Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-25T15:38:09Z No. of bitstreams: 1 2015_ClaraWandenkolckSilvaAragao.pdf: 3436680 bytes, checksum: 3d0c8dc4a9c57be55b904c8f703085ac (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-25T20:56:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ClaraWandenkolckSilvaAragao.pdf: 3436680 bytes, checksum: 3d0c8dc4a9c57be55b904c8f703085ac (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-25T20:56:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ClaraWandenkolckSilvaAragao.pdf: 3436680 bytes, checksum: 3d0c8dc4a9c57be55b904c8f703085ac (MD5) / Lonomia obliqua (Lepidoptera: Saturniidae) é uma lagarta venenosa de importância médica devido a severidade de acidentes causados no Brasil pelo contato dessas lagartas com humanos. Patógenos naturais foram isolados dessa lagarta, como o baculovírus Lonomia oblique multiple nucleopolyhedrovirus – LoobMNPV. Nesse contexto, esse trabalho envolve o sequenciamento, a montagem, a análise da composição genômica e do contexto evolutivo de LoobMNPV. Esse genoma possui 120,023 pb, 134 ORFs, 12 ORFs únicas, 7 regiões homólogas (hrs) e conteúdo G+C de 35,7%. Baseado em análises que incluem os genes conservados de baculovírus (core genes) de 72 espécies únicas de baculovírus sequenciados, LoobMNPV localiza-se filogeneticamente no grupo I de Alphabaculovirus, pertencente a um clado irmão aos genomas similares a AcMNPV, apresentado também inversões e rearranjos genômicos em relação a esse clado. Uma das ORFs únicas (LoobNPVOrf-35) apresentou similaridade (E-value de 3e10-11) significativa a um Fator de Terminação de Transcrição (Transcription terminator factor -TTF2) oriundo do lepidóptero Danaus plexippus (GenBank: EHJ68439.1). Por outro lado, ao restringir essa busca aos baculovírus, essa ORF também apresentou similaridade (E-value de 1e10-6) ao Global Transactivator (GTA) de Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus (Genbank:YP_611073.1). Esses resultados indicam duas hipóteses para a possível origem dessa ORF em LoobMNPV: esse gene pode ter sido adquirido independentemente por transferência horizontal de genes, ou é uma variação divergente do gene GTA. Esse genoma também apresentou a ausência dos genes da catepsina e quitinase, que por sua vez estão envolvidos na liquefação do hospedeiro ao final da infecção, propiciando a dispersão dos corpos de oclusão do baculovírus no ambiente. Essa ausência pode estar relacionada ao hábito gregário observado em Lonomia obliqua. / Lonomia obliqua (Lepidoptera: Saturniidae) is a poisonous larvae of medical importance due to the severity of accidents caused by the contact of these larvae with humans occurred in Brazil. Natural pathogens were isolated from these larvae, such as the baculovirus Lonomia oblique multiple nucleopolyhedrovirus – LoobMNPV. In this work, we have sequenced the genome of the baculovirus LoobMNPV and analyzed its genomic composition and evolutionary history. The genome is 120.023 bp long, comprising 135 putative ORFs, 12 unique ORFs, 7 homologous regions (hrs), and 35, 7% G+C content. Furthermore, in an evolutionary context, based on analysis that include the core genes from 72 unique species of sequenced baculovirus, LoobMNPV is located among Alphabaculovirus group I, as a sister-clade of the AcMNPV-like genomes, also presenting genomic inversions and rearrangements when compared to this clade. Interestingly, one unique ORF (LoobNPVOrf-35) showed significant similarity (E-value equals to 3e10-11) to a eukaryotic Transcription Terminator Factor (TTF2) from the lepidoptera Danaus plexippus (GenBank: EHJ68439.1). On the other hand, when restricting this search only to baculoviruses, this ORF also demonstrated similarity (E-value of 1e10-6) to the Global Transactivator (GTA) gene from Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus (Genbank: YP_611073.1). These results indicated two hypothesis: this gene may have been independently acquired from the host through horizontal transfer, or it is a divergent variation of the GTA. This genome also lacks the cathepsin and chitinase genes that are involved in the host liquefaction at the end of the infection, benefiting the spread of the baculovirus occlusion bodies in the environment. This absence may be due to the gregarious habits observed in Lonomia obliqua.