Salmonella Enteritidis SE86 tem sido a principal responsável por surtos de salmonelose no Rio Grande do Sul, desde 1999. Essa bactéria apresenta várias características que a diferencia de outros sorovares de Salmonella, dentre elas a capacidade de produzir biossurfactante. Porém, a caracterização desse composto e o motivo pelo qual ele é produzido ainda não foram investigados. Assim, esse estudo teve como objetivo caracterizar o biossurfactante produzido por S. Enteriditis SE86 e verificar algumas de suas prováveis funções, como por exemplo, a influência desse composto na aderência e na resistência a desinfetantes, em folhas de alface. A produção de biossurfactante por S. Enteriditis SE86 foi avaliada em caldo infusão cérebro e coração (BHI), em meio mínimo e em folhas de alface. Foram realizados testes para caracterização do composto e S. Enteritidis SE86, com e sem biossurfactante, foi inoculada em folhas de alface, a fim de avaliar a influência do biossurfactante na aderência e resistência da bactéria a diversos métodos de desinfecção de vegetais folhosos. Os resultados demonstraram que o maior índice de emulsificação (IE24: 62,95% após 72 horas) foi produzido em caldo BHI, mas a bactéria também foi capaz de produzir biossurfactante em meio mínimo (IE24: 46% após 46 h) e em contato com as folhas de alface (IE24: 52,15% após 120h). Os testes de caracterização do demonstraram que o biossurfactante é um composto polimérico que apresenta estabilidade em diferentes pH, temperatura e salinidade. O biossurfactante aumentou a aderência de S. Enteritidis SE86 (4,1 LogUFC/cm2 para 7,3 Log UFC/cm2 após 60 minutos) e contribuiu para o aumento da resistência do patógeno na superfície das folhas de alface para todos os sanitizantes testados. / Salmonella Enteritidis SE86 has been recognized for outbreaks of salmonellosis in Rio Grande do Sul-RS since 1999. This bacteria shows several characteristics that differ it from other serovars, as its ability to produce biosurfactant. However, the characterization of this compound and the reason why its produced have not been investigated yet. The present study aimed to characterize the biosurfactant produced by S. Enteritidis SE86 and to check some of their probable functions, as checking the influence of this compound in the adherence and resistance of food pathogen on lettuce leaves. The biosurfactant production by S. Enteritidis SE86 was evaluated in Brain Heart Infusion broth (BHI), in minimal medium and on lettuce leaves. Several tests were taken to characterize the compound produced and S. Enteritidis SE86 with and without biosurfactant, was inoculated on lettuce leaves to evaluate the influence of biosurfactant in adherence and resistance to several bacterial disinfection methods of leafy vegetables. The results showed that the more emulsification index (IE24: 62.95% after 72 hours) was produced in BHI broth, but S.Enteritidis SE86 was also able to produced biosurfactants in minimal medium (IE24: 46% after 46 hours) and on lettuce leaves (IE24: 52.15% after 120 hours). The characterization tests showed that the biosurfactant is a polymeric compound which is stable at different pH, temperature and salinity. The biosurfactant increased adherence of S. Enteritidis SE86 (4.1 LogUFC / cm2 to 7.3 log CFU / cm2 after 60 minutes) and contributed to increasing pathogen resistance on surface of lettuce leaves for all tested sanitizers.

