MIC assay showed lack of specificity and sensitivity in comparison to RT-PCR. Overexpression of mexA and mexE genes was confirmed in 35% (7/20) MBL-negative and 11% (6/56) MBL-positive strains, respectively, being 7% (4/56) MBL-positive strains overexpressed both genes. The overexpression of MexAB-OprM and MexEF-OprN efflux pumps, as only mechanism of resistance to meropenem and imipenem was observed in 10% (2/20) MBL-negative strains. ERICPCR typing revealed the presence of 24 clusters among 76 imipenem-resistant P. aeruginosa strains (≥ 90% similarity). Conclusion: The convergence of multiple mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa seems to be a favorable event for the selection of multiresistant clones endemic in the southeastern region of Brazil.

O uso imprudente de antibióticos para o tratamento da mastite bovina pode levar ao aumento da resistência bacteriana e ao comprometimento da eficácia dos tratamentos atuais. Desta maneira, novas alternativas para o tratamento da mastite devem ser procuradas. As actinobactérias são capazes de produzir extratos brutos que contêm metabólitos secundários ativos, que inibem o crescimento de outras bactérias. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a concentração inibitória mínima (CIM) de extratos brutos de actinobactérias para isolados de Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae e Streptococcus uberis, provenientes de 23 rebanhos leiteiros. Estes isolados foram identificados pela cultura microbiológica e por espectrometria de massas. Assim, foi realizada uma triagem, pelo bioensaio colorimétrico, de 15 extratos brutos, previamente testados e identificados, provenientes de actinobatérias isoladas de diferentes ambientes e plantas (caatinga, áreas de reflorestamento e do eucalipto) para 10 isolados de cada espécie causadora de mastite. Em seguida, os extratos Caat 1-54 e Caat P5-8 foram selecionados para determinação da CIM, a 50% (CIM50) e a 90% (CIM90). Para determinar a CIM dos extratos brutos, foram utilizados 20 isolados de cada espécie, totalizando 80 isolados. Foi utilizada a análise de sobrevivência para avaliação dos resultados. O extrato Caat 1-54 apresentou os menores valores de CIM50 e CIM90 para S. aureus (0,39 µg/mL e 6,25 µg/mL, respectivamente) e S. chromogenes (CIM50 = CIM90 = 0,78 µg/mL). O ceftiofur apresentou os menores valores de CIM tanto para Strep. dysgalactiae (CIM50 ≤ 0,048 µg/mL; CIM90 = 100 µg/mL), como para Strep. uberis (CIM50 ≤ 0,19 µg/mL; CIM90 = 0,39 µg/mL). Seguido do ceftiofur, o extrato Caat 1-54 foi o que apresentou menores valores CIM, com apenas uma diluição seriada de diferença entre as CIM50 das duas espécies (1,56 e 0,78 µg/mL para Strep. dysgalactiae e Strep. uberis, respectivamente). O extrato Caat P5-8 apresentou os maiores valores de CIM50 e CIM90 para todas as espécies estudadas (CIM ≥ 25 µg/mL). Os resultados obtidos indicam o potencial dos extratos brutos provenientes de actinobactérias para o tratamento da mastite bovina causada por S. aureus, S. chromogenes, Strep. dysgalactiae e Strep. uberis / The reckless use of antibiotics for the treatment of bovine mastitis can increase bacterial resistance and harm the effectiveness of current treatments. Thus, new alternatives for mastitis treatment must be searched. Actinomycetes are capable to produce crude extracts with secondary active metabolites that inhibit the growth of other bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the minimum inhibitory concentration (MIC) of crude extracts obtained from actinomycetes for Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae and Streptococcus uberis isolated from 23 dairy herds. These bacteria were identified by microbiology culture and mass spectrometry. Thus, the colorimetric bioassay was performed. In this screening 15 crude extracts previously tested and identified, obtained from actinomycetes from different Brazilian environments and plants (caatinga, reforestation areas and eucalyptus) were used for 10 isolates of each mastitis pathogens species. Then the Caat 1-54 and Caat P5-8 extracts were selected to the MIC 50% (MIC50) and 90% (MIC90) determination. Twenty mastitis pathogens isolates of each bacteria species were used. Survival analysis was used to evaluate the results. Caat 1-54 extract presented the lowest values of MIC50 e MIC90 for S. aureus (0.39 µg/mL and 6.25 µg/mL, respectively) and S. chromogenes (MIC50 = MIC90 = 0.78 µg/mL). On the other hand, ceftiofur presented the lowest MIC values for both Strep. dysgalactiae (MIC50 ≤ 0.048 µg/mL; MIC90 = 100 µg/mL) and Strep. uberis (MIC50 ≤ 0.19 µg/mL; MIC90 = 0.39 µg/mL). After ceftiofur, Caat 1-54 presented the highest efficiency against Strep. dysgalactiae and Strep. uberis and MIC50 for both species differed by only one serial dilution (1.56 e 0.78 µg/mL for Strep. dysgalactiae and Strep. uberis, respectively). Caat P5-8 extract presented the highest MIC50 and MIC90 values for all pathogens (MIC ≥ 25 µg/mL). Results indicated the potential of crude extracts from actinomycetes to treat bovine mastitis caused by S. aureus, S. schromogenes, Strep. dysgalactiae and Strep. uberis