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-10-06T18:17:33Z No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-20T14:08:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-20T14:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) Previous issue date: 2008 / Avanços nas técnicas de cultura de células têm possibilitado o isolamento e precisa caracterização de baculovírus mutantes. A maioria desses mutantes é derivada do vírus AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus), principalmente pela sua facilidade de propagação e estabilidade em cultura de células. Durante a rotina de purificação de um baculovírus recombinante, dois vírus mutantes derivados de AcMNPV, o vSynlitx1B12P (MutPolh) e o vSynlitx1G4 (MutApo) foram isolados (dados não publicados). A infecção pelo MutPolh não resultava na produção de poliedros e diferia da infecção tipo selvagem pela presença de massas protéicas dispersas no citoplasma. Para explicar esse fenótipo, o vírus MutPolh foi previamente investigado e análises moleculares revelaram uma mutação pontual no gene da poliedrina. Esse gene é altamente conservado entre os baculovírus e mudanças em sua seqüência nucleotídica podem levar à formação de poliedros mutantes, morfologicamente distintos do tipo-selvagem. O outro vírus mutante, o MutApo, mostrou induzir rápida e massiva morte nas células por ele infectadas. Esse mutante também foi investigado através de técnicas moleculares e foi encontrada uma inserção de DNA interrompendo um gene inibidor de apoptose (p35). Neste trabalho analisaram-se os efeitos citopatológicos desses dois mutantes em células de inseto das linhagens Sf-21 e Tn-5B. Estudos estruturais e ultraestruturais confirmaram os resultados das análises moleculares prévias feitas para esses mutantes. As observações ultra-estruturais feitas em células infectadas pelo MutPolh submetidas a imunomarcação mostraram que os agregados protéicos encontrados no citoplasma dessas células eram, de fato, acúmulo de poliedrina não cristalizada. Ainda, o mutante MutApo mostrou induzir eventos característicos da apoptose nas células dessas linhagens. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Advances in cell culture techniques allowed the isolation and precise characterization of baculoviruses mutants. The majority of these mutants is derived from the virus AcMNPV, mainly due to its facility of propagation and stability in cell culture. During the purification routine of a recombinant baculovirus, two mutants derived from AcMNPV, vSynlitx1B12P (MutPolh) and vSynlitx1G4 (MutApo) were isolated (unpublished). The insect cell by the MutPolh did not result in polyhedra production and differed from wild-type infection by the presence of proteinaceous masses dispersed in the cytoplasm. To explain this phenotype, the virus MutPolh was previously investigated and molecular analysis revealed a point mutation in the polyhedrin gene. This gene is highly conserved among baculoviruses and changes in its nucleotide sequence may lead to mutant polyhedra, morphologically different from the wild-type. The other mutant virus, MutApo, was show to induce quick and massive cell death in infected cells. This mutant was also investigated and was found a DNA insertion interrupting an inhibitor of apoptosis gene (p35). In this work, the cytopathologic effects induced by these two mutants in Sf-21 and Tn-5B insect cell lines were analyzed. Structural and ultrastructural studies confirmed the findings of the molecular analysis previously done for these mutants. The observation of MutPolh-infected cells revealed that the proteinaceous aggregates found in the cytoplasm were, actually, accumulation of uncrystalized polyhedrin. Observations of cells infected by the MutApo mutant also confirmed previous information, showing that this mutant induces characteristic apoptosis events in these insect cell lines.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-29T14:06:39Z No. of bitstreams: 1 2015_MiguelSouzaAndrade.pdf: 4324801 bytes, checksum: 097b6845a2ae33f89b2fdc7d21c346a8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T12:51:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MiguelSouzaAndrade.pdf: 4324801 bytes, checksum: 097b6845a2ae33f89b2fdc7d21c346a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T12:51:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MiguelSouzaAndrade.pdf: 4324801 bytes, checksum: 097b6845a2ae33f89b2fdc7d21c346a8 (MD5) / Os baculovirus são um grupo de vírus de inseto com genoma grande de DNA fita dupla, cuja infecção primária é desencadeada por um vírion envelopado denominado vírus derivado da oclusão (do inglês: occlusion derived virus - ODV) embebido em um corpo de oclusão (do inglês, occclusion body- OB) formado por uma matriz proteica cristalina. Cada vírion pode conter um (SNPV) ou mais nucleocapsídeos (MNPV) por envelope, dependendo da espécie viral. A base genética deste fenótipo não foi identificada e há correlação deste fenótipo com a filogenia de baculovirus não foi estabelecida. Contudo, alguns baculovirus intimamente relacionados, como o BmNPV, BomaNPV-S2 e AcMNPV possuem fenótipos discordantes e podem ajudar a identificar possíveis genes