O filo Actinobacteria é um importante grupo de bactérias Gram positivas amplamente distribuídas nos ambientes aquáticos e terrestres, são grandes produtores de compostos biologicamente ativos e, portanto, de grande interesse biotecnológico. O gênero Streptomyces destaca-se como maior produtor destes compostos, sendo responsável por cerca de 70% dos antibióticos que hoje utilizamos. A identificação dos organismos deste gênero ainda é um desafio. Durante muitos anos a identificação foi realizada somente com base em características morfológicas e fisiológicas. Atualmente, com o avanço das técnicas moleculares, há um grande número de espécies relatadas em bancos de dados genômicos. Este trabalho tem por objetivo identificar isolados de actinobactérias presentes no Laboratório de Microbiologia Ambiental ICBS/UFRGS com auxílio das técnicas de BOX-PCR, amplamente utilizado em estudos de diversidade dentro deste filo, e URP-PCR. E, além disso, realizar purificação parcial de um composto antimicrobiano efetivo contra bactérias produzido pelo isolado Streptomyces 8S. Os primers URP e BOX1AR produziram distintos padrões de amplificação nos isolados estudados, porém não foi possível investigar as relações de similaridade entre eles. Ainda o sequenciamento da região 16S rDNA não foi eficiente para identificar as espécies. Para a purificação do composto antimicrobiano foi realizada extração líquido-líquido com o solvente acetato de etila, posteriormente cromatografia de gel-filtração (Sephadex G-75) e troca iônica (SP-Sepharose e DEAE-celulose). A atividade antimicrobiana do composto foi recuperada após cada etapa. O composto manteve-se ativo após os ensaios de estabilidade frente à adição de EDTA, enzimas proteolíticas e altas temperaturas. Isto sugere que o composto antimicrobiano não é de origem protéica. Este trabalho sugere novos estudos a partir dos resultados preliminares obtidos, como a amplificação de todo o fragmento 16S rDNA dos isolados de actinobactérias e a investigação do composto antimicrobiano através de cromatografias de alta resolução. / The Actinobacteria phylum is an important group of Gram positive bacteria widely distributed in terrestrial and aquatic environments. They are major producers of biologically active compounds and therefore of great biotechnological interest. The genus Streptomyces stands out as the largest producer of these compounds, accounting for about 70% of the antibiotics that we use today. The identification of these organisms is still a challenge. For many years the identification was carried out only based on morphological and physiology characteristics. Today, with the advance of molecular techniques, there are a large number of species reported in genomics database. This work aims to identify isolates of actinobacterias present in the Laboratório de Microbiologia Ambiental ICBS / UFRGS with the help of BOX-PCR techniques, widely used in diversity studies within this phylum, and URP-PCR. And besides that, performing partial purification of an antimicrobial compound effective against bacteria produced by Streptomyces 8S isolated. The URP and BOX1AR primers produced different amplification patterns in the isolates, but it was not possible to investigate the relationship of similarity between them. Also the sequencing of 16S rDNA was not efficient to identify the species. To purify the antimicrobial compound was carried out liquid-liquid extraction with the solvent ethyl acetate, subsequently chromatography: gel-filtration (Sephadex G-75) and ion exchange (SP-Sepharose and DEAE-cellulose). The antimicrobial in question did not adhere to the SP-Sepharose column, showing that it has negative charge. The antimicrobial activity of the compound was recovered after each step. The compound remained active after the stability tests like the addition of EDTA, proteolytic enzymes and high temperatures. This suggests that the antimicrobial compound is not a protein. This work suggests further studies based on the obtained preliminary results such as the amplification of the entire 16S rDNA of actinobacterias isolated fragment and the investigation of the antimicrobial compound using high resolution chromatography.

Salmonella Enteritidis SE86 tem sido a principal responsável por surtos de salmonelose no Rio Grande do Sul, desde 1999. Essa bactéria apresenta várias características que a diferencia de outros sorovares de Salmonella, dentre elas a capacidade de produzir biossurfactante. Porém, a caracterização desse composto e o motivo pelo qual ele é produzido ainda não foram investigados. Assim, esse estudo teve como objetivo caracterizar o biossurfactante produzido por S. Enteriditis SE86 e verificar algumas de suas prováveis funções, como por exemplo, a influência desse composto na aderência e na resistência a desinfetantes, em folhas de alface. A produção de biossurfactante por S. Enteriditis SE86 foi avaliada em caldo infusão cérebro e coração (BHI), em meio mínimo e em folhas de alface. Foram realizados testes para caracterização do composto e S. Enteritidis SE86, com e sem biossurfactante, foi inoculada em folhas de alface, a fim de avaliar a influência do biossurfactante