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franciane Gomig.pdf: 1491620 bytes, checksum: 9e4413251eb0f4e70622124b18ded1a5 (MD5) Previous issue date: 2013-04-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Urinary tract infections show a high incidence in the population, mainly in women, the elderly and pregnant women. The main etiological agent is E. coli, especially in Community infections. Antimicrobial therapy is performed extensively with the Quinolones and resistance emergence is striking and upward. It is known E. coli resistance mechanisms are related with QRDR (Quinolone Resistance Region Determining) mutations in gyrA and parC genes that are the drug targets. These genes encode respectively DNA Girase and Topoisomerase IV subunits responsible for DNA supercoiling and DNA decatenating. Another resistance mechanism that come from plasmids is qnr genes encoding a protein that can protect DNA girase and Topoisomerase IV. Another plasmidial gene is aac(6´)-Ib-cr encoding an aminoglycoside acetyltransferase that can inactivate ciprofloxacin and norfloxacin. This study analyzed 58 E. coli lactose negative samples from urine, in order to draw a profile of resistance in this population from the region of Ponta Grossa and analyze the resistance mechanisms involved. There was a high resistance rate of 48%, among which 79% were resistant to all quinolones tested: nalidixic acid, ciprofloxacin, norfloxacin and ofloxacin. There was also a direct relationship between the biotypes 971 and resistance in contrast to biotype 981 and sensitivity. Therefor Quinolones are not recommended in infection due to E. coli biotype 971. On molecular analysis on the multiresistant samples mutations with aminoacid substitution were found in three positions: the gyrA gene at codons 83 and 87 and in the parC gene at codon 80 in three strains and at codon 84 on a single strain. Mutations only at gyrA gene appeared for a sample resistant just to nalidixic acid. These facts are according to the theory of mutations accumulation causing increased resistance to quinolones. Plasmidial genes qnr and aac(6´)-Ib-cr were not found in these strains. / As infecções do trato urinário mostram uma elevada ocorrência na população, especialmente em mulheres, gestantes e idosos. O principal agente etiológico é a E. coli, principalmente nas infecções de origem comunitária. A terapia com antimicrobianos é realizada extensivamente com Quinolonas e o aparecimento de resistência é marcante e ascendente. Os principais mecanismos de resistência conhecidos em E. coli estão relacionados a mutações nas QRDR (Região Determinante de Resistênbcia a Quinolonas) dos genes gyrA e parC, codificadores de subunidades das enzimas DNA Girase e Topoisomerase IV, respectivamente. Essas enzimas, que são os alvos de ação das Quinolonas, são responsáveis pelo superespiralamento e decatenação do DNA. Os genes plasmidiais que também estão envolvidos nos mecanismos de resistência são os qnr que codificam proteínas protetoras das enzimas alvo e o aac(6´)-Ib-cr, que codifica uma enzima aminoglicosídio acetiltransferase capaz de inativar a ciprofloxacina e norfloxacina. Neste trabalho foram analisadas 58 amostras de E. coli lactose negativas provenientes de urina, a fim de se traçar um perfil de resistência nessa população da região de Ponta Grossa e analisar os mecanismos de resistência envolvidos. Observou-se uma elevada taxa de resistência de 48%, dentre as quais 79% foram resistentes a todas as quinolonas testadas: ácido nalidíxico, ciprofloxacina, norfloxacina e ofloxacina. Pode-se observar também uma relação direta entre os biótipos 971 e uma maior resistência e o biótipo 981 e uma maior sensibilidade, motivo pelo qual não seria recomendável o uso de Quinolonas para o tratamento de infecções causadas por E. coli biótipo 971. Pela análise molecular, para as amostras multirresistentes, foram encontradas mutações com substituição de aminoácido nos genes gyrA nos códons 83 e 87 e no gene parC uma única mutação, sendo essa no códon 80 para três cepas e no códon 84 para uma cepa. Mutações apenas no gene gyrA apareceram para amostras resistentes somente ao ácido nalidíxico. Esses dados estão de acordo com a teoria de que o acúmulo de mutações leva a um aumento da resistência às quinolonas. Os genes plasmidiais qnr e aac(6´)-Ib-cr não foram encontrados.