responsáveis pelo múltiplo envelopamento. Portanto, nós comparamos os genomas desses vírus e identificamos um único gene presente em BomaNPV e AcMNPV e ausente em BmNPV. Esse gene é a diferença mais significativa entre esses genomas. Para avaliar se esse gene estava relacionado com o fenótipo MNPV nós construímos três baculovirus recombinantes: vAc-polh-p94-del (p94 deletado), vAc-polh-p94-ha-rep (p94 reparado com uma tag -HA) e vAc-polh (controle). Nós mostramos que a P94 é detectada a 6 h.p.i no citoplasma de células infectadas com acumulação máxima a 24 h.p.i.. A deleção completa do gene p94 no genoma do AcMNPV causou um retardo na replicação do DNA, na produção de BV, na expressão de IE1 e, a produção de OBs é diminuída. Entretanto, o fenótipo MNPV não foi alterado. Desta forma, o gene p94 de AcMNPV não é um gene essencial para replicação e estabelecimento da infecção viral e sua aquisição no genoma do AcMNPV provavelmente proporcionou ao vírus uma vantagem seletiva. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The baculoviruses are a group of insect viruses with large dsDNA genomes, and their primary infection is triggered by rod-shaped enveloped virions (ODV) embedded in a crystalline protein matrix. Each virion may contain single (SNPV) or multiple nucleocapsids (MNPV) within an envelope, depending on the viral species. The genetic basis of this phenotype has not been identified and it does not seem to be correlated with baculovirus phylogeny. However, some closely related baculoviruses, such as BmNPV, BomaNPV and AcMNPV, have discordant phenotypes and may help to identify candidate genes. Therefore, we compared the genome of these viruses and found a unique gene (p94) that was present in BomaNPV and AcMNPV and was absent in BmNPV. This gene was the most significant difference among the BmNPV and the BomaNPN and AcMNPV genomes. To analyze whether this gene was related to the MNPV phenotype we constructed three recombinant baculoviruses: vAc-pol-p94-del (p94 disrupted), vAc-pol-p94-ha-rep (p94 repaired with -HA tag) and vAc-pol (control). We found that the P94 was detected at 6 h post-infection (p.i.) in the cytoplasm of infected cells with maximum accumulation at 24 h p.i. The lack of complete p94 gene (including the exclusion of the origin of DNA replication located there) in the AcMNPV genome resulted in a delay in DNA replication, BV production and IE1 expression. OB production in vitro was also decreased. Moreover, the ODV nucleocapsid envelopment was not chanced. Therefore, the p94 gene of AcMNPV is not an essential gene for viral DNA replication and establishment of viral infection. Its acquisition in some baculoviruses genomes might give a selective advantage for the virus.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 2 e Anexos. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-26T16:10:44Z No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-08T19:10:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T19:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Os baculovírus são vírus de insetos amplamente utilizados no controle biológico de pragas agrícolas e também como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas. Os baixos custos, a segurança na manipulação e as diferentes formas de expressão de proteínas tornam os baculovírus e células de inseto uma escolha eficaz para a correta expressão de antígenos vacinais e produção de VLPs (“Virus like particles”). No capítulo 1 deste trabalho, foi avaliado o potencial imunogênico de BVs (“Budded virus”) recombinantes contendo o EDIII (Domínio III da proteína de envelope do vírus da Febre amarela – FA) fusionado à proteína GP64 dos baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV); e também de uma massa protéica gerada pela fusão de EDIII com a proteína poliedrina de AcMNPV. O EDIII interage com os receptores celulares e contém os epítopos reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes, sendo assim alvo para a produção de uma vacina de subunidade. Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da correta expressão das proteínas recombinantes (GP64 + EDIII e Poliedrina + EDIII) por Western blot, microscopia de luz e confocal. No caso do EDIII fusionado à GP64 de AcMNPV e AgMNPV, as partículas virais recombinantes foram purificadas e inoculadas em camundongos. O teste de proliferação de linfócitos indicou uma maior proliferação em camundongos inoculados com o vírus recombinante contendo o EDIII fusionado à proteína GP64 do baculovírus AgMNPV quando comparado com o controle LPS. Testes complementares serão feitos, para avaliar o perfil da resposta imunológica e confirmar a obtenção de um antígeno vacinal contra FA. No capítulo 2, o sistema baculovírus de expressão foi utilizado para expressar