na aderência e resistência da bactéria a diversos métodos de desinfecção de vegetais folhosos. Os resultados demonstraram que o maior índice de emulsificação (IE24: 62,95% após 72 horas) foi produzido em caldo BHI, mas a bactéria também foi capaz de produzir biossurfactante em meio mínimo (IE24: 46% após 46 h) e em contato com as folhas de alface (IE24: 52,15% após 120h). Os testes de caracterização do demonstraram que o biossurfactante é um composto polimérico que apresenta estabilidade em diferentes pH, temperatura e salinidade. O biossurfactante aumentou a aderência de S. Enteritidis SE86 (4,1 LogUFC/cm2 para 7,3 Log UFC/cm2 após 60 minutos) e contribuiu para o aumento da resistência do patógeno na superfície das folhas de alface para todos os sanitizantes testados. / Salmonella Enteritidis SE86 has been recognized for outbreaks of salmonellosis in Rio Grande do Sul-RS since 1999. This bacteria shows several characteristics that differ it from other serovars, as its ability to produce biosurfactant. However, the characterization of this compound and the reason why its produced have not been investigated yet. The present study aimed to characterize the biosurfactant produced by S. Enteritidis SE86 and to check some of their probable functions, as checking the influence of this compound in the adherence and resistance of food pathogen on lettuce leaves. The biosurfactant production by S. Enteritidis SE86 was evaluated in Brain Heart Infusion broth (BHI), in minimal medium and on lettuce leaves. Several tests were taken to characterize the compound produced and S. Enteritidis SE86 with and without biosurfactant, was inoculated on lettuce leaves to evaluate the influence of biosurfactant in adherence and resistance to several bacterial disinfection methods of leafy vegetables. The results showed that the more emulsification index (IE24: 62.95% after 72 hours) was produced in BHI broth, but S.Enteritidis SE86 was also able to produced biosurfactants in minimal medium (IE24: 46% after 46 hours) and on lettuce leaves (IE24: 52.15% after 120 hours). The characterization tests showed that the biosurfactant is a polymeric compound which is stable at different pH, temperature and salinity. The biosurfactant increased adherence of S. Enteritidis SE86 (4.1 LogUFC / cm2 to 7.3 log CFU / cm2 after 60 minutes) and contributed to increasing pathogen resistance on surface of lettuce leaves for all tested sanitizers.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Poco tiempo después de la introducción de un antimicrobiano al mercado ha sido posible encontrar bacterias que se muestran resistentes a su acción. Esta resistencia es de tipo natural en algunas bacterias, mientras que en otras es una condición adquirida mediante la incorporación de genes que codifican diversos mecanismos de resistencia. Estas cepas resistentes representan un gran problema en hospitales humanos al ocasionar infecciones nosocomiales, ya que las opciones terapéuticas se ven limitadas. En medicina veterinaria, aunque las infecciones nosocomiales están en aumento, siguen siendo menos estudiadas que las adquiridas por personas. Sin embargo, estas infecciones –tanto en pacientes humanos como veterinarios– tienen en común ser ocasionadas, principalmente, por estafilococos resistentes a meticilina. Por este hecho, sumado a que Staphylococcus aureus meticilino resistente se transmite entre diferentes especies animales, incluyendo al hombre, es que el propósito de esta Memoria de Título fue el de detectar el gen de resistencia mecA en bacterias descritas como nosocomiales. Para ello, se utilizaron tres cepas bacterianas ambientales aisladas de Hospitales Veterinarios de la Universidad de Chile y que mostraron resistencia a oxacilina: Staphylococcus kloosii, Micrococcus sedentarius y Enterococcus faecium. Luego de realizada la extracción del ADN, la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa y la electroforesis correspondientes, se obtuvieron bandas fluorescentes de aproximadamente 500 pb. Estos amplicones se enviaron a secuenciar y las secuencias obtenidas se compararon con las descritas en el GenBank® para el gen mecA. Los porcentajes de identidad nucleotídica de 97%, 97% y 98% respectivamente, permiten confirmar la presencia de cepas que poseen el gen mecA y sugiere su pronta incorporación como cepas controles positivos en futuras investigaciones

Na doença periodontal associada à placa dentobacteriana, produtos bacterianos difundem-se através dos tecidos periodontais, induzindo mecanismos de defesa não específicos e específicos, com síntese de vários mediadores pró-inflamatórios, incluindo o óxido nítrico (NO). A enzima responsável pela produção de NO, a NO sintase (NOS), foi identificada em vários tipos celulares e possui ação direta sobre o metabolismo ósseo, bem como sobre fenômenos destrutivos teciduais e imunopatológicos. Com o objetivo de analisar a presença de NO na doença periodontal, realizamos um estudo quantitativo geral e proporcional com análise estatística de células iNOS positivas em amostras de tecidos gengivais clinicamente saudáveis, gengivites associadas à placa dentobacteriana e periodontites crônicas