Introdução: Isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes estão associados a elevadas taxas de mortalidade. A resistência ao imipenem é uma urgência global, uma vez que é considerado o tratamento de escolha para infecções associadas a bactérias Gram negativas multirresistentes. Assim, elucidar os mecanismos de resistência é de vital importância para realizar um controle epidemiológico efetivo da disseminação deste tipo de isolado. Objetivos: Caracterizar os principais mecanismos de resistência ao imipenem em 76 isolados clínicos brasileiros de Pseudomonas aeruginosa, recuperados em 2004/2007, de 4 centros hospitalares do Estado de São Paulo. Material e métodos: Foram investigados: i) o perfil de resistência com determinação da CIM do imipenem; ii) a detecção de metalo-betalactamases (MBL) através de métodos fenotípicos e genotípicos; iii) a sensibilidade e especificidade do método de dupla difusão do disco na detecção de MBL; iv) a presença de genes codificadores de metilases 16S RNAr e sua associação com fenótipos aminoglicosídeo resistentes; v) alterações da permeabilidade por perda da porina OprD; vi) a presença ou ausência do gene oprD por PCR; vii) triagem fenotípica para expressão de bombas de efluxo através da determinação da CIM de quinolonas, cefalosporinas e carbapenêmicos na presença/ausência de inibidores específicos, realizando uma análise comparativa com o método de disco combinado; viii) os genes associados às bombas de efluxo mexA e mexE, através de PCR; ix) caracterizar a expressão das bombas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, x) a clonalidade dos isolados por tipagem genotípica, através de ERIC-PCR, avaliando a relação genética (dendrograma) e sua associação com o predomínio de um determinado mecanismo de resistência. Resultados: Dentre os isolados de P. aeruginosa resistentes ao imipenem estudados (n=76, CIM50 e CIM90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectivamente) 82% apresentaram um fenótipo de multirresistência. O principal mecanismo de resistência ao imipenem foi a produção de MBL, detectada em 74% dos isolados, e destes, 62% carregavam o gene blaSPM-1 e 12% carregavam o gene blaVIM-like. O método de dupla difusão do disco identificou a produção de MBL em 61% dos isolados. A combinação CAZ/MAA apresentou maior sensibilidade na detecção de MBL associada à SPM-1 (89%), mostrando uma especificidade de 86%. A presença do gene rmtD foi confirmada em 66% das amostras resistentes aos aminoglicosídeos, sendo que a presença concomitante do gene rmtD e do gene blaSPM-1 foi confirmada em 61% dos isolados. A deleção da porina OprD foi observada em 71% dos isolados. Dentre os isolados MBL positivos, 66% apresentaram ausência desta porina e, dentre as amostras MBL negativas, 85% não apresentaram OprD. Assim, para a resistência ao imipenem foi confirmada a contribuição de dois mecanismos, mediados pela presença de MBL e ausência de porina OprD. Em 13% (10/76) isolados, a deleção da porina OprD esteve associada à presença de seqüências de inserção (SI) em uma região anterior ao gene oprD. Por outro lado, a ausência de amplificação da região 736/1394 do gene oprD, em 11% (9/76) dos isolados, sugeriu a presença de polimorfismos. O gene mexA esteve presente em 92% dos isolados, enquanto que o gene mexE esteve presente em 82% dos isolados. A triagem de bombas de efluxo por disco combinado e análise da CIM na presença de reserpina, CCCP e PAβN, utilizando levofloxacina, meropenem, aztreonam, imipenem ou levofloxacina, não teve correlação com a superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEF-OprN. Ambos os métodos careceram de especificidade e sensibilidade quando comparados ao PCR em tempo real. A superexpressão dos sistemas mexA e mexE foi confirmada em 35% (7/20) isolados MBL negativos, enquanto que 11% (6/56) isolados MBL positivos apresentaram superexpressão do gene mexA ou mexE, sendo que 7% (4/56) isolados MBL positivos superexpressaram ambos os genes. A superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEFOprN como único mecanismo de resistência ao meropenem e imipenem foi confirmada em 10% (2/20) dos isolados MBL negativos. Nos 76 isolados, a tipagem genotípica por ERIC-PCR, identificou a presença de 24 clusters (considerando 90% de similaridade na análise do dendrograma). Conclusão: A convergência