o precursor da proteína GAG (Pr55) de HIV-1. A expressão de Pr55 HIV-1 é suficiente para a montagem de VLPs na membrana plasmática da célula do hospedeiro. Porém, a proteína GP64 de baculovírus é altamente imunogênica e também é expressa na superfície de células infectadas e normalmente está presente na superfície da VLP. Neste trabalho, mostramos que não é possível separar BVs e VLPs produzidos em um mesmo ciclo de infecção por baculovírus mesmo usando diferentes metodologias de separação. Então, utilizando um sistema que consegue produzir baculovírus recombinantes livres de GP64, foi construído o vírus recombinante vGAGHIV-1 GP64 null e utilizado na infecção de células Sf9. Por Western blot foi observado a perda do sinal da proteína GP64 de baculovírus no extrato de células infectadas com esse vírus recombinante. Essas mesmas células foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), mostrando que mesmo quando GP64 não está presente (o que resulta na ausência de produção de BVs), o brotamento de VLPs continua a acontecer. Essa técnica mostrou-se eficiente para a produção de VLPs livres de partículas ou proteínas baculovirais. Este trabalho confirma a eficiência do uso do sistema de expressão baseado em baculovírus para a expressão de proteínas e VLPs de interesse famacológico. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are insect viruses widely used in the biological control of agricultural pests and as a tool for heterologous protein expression. Their low production costs, security in manipulation and the many ways of protein expression, make baculoviruses and insect cells an effective choice for the efficient expression of vaccine antigens and VLPs (Virus like particles) production. In chapter 1 of this work, it was evaluated the immunogenic potential of recombinant BVs (Budded virus) containing EDIII (Yellow fever virus -YF- envelope protein domain III) fused to the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) GP64 protein; and also of a protein mass generated by the fusion of the EDIII and AcMNPV polyhedrin protein. The EDIII interacts with cell receptors and contains epitopes recognized by neutralizing antibodies, being the target for the production of a subunit vaccine. We showed in this work the confirmation of the correct recombinant protein expression (GP64 + EDIII and Polyhedrin + EDIII) by Western blot, optical and confocal microscopy. In the case of the EDIII fused with AcMNPV and AgMNPV GP64, the recombinant viral particles were purified and inoculated in mice. The lymphocyte proliferation assay showed a higher proliferation in mice immunized with recombinant virus containing the EDIII fused with the GP64 from the AgMNPV baculovirus comparing to the LPS control. Complementary assays will be carried out in order to evaluate the immunological response pattern and to confirm the production of a vaccine antigen against YF. In chapter 2, the baculovirus expression system was used to express the GAG protein precursor (Pr55) of HIV-1. The Pr55 expression is sufficient to VLP assembly on the cell host plasma membrane. However, the GP64 baculovirus protein is highly immunogenic and is also expressed on the surface of infected cells and is also present on the surface of the VLP. In this work, we showed that is not possible to separate BVs and VLPs produced in the same baculovirus infection cycle using different separation methodologies. Then, using a system able to produce GP64 free recombinant baculovirus, the recombinant virus vGAGHIV-1 GP64 null was produced and used to infect Sf9 cells. By Western blot analyses, it was shown that the baculovirus protein GP64 signal was missing in the recombinant virus infected cell extract. These same cells were observed by transmission electron microscopy (MET), showing that even when the GP64 is absent (which results in the absence of BVs production), VLPs budding continues to happen. This technique was shown to be efficient for VLPs production, free of baculvirus particles or proteins. This work confirms the efficiency of the baculovirus expression system for protein expression and VLPs of pharmacological interest.