localizadas, através da técnica imuno -histoquímica. Significante aumento do número de células iNOS positivas por mm2 foi observado em amostras de gengivites e periodontites, comparadas ao grupo controle. Em todos os grupos, a maioria das células iNOS positivas eram mononucleares apresentado fraca a moderada imunorreatividade. Por outro lado, as células polimorfonucleares iNOS positivas demonstraram intensa imunomarcação, independente do estágio da doença, e apenas a porcentagem de células polimorfonucleares iNOS positivas apresentaram significante aumento comparada àquela do grupo controle. Nossos resultados indicam que, nos tecidos periodontais, o NO aumenta na presença de doença inflamatória. Neste contexto, o NO pode estar associado com a regulação da destruição tecidual e reabsorção óssea ou ainda com fenômenos imunopatológicos. Nossos resultados indicam também uma via adicional de ativação nas células inflamatórias na doença periodontal, em especial os polimorfonucleares neutrófilos, que expressam iNOS significativamente, provavelmente representando uma importante origem de óxido nítrico nesta doença. / In periodontal disease, bacterial products of the subgingival plaque diffuse through the periodontal tissue, inducing non-specific and specific defense mechanisms, with the consequent synthesis of various pro-inflammatory mediators, including nitric oxide (NO). The enzyme responsible for NO production, the NO synthase (NOS), has been identified in several cell types and the NO has a direct action on osseous metabolism and may also take on the tissue destruction and in immunopathological phenomena. In order to further characterize the presence of NO in human periodontal disease, we undertook a general and proportional quantitative study with statystical analysis of iNOS positive cells in sam ples of clinically healthy gingival tissues, plaque-induced gingivitis and localizated chronic periodontitis using immunohistochemistry. A significant increase in the number of iNOS+ cells per mm2 was found in the samples of the gingivitis and periodontitis compared to those of the control. In all groups almost all of the iNOS+ cells were mononuclear demonstrating weak to moderate immunoreactivity. Conversely, polymorphonuclear cells showed intense immunoreactivity for iNOS independent of the disease stage, and only the percentage of iNOS+ polymorphonuclear cells in the inflammatory infiltrate demonstrated a significant increase when compared with the control. Taken together, our results indicate that NO augments in the presence of periodontal disease, which may be associated with the regulation of tissue destruction, bone resorption and immunopathological phenomena. In addition, our findings also suggest that the inflammatory cells present an additional activation pathway on inflammatory cells in the periodo ntal disease, specially of the polymorphonuclear cells, that it express significant iNOS and probably represent an important source of nitric oxide in human periodontal disease.

O controle mecânico da placa dentária realizado por meio da profilaxia profissional é uma medi da eficaz na prevenção da cárie . No entanto, há a hipótese de que a ação mecânica dos métodos utilizados para executar a profilaxia po ssa provocar desgaste do esmalte, principalmente se este apresentar lesão de mancha branca por desmineralização . Desta forma este estudo objetivou avaliar in vitro o desgaste resultante de dois diferentes métodos de profilaxia (jato de bicarbonato de sódio e escova de Robinson com pedra pomes) sobre o esmalte b ovino hígido e desmineralizado. Foram utilizados 60 fragmentos de esmalte bovino (4mm X 4mm), divididos em 4 grupos: G I- 15 blocos de esmalte hígido tratados com escova de Robinson e pedra pomes , G II- 15 blocos de esmalte hígido tratados com jato de bicarbonato de sódio , G III- 15 blocos de esmalte desmineralizado tratados com escova de Robinson e pedra pomes , G IV- 15 blocos de esmalte desmineralizado tratados com jato de bicarbonato de sódio . Os fragmentos foram obtidos utilizando -se uma máquina de cort e Labcut e posteriormente suas superfícies foram planificadas e polidas para padronização. Em seguida nos grupos III e IV foram simuladas lesões artificiais de cárie in vitro através da imersão dos blocos de esmalte em solução de ácido acético 0,05M, 50% saturada com esmalte bovino triturado, a 37 oC por 16 horas. Para confirmação da efetividade deste teste, foram realizados ensaios de microdureza, observando -se uma média de dureza inicial de 394 KHN e final de 241 KHN. Feito isso, todos os espécimes foram submetidos aos tratamentos profiláticos, inseridos em uma base de aço inoxidável, de tal forma que apenas uma circunferência de 1mm fosse exposta ao tratamento. Foram feitas análises quantitativas e qualitativas do desgaste, sendo que para a primeira foi ut ilizado o Rugosímetro Hommel Tester T 1000 e para a segunda a microscopia eletrônica de varredura. Encontraram -se os seguintes resultados de desgaste: 0,91µm -G I, 0,42µm-G II, 1,6µm-G III e 0,94µm-G IV. Através do teste ANOVA a dois critérios (p<0,05) dete ctou-se diferença significativa entre os grupos. Desta forma, o estudo