de múltiplos mecanismos de resistência em P. aeruginosa parece ser um evento favorável para a seleção de clones endêmicos multirresistentes disseminados na região Sudeste do Brasil. / Introduction: Clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are associated with high mortality rates. Resistance to imipenem is a global concern, since it is a drug of choice for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Thus, research on resistance mechanisms is crucial to carry out an effective program for infection control and epidemiology of imipenem-resistant strains. Objective: to characterize the major mechanisms of imipenem resistance in 76 clinical isolates of P. aeruginosa recovered from clinical samples collected, from 2004 to 2007, in four hospitals in the State of São Paulo, Brazil. Material and methods: Isolates were screened for: i) resistance profile to antibacterial agents, determining the MIC of imipenem; ii) the detection of metallo-beta-lactamase (MBL) by phenotypic and genotypic methods, iii) MBL detection by using a double-disk diffusion test (D-test), determining the sensitivity and specificity of the assay; iv) the presence of genes encoding 16S rRNA methylases and their association with aminoglycoside-resistant phenotypes, v) changes in the bacterial permeability due to porin (OprD) loss; vi) the presence or absence of the oprD gene by using PCR; vii) phenotypic expression of efflux pumps by determining the MIC of quinolones, cephalosporins and carbapenems in the presence/absence of specific inhibitors, performing a comparative analysis with a combined-disk method, viii) genes encoding efflux pumps proteins (mexC and mexX) by PCR; ix) MexAB-OprM and MexEF efflux pumps expression; x) clonal relatedness, by ERIC-PCR genotyping, regarding the predominance of major resistance genotypes. Results: Among imipenem-resistant P. aeruginosa strains (n=76, MIC50 e MIC90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectively) 82% showed a multidrug-resistant phenotype. The main mechanism of imipenem resistance was the MBL production detected in 74% strains, of which 62% harbored the blaSPM-1 gene, and 12% harbored the blaVIM-like gene. The D-test identified MBL production in 61% strains. In this regard, CAZ/MAA was the most sensitive combination for MBL detection associated to SPM-1 enzyme (89%), exhibiting 86% specificity. The presence of the rmtD 16S rRNA methylase gene was confirmed in 66% aminoglycoside-resistant strains. Moreover, presence of both rmtD and blaSPM-1 genes was identified in 61% strains. Loss of OprD porins was observed in 71% strains. In this regard, 66% MBL positive strains and 85% MBL negative strains showed OprD loss. Thus, MBL production and OprD loss contributed to imipenem resistance in P. aeruginosa. Most likely, in 13% (10/76) strains the porin loss was associated to insertion sequences (SI) inserted upstream of the oprD gene. On the other hand, in 11% (9/76) strains the absence of a PCR product targeting the 736/1394 region of the oprD gene, suggested the presence of polymorphisms. The mexA gene was identified in 92% strains, whereas the mexE gene was identified in 82% strains. Results obtained from efflux pump screening by using a combined-disk assay and MIC determination in the presence of reserpine, CCCP e PABN (using levofloxacin, meropenem, aztreonam or imipenem) was not correlated with results obtained from MexAB-OprM and MexEF-OprN overexpression analysis by RT-PCR. In this regard, both combined-disk and MIC assay showed lack of specificity and sensitivity in comparison to RT-PCR. Overexpression of mexA and mexE genes was confirmed in 35% (7/20) MBL-negative and 11% (6/56) MBL-positive strains, respectively, being 7% (4/56) MBL-positive strains overexpressed both genes. The overexpression of MexAB-OprM and MexEF-OprN efflux pumps, as only mechanism of resistance to meropenem and imipenem was observed in 10% (2/20) MBL-negative strains. ERICPCR typing revealed the presence of 24 clusters among 76 imipenem-resistant P. aeruginosa strains (≥ 90% similarity). Conclusion: The convergence of multiple mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa seems to be a favorable event for the selection of multiresistant clones endemic in the southeastern region of Brazil.

Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.