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-01T14:41:43Z No. of bitstreams: 1 2016_DeborahdaCostaLamar.pdf: 2872393 bytes, checksum: 9d419a56e6761d5e59959dc81459806d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-09T12:10:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DeborahdaCostaLamar.pdf: 2872393 bytes, checksum: 9d419a56e6761d5e59959dc81459806d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-09T12:10:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DeborahdaCostaLamar.pdf: 2872393 bytes, checksum: 9d419a56e6761d5e59959dc81459806d (MD5) / Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram positiva, produtora de cristais protéicos ou δ-endotoxinas (toxinas Cry e Cyt) durante a fase de esporulação. As toxinas. Cry apresentam atividade inseticida específica, e as toxinas Cyt apresentam atividade citolítica inespecífica. Algumas proteínas produzidas por B. thuringiensis durante a fase de esporulação que não apresentam caráter inseticida, mas apresentam-se tóxica para células tumorais foram descritas. Essas proteínas receberam o nome de Parasporinas (PS), devido à capacidade de produzir cristais paraesporais e até o momento são classificadas em seis tipos (PS1-PS6). Baculovírus são vírus de insetos usados no controle biológico de pragas da agricultura, porém também têm sido muito utilizados como vetores de expressão de proteínas heterólogas em células de inseto. No presente trabalho, o gene ps2 foi montado, por meio de PCR, através de fragmentos sintetizados a partir de uma sequência lotada no banco de dados, e o produto de PCR foi clonado em um vetor de transferência para construção de um baculovírus recombinante. Após obtenção do vírus recombinante, observou-se que células SF9 quando infectadas com vAcPS2, morriam em um tempo curto de infecção, quando comparado com células infectadas com o vírus selvagem. Após purificação, solubilização e ativação da toxina PS2 recombinante, ensaios de viabilidade celular foram feitos com linhagens de células tumorais, câncer mamário (MCF-7) e câncer mamário metastático (MDA-MB-231), células não tumorais humanas (fibroblastos) e células de inseto (Sf9), confirmando a atividade tóxica de PS2 apenas para as células tumorais. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacillus thunringiensis is a Gram positive bacterium that produces crystal forming proteins called δ-endotoxins (Cry and Cyt toxins), during sporulation phase. Cry toxins show specific insecticidal activity, and Cyt toxins shows non-specific cytolitic activity. Some proteins of B. thuringiensis produced during sporulation have not shown insecticidal activity, but a specific toxic activity to some cancer cells. These proteins were called Parasporins (PS) due to their ability to form paraporal crystals and they are divided in six groups (PS1-PS6). Baculoviruses are insect viruses that have been widely used as biological control of agricultural pests, but also as expression vectors of heterologous proteins in insect cells. In this work, the gene ps2, constructed by PCR, trough fragments synthetized using a gene sequence from a database and cloned in a transfer vector for recombinant virus construction After recombinant virus construction we observed that SF9 cells died faster than cells infected with the wild-type virus. After purification, solubilization and activation of the heterologous protein, cell viability assays was performed with cancer cell lines, breast cancer (MCF-7), metastatic brest cancer (MDA-MB-231), non-tumor human cells (fibroblasts) and insect cells (Sf9) confirming PS2 toxic activity only to cancer cells.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-26T20:04:04Z No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-10T17:19:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-10T17:19:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_SaluanaRochaCraveiro.pdf: 3241510 bytes, checksum: 02323233a9f77526e278dded20e15f95 (MD5) / Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus (ChinNPV) é um vírus patogênico à lagarta falsa-medideira, Chrysodeixis includens (Walker, 1858), uma praga polífaga que ataca 174 plantas hospedeiras, incluindo soja e algodão. Os baculovírus formam um grande grupo de vírus de DNA fita dupla circular, que infectam insetos da ordem Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera. Para uma melhor compreensão da virulência, evolução e biologia molecular de ChinNPV, este trabalho teve como objetivo determinar a sequência completa do genoma e a diversidade genética de sete isolados de ChinNPV (IA a IG). A diversidade genética foi inicialmente investigada por meio de análise das variações presentes nos core genes pif-2, lef- 9 e helicase de isolados de ChinNPV e de outros Alphabaculovirus. O gene pif-2 de ChinNPV recebeu destaque por, em contraste com o esperado, apresentar um grande número de polimorfismos não-sinônimos com a identificação de dois sítios sob pressão diversificadora. Os genomas dos isolados de ChinNPV (IA a IG) possuem tamanho variando de 138.869 a 140.859 bp e conteúdo de CG ~ 39%. Um total de 142 ORFs foram identificadas incluindo 37 core genes, 102 genes encontrados em outros baculovírus, 3 genes bro e duas ORFs únicas (Psin5 e Psin8). Homologous repeats (hrs), típicas de baculovírus, estão ausentes no genoma de ChinNPV. Os genomas dos isolados de ChinNPV têm alta similaridade com identidade mínima de 96,4% e, polimorfismos, indels e pequenos fragmentos foram observados ao longo dos genomas. Dois homólogos ao gene p26 (p26a e p26b) foram encontrados em ChinNPV. O padrão de agrupamento observado no cladograma da proteína P26 de NPVs indica que a aquisição do gene ocorreu em três eventos independentes de captura dentro da família Baculoviridae. ChinNPV tem uma sequência genômica distinta comparada a outros baculovírus sequenciados. As sete novas sequências do genoma completo de ChinNPV determinadas aqui constituem uma importante ferramenta para o melhor entendimento dos fatores de virulência, interação inseto-hospedeiro e da variação fenotípica observada em populações de baculovírus. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus (ChinNPV) is a virus pathogenic to the soybean looper, Chrysodeixis includens (Walker, 1858), a polyphagous pest that attacks 174 host plants including soybean and cotton. Baculoviruses are a large group of circular doublestranded DNA viruses that infect insects of the orders Lepidoptera, Hymenoptera and Diptera. In order to better understanding the virulence, evolution and molecular biology of ChinNPV, this study aimed to determine the complete genome sequence and genetic diversity of seven ChinNPV (IA to IG) isolates. Genetic diversity was initially investigated by analyzing variation present in the pif-2, lef-9 and helicase core genes in ChinNPV and other Alphabaculovirus isolates. The pif-2 gene unexpectedly showed a large number of non-synonymous polymorphisms with two sites identified to be under diversifying selection. The ChinNPV (IA to IG) genomes range in length between 138,869 and 140,859 bp and GC content of ~39% A total of 142 ORFs were identified including 37 baculovirus core genes, 102 genes found in other baculoviruses, three bro genes and two ORFs unique to ChinNPV (Psin5 and Psin8). The typical baculoviral homologous repeats (hrs) are absent in the ChinNPV genome. The ChinNPV genomes have high similarity with minimal identity of 96.4% and polymorphisms, indels and small fragment insertions throughout the genome were observed. Two p26 gene homologs (p26a and p26b) were found in the ChinNPV genome. The clustering pattern seen in the cladogram of NPV P26 protein indicates that the acquisition of these genes occurred in three independent capture events within the family Baculoviridae. ChinNPV has a distinct genomic sequence compared to other baculoviruses sequenced so far. The seven new ChinNPV whole genome sequences determined herein constitute an important tool for a better understanding of virulence factors, insect-host interaction and phenotypic variation observed in baculovirus populations.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-07T15:37:54Z No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-27T14:15:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T14:15:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Baculovírus são vírus de DNA de dupla fita circular que infectam insetos, inicialmente utilizados apenas como controle biológico por serem capazes de eliminar insetos-praga associados à agricultura. Nas décadas de 70 e 80, seu potencial como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado. Hoje, os baculovírus têm sido utilizados amplamente para expressar antígenos de uso vacinal ou diagnóstico e até mesmo utilizados como potenciais vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sua biossegurança é garantida pelo fato de não serem capazes de se replicar em células de mamífero. Entretanto, são capazes de penetrar nessas células, além de apresentarem propriedades imunoestimulatórias. Deste modo, inúmeras proteínas de importância médica e econômica foram expressas em níveis elevados aplicando desse sistema. Atualmente, não existem indústrias ou empresas nacionais disponíveis para a produção escalonável do antígeno de superfície HBsAg. Perante disso, os insumos são importados tanto para fins vacinais como para o diagnóstico. A vacina anti-rábica altualmente é constituída por suspensões de vírus purificados e inativados com β- propiolactona, representando um risco de manipulação. Portanto, a produção de proteínas virais recombinantes permitiu o desenvolvimento e métodos de diagnóstico e vacinas mais seguras. Neste trabalho foram construídos baculovírus recombinantes contendo os genes do antígeno HBsAg de HBV e de um peptídeo imunogênico derivado da glicoproteína do vírus da Raiva (Pept/G), fusionados à proteína poliederina (POLH) do baculovírus Autrographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). As proteínas recombinantes foram expressas em inseto e culturas de células na forma de agregrados protéicos cristalinos. A proteína recombinante contendo o antígeno HBSAg foi reconhecida