indicou que o esmalte desmineralizado desgastou mais do que o esmalte hígido, independentemente do tipo de profilaxia realizada e a escova de Ronbinson, por sua vez, foi responsável por um maior desgaste quando comparada ao jato de bicarbonato de sódio, tanto nos fragmentos de esmalte desmineralizado quanto nos hígidos. / The mechanical control of plaque done by means of professional prophylaxis is an effective way to prevent dental caries. However, there is the hypothesis that the mechanical action of prophylaxis methods may cause enamel wearing, especially when a white spot lesion is present. With the objective of evaluating this wearing in vitro, a study was conducted with two different prophylaxis methods (air -powder polishing system and nylon brushes with pumice paste) on normal and demineralized bovine enamel. Sixty fragments of bovine enamel (4mm X 4mm) were used, divided in 4 groups: G I, with 15 normal bovine enamel blocks treated with nylon brushes with pumice paste; G II, with 15 normal bovine enamel blocks, treat ed with air -powder polishing; G III- 15 demineralized bovine enamel blocks treated with nylon brushes with pumice paste , G IV- 15 demineralized bovine enamel blocks treated with air -powder polishing . To standardize the samples, the fragments were cut with a Labcut machine, and their surfaces made plan and polished. Artificial caries were simulated on groups III and IV by 16 hours immersion, at 37oC, of enamel fragments in a in 5,0 pH solution of 0,05M acetate - buffer, 50% saturated with bovine en amel powder . Microhardness tests were used to confirm the solution effect on enamel, and 394 KHN and 241 KHN were observed for initial and final mean values, respectively. After that, all specimens were submitted to the prophylactic treatment, using a stainless steel base that permitted only 1mm circumference of each fragment to be exposed to treatment. Rugosimeter Hommel Tester T1000 and scanning electron microscopy were respectively used to measure and illustrate the wear. The following wear results were found: 0,91 µm-G I; 0,42µm-G II; 1,6µm-G III; and 0,94µm-G IV. Marked differences were noted between the groups when the two criteria ANOVA (p<0,05) test was used. The findings of this study indicated that the loss of surface was more pronounced on demineralized enam el as compared to that on normal enamel, independently of the prophylaxis method employed. The findings also indicated that on both, demineralized and normal enamel, the nylon brushes with pumice paste presented higher wear when compared to the air -powder polishing system.

Resumo: Nas bactérias Gram-positivas Streptomyces davawensis e Streptomyces coelicolor a transcrição dos genes responsáveis pela biossíntese de riboflavina (RF; vitamin B2) ribBMAH é iniciada a partir do promoter da riboflavina (Prib). Nas duas espécies um ribB FMN riboswitch está presente imediatamente à montante em relação a Prib, regulando a expressão gênica ao nível traducional. S. davawensis produz o atibiótico roseoflavina (RoF), um análogo de riboflavina, o qual é convertido a roseoflavina 5'-mononucleotídeo (RoFMN) no citoplasma das células alvo. S. davawensis é resistente a RoF, enquanto que S. coelicolor é sensível a RoF. Através de experimentos de transcrição/tradução in vitro foi demonstrado que o ribB FMN riboswitch de S. coelicolor é desligado na presença de RoFMN. Em contraste, o ribB FMN riboswitch de S. davawensis mostrou-se mais ativo na presença de RoFMN. Compatível com esse resultado, a atividade enzimática correspondente ao produto do primeiro gene (ribB) do cluster ribBMAH foi fortemente reduzida em S. coelicolor, mas não em S. davawensis, quando ambas foram cultivadas em meio acrescido de RoF. Através de mutagênese sítio-dirigida foi identificado um único nucleotideo (A61) na estrutura do ribB FMN riboswitch de S. davawensis como sendo responsável pela resposta diferencial a RoFMN. A introdução do ribB FMN riboswitch de S. davawensis em S. coelicolor gerou uma linhagem resistente a RoF. O presente trabalho apresenta evidências de que o ribB FMN riboswitch de S. coelicolor é controlado termodinamicamente, enquanto que o ribB FMN riboswitch de S. davawensis é controlado cineticamente. Os últimos resultados muito provavelmente explicam as diferentes respostas com relação a RoFMN observada para os dois ribB FMN riboswitches quase idênticos. Em resumo, os... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the Gram-positive soil bacterium Streptomyces davawensis and in the closely related Streptomyces coelicolor transcription of the riboflavin (RF; vitamin B2) biosynthetic genes ribBMAH originates from the riboflavin promoter (Prib). In both species a ribB (ribo)flavin mononucleotide (FMN) binding riboswitch is present immediately downstream of Prib regulating gene expression at the translational level. S. davawensis produces the antibiotic roseoflavin (RoF), a RF analog, which is converted to roseoflavin mononucleotide (RoFMN) within the cytoplasm of target cells. S. davawensis is RoF resistant, whereas S. coelicolor is RoF sensitive. In vitro transcription/translation experiments revealed that the S. coelicolor ribB FMN riboswitch was turned off in the presence of RoFMN. In contrast, the S. davawensis ribB FMN riboswitch was found to be more active in the presence of RoFMN. In line with this finding was that the activity of the product of the first gene (ribB) of the ribBMAH cluster was strongly reduced in S. coelicolor, but not in S. davawensis, when cells were grown in the presence of RoF. Sequence alignments and site directed mutagenesis experiments identified a single nucleotide (A61) within the S. davawensis ribB FMN riboswitch which is responsible for its specific response to RoFMN. Introduction of the S. davawensis ribB FMN riboswitch to S. coelicolor produced a RoF resistant S. coelicolor strain. The present work gives evidence that the ribB FMN riboswitch of S. coelicolor is thermodynamically controlled whereas the S. davawensis ribB FMN riboswitch is kinetically controlled. The latter finding most likely explains the different response of the two almost identical ribB FMN riboswitches with respect to RoFMN. Altogether, the present results show that a highly specialized FMN riboswitch confers RoF resistance to... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Eleonora Cano Carmona / Coorientador: Matthias Mack / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Maria Celia Bertolini / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Doutor

Na doença periodontal associada à placa dentobacteriana, produtos bacterianos difundem-se através dos tecidos periodontais, induzindo mecanismos de defesa não específicos e específicos, com síntese de vários mediadores pró-inflamatórios, incluindo o óxido nítrico (NO). A enzima responsável pela produção de NO, a NO sintase (NOS), foi identificada em vários tipos celulares e possui ação direta sobre o metabolismo ósseo, bem como sobre fenômenos destrutivos teciduais e imunopatológicos. Com o objetivo de analisar a presença de NO na doença periodontal, realizamos um estudo quantitativo geral e proporcional com análise estatística de células iNOS positivas em amostras de tecidos gengivais clinicamente saudáveis, gengivites associadas à placa dentobacteriana e periodontites crônicas localizadas, através da técnica imuno -histoquímica. Significante aumento do número de células iNOS positivas por mm2 foi observado em amostras de gengivites e periodontites, comparadas ao grupo controle. Em todos os grupos, a maioria das células iNOS positivas eram mononucleares apresentado fraca a moderada imunorreatividade. Por outro lado, as células polimorfonucleares iNOS positivas demonstraram intensa imunomarcação, independente do estágio da doença, e apenas a porcentagem de células polimorfonucleares iNOS positivas apresentaram significante aumento comparada àquela do grupo controle. Nossos resultados indicam que, nos tecidos periodontais, o NO aumenta na presença de doença inflamatória. Neste contexto, o NO pode estar associado com a regulação da destruição tecidual e reabsorção óssea ou ainda com fenômenos imunopatológicos. Nossos resultados indicam também uma via adicional de ativação nas células inflamatórias na doença periodontal, em especial os polimorfonucleares neutrófilos, que expressam iNOS significativamente, provavelmente representando uma importante origem de óxido nítrico nesta doença. / In periodontal disease, bacterial products of the subgingival plaque diffuse through the periodontal tissue, inducing non-specific and specific defense mechanisms, with the consequent synthesis of various pro-inflammatory mediators, including nitric oxide (NO). The enzyme responsible for NO production, the NO synthase (NOS), has been identified in several cell types and the NO has a direct action on osseous metabolism and may also take on the tissue destruction and in immunopathological phenomena. In order to further characterize the presence of NO in human periodontal disease, we undertook a general and proportional quantitative study with statystical analysis of iNOS positive cells in sam ples of clinically healthy gingival tissues, plaque-induced gingivitis and localizated chronic periodontitis using immunohistochemistry. A significant increase in the number of iNOS+ cells per mm2 was found in the samples of the gingivitis and periodontitis compared to those of the control. In all groups almost all of the iNOS+ cells were mononuclear demonstrating weak to moderate immunoreactivity. Conversely, polymorphonuclear cells showed intense immunoreactivity for iNOS independent of the disease stage, and only the percentage of iNOS+ polymorphonuclear cells in the inflammatory infiltrate demonstrated a significant increase when compared with the control. Taken together, our results indicate that NO augments in the presence of periodontal disease, which may be associated with the regulation of tissue destruction, bone resorption and immunopathological phenomena. In addition, our findings also suggest that the inflammatory cells present an additional activation pathway on inflammatory cells in the periodo ntal disease, specially of the polymorphonuclear cells, that it express significant iNOS and probably represent an important source of nitric oxide in human periodontal disease.

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. 2006. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Instituto de Engenharia Biomédica, Faculdade de Medicina. Universidade do Porto

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / En las últimas dos décadas, la especie bacteriana Klebsiella pneumoniae se ha convertido en uno de los principales focos de atención de las autoridades mundiales de salud, debido principalmente a la rápida aparición de cepas hipervirulentas y multiresistentes. La aparición de estas cepas estaría relacionada con el gran dinamismo del genoma de K. pneumoniae, promovido por una alta frecuencia de adquisición y pérdida de elementos genéticos móviles, entre los cuales las Islas Genómicas (GIs) jugarían un rol fundamental. Las GIs son segmentos de DNA que presentan un contenido GC distinto al del resto del cromosoma, y que pueden escindirse o integrarse en distintas posiciones de éste, normalmente en genes que codifican RNAs de transferencia (tDNAs). No obstante la importancia propuesta de las GIs en la evolución de K. pneumoniae, hasta ahora el número de GIs conocidas en esta especie es bajo, y poco se conoce respecto al uso de los tDNAs como sitios de integración de estos elementos en ésta y otras especies bacterianas. En este trabajo se caracterizó el set completo de tDNAs presentes en el cromosoma de 50 cepas de K. pneumoniae, identificando las GIs insertadas en dichos loci. Así, se identificaron y anotaron 97 clases de GIs, las que codifican sobre un 50% de proteínas con función desconocida. Además, se observó que solo un grupo reducido de tDNAs son ocupados como sitios de integración de GIs en esta especie, proponiendo y sometiendo a prueba posibles mecanismos o patrones que podrían explicar en parte este sesgo. Los resultados muestran que la dinámica de integración de GIs en K. pneumoniae es un área de investigación poco explorada, y que la evaluación del rol de las GIs en la hipervirulencia y resistencia a antibióticos de K. pneumoniae requerirá caracterizar una gran cantidad de proteínas codificadas en las mismas, cuya función se desconoce. / In the last two decades, the bacterial species Klebsiella pneumoniae has attracted the attention of global health authorities, mainly due to the dissemination of hypervirulent and multi-resistant strains, which are responsible for more severe infections and are more difficult to treat with the available antibiotics. The rapid development of these strains would be explained by the high dynamism of the K. pneumoniae genome, promoted by a high frequency of gain and loss of mobile genetic elements. Among them, genomic islands (GIs) were proposed to play a major role. GIs are DNA segments harboring a GC content that differs from the average for the host chromosome, and that can excise from and integrate into different locations, mainly into genes encoding transfer RNAs (tDNAs). In spite of the proposed role of GIs in K. pneumoniae evolution, a small number of these elements have been described in this species. Moreover, little is known regarding the usage of tDNAs as integration sites for these elements in bacteria. In this work we characterized the whole set of tDNAs typically present in the K. pneumoniae chromosome, searching for GIs integrated at each of them among 50 K. pneumoniae strains. This way, we identified a total of 97 classes of GIs, where more than 50% of the encoded genes have no predicted function. Additionally, we observed that only a small subset of tDNAs are used as integration sites for GIs in this species, and tested possible hypotheses explaining, at least partially, this bias in the selection of the integration site. Our results indicate that the dynamics of GIs integration in bacteria is an underexplored field, and that evaluating the impact of GIs over K. pneumoniae virulence and drug resistance will require efforts directed to address the functions of a high number of proteins encoded in their GIs.