por anticorpos anti-HBsAg em testes de imunoensaio (EIA) comerciais. A protéina recombinante contendo o Pept/G foi capaz de estimular o sistema immune de camundongos com sucesso, verificado por meio da proliferação celular in vitro. Desta forma, é possível concluir que proteínas recombinantes derivadas de vírus humanos fusionadas à protéina POLH de baculovírus são uma alternativa para a produção destes antígenos. / Baculovirus are circular double-stranded DNA viruses that infect insects and initially used only as biological control agents for being able to eliminate insect pests associated with agriculture. In the 1970s and 1980s, its potential as a tool for the expression of heterologous proteins began to be explored. Today, baculoviruses have been used extensively to express antigens for vaccine production, diagnostics and even as potential vectors for gene therapy and DNA vaccines. Their biosafety isguaranteed by the fact that baculoviruses are not able to replicate in mammalian cells. However, they can enter these cells and present immunostimulatory abilities. In this way, numerous proteins of medical and economic importance have been expressed at high levels applying this system. Currently, there are no Brazilian-based companies available to produce HBsAg surface antigen in a large scale, and the supplies to produce both vaccines and diagnostic kits are imported from other countries. The rabies vaccine currently consists of purified and inactivated virus suspensions with β-propiolactone, representing a health risk from its manipulation. Therefore, the use of recombinant proteins from viruses allowed the development of safer diagnostic methods and vaccines. In addition, this strategy may reduce the cost of vaccine manufacturing and eventually, contribute towards disease control. In this work, we constructed two recombinant baculoviruses; one containing of sHBsAg antigen gene of HBV and second recombinant containing an immunogenic peptide derived from the rabies virus glycoprotein (Pept/G). Both were fused to the polyhedrin protein (POLH) of the baculovirus Autrographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Recombinant proteins were expressed in insect cells and in insects in the form of crystalline protein aggregates. The recombinant protein containing the HBSAg antigen was used in commercial immunoassay (EIA) tests and was recognized by the anti-HBsAg antibodies. A recombinant protein containing Pept/G could successfully stimulate the immune system of mice which was verified by cell proliferation in vitro. Thus, it is possible to conclude that recombinant proteins derived from human viruses fused to the baculovírus POLH protein are an alternative to produce diagnostic tests and possible subunit vaccines.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Orientador estrangeiro: Dr. Rollie J. Clem / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-12-01T15:33:38Z No. of bitstreams: 1 2015_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 8216805 bytes, checksum: 109b644e5fc85d2df24444e26967bb22 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-01-23T12:13:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 8216805 bytes, checksum: 109b644e5fc85d2df24444e26967bb22 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-23T12:15:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 8216805 bytes, checksum: 109b644e5fc85d2df24444e26967bb22 (MD5) / Baculovirus são vírus de DNA dupla-fita circular capazes de infectar oralmente o estágio larval de insetos. Atualmente, são usados para o controle biológico de insetos praga e como vetores de expressão de proteínas heterólogas. Pouco é sabido das bases moleculares da interação do vírus com o hospedeiro e de sua evolução. Os fatores limitantes estão associados ao número de genomas sequenciados bem como a restrição do cultivo in vitro de várias espécies virais. De fato, a base para o início de quaisquer estudos moleculares mais detalhados de novas espécies de baculovírus ou de isolados certamente se inicia com o sequenciamento do genoma completo e com o estudo de genes encontrados. Dessa forma, neste trabalho, vários genomas de baculovírus isolados no Brasil foram sequenciados e descritos. Sequenciamos e descrevemos baculovírus isolados do mandarová-da-mandicoca, da broca da cana-de-açúcar, do bicho da seda, da lagarta polífaga Helicoverpa armigera, do mandarová-do-mate entre outros. Concomitante à descrição do genoma, caracterizamos estruturalmente algumas espécies, avaliamos a taxa de mortalidade em situações controladas de infecção, bem como caracterizamos alguns genes que permitiram um entendimento evolutivo mais amplo das espécies descritas e de sua interação com o hospedeiro. Descrevemos o primeiro inibidor de serino protease de baculovírus capaz de bloquear a imunidade inata do inseto hospedeiro e causar proteção ao patógeno. Encontramos o primeiro betabaculovírus com uma proteína de fusão de envelope de alphabaculovírus, a gp64 e caracterizamos sua funcionalidade. Além disso, mostramos pela primeira vez o papel de genes envolvidos no metabolismo de nucleotídeo e sua capacidade de alterar o desempenho viral. Em conclusão, baculovírus apresentam plasticidade genômica com aquisições proeminentes de genes de vários organismos como outros vírus de insetos, bactérias e plantas. Além disso, perdas de genes ancestrais e duplicação são eventos recorrentes. Tanto a genômica quanto o estudo molecular básico de baculovírus tem contribuído para a compreensão de doenças associadas a humanos como câncer e doenças virais cujo agente etiológico apresenta genoma com DNA dupla-fita ou que infectam primariamente o intestino médio de insetos, como herpesvírus e arboviroses, respectivamente. / Baculoviruses are circular double-stranded DNA viruses that are orally infectious to larval stages of insects. Nowadays, they are used as biological control agents of agricultural and forest pests and as vector for heterologous protein expression. The understanding of both the molecular basis and the evolution of the virus/host interaction is scarce due to the few numbers of sequenced genomes and the restriction in cultivating several virus species in vitro. In fact, the beginning of any molecular study of new baculovirus species or isolates certainly pervades the whole genome sequencing. Therefore, in this work, several genomes of baculoviruses isolated in Brazil were sequenced and described. We sequenced and described baculoviruses isolated from subject cadavers of the cassava hornworm (Erinnyis ello), the sugar cane borer (Diatraea saccharalis), the silkworm (Bombyx mori), the bollworm (Helicoverpa armigera), and the mate hornworm (Perigonia lusca). Together with the genome description, we characterized structurally some species, evaluated the mortality in controlled infections, and characterized as well some genes to better understand the novel species and their interaction with the host. We described the first baculoviral serine protease inhibitor capable of blocking the insect immunity response and causing pathogen protection. We found the first betabaculovirus harboring an alphabaculovirus envelope fusion protein, a gp64 and we characterized its functionality. Furthermore, we have shown for the first time a role of genes related to nucleotide metabolism and it ability of altering the virus fitness. In conclusion, baculoviruses present genomic plasticity with great and recurrent acquisition of genes from several organisms including other insect viruses, bacteria, and plant. Moreover, ancestral gene losses and duplication are common events in baculovirus evolution. Both genomics and molecular biology of baculovirus have contributed to the comprehension of human-associated diseases such as cancer and viral whereas the etiologic agent presents dsDNA genome or infects primarily the insect midgut like herpexviruses and arboviruses, respectively.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMKA.pdf: 1355556 bytes, checksum: 015ec3f0d664f509359ce4430140c3c1 (MD5) Previous issue date: 2007-03-14 / Financiadora de Estudos e Projetos / The development of the biotechnology has permitted to achieve, among other biotechnological products, many recombinant proteins which are largely used as vaccines, hormones, enzymes and other ways of human therapeutic activity. This is possible because the multidisciplinary: through the technology of the recombinant DNA the region that encode gene of interest is cloned in a system of adequate expression for super-expression of the correspondent protein and, through the technology of bioprocess is possible to increase the obtaining scale of the recombinant product assuring its reproducibility, integrity and functionality. Involving these two areas of knowledge, this works intends to express an heterolog protein, the Canacistatina, deriving from sugar cane, through an eucariotic expression system Sf9/baculovirus. This implies in the construction of a recombining baculovirus, containing the cDNA which codifies to the Canacistatina, and also the characterization of the cultivation of Sf9 cells, and of the process of infection by baculovirus, in kinetics and physiologic therms. In order to obtain these purposes it was done experiments of cultivation of Sf9 cells in Schott bottles of 100 mL, with work volume of 20 mL, in 27° C. In these experiments it was analyzed the optimum conditions of velocity agitation, inoculum s density, culture environment, and also the role of substrates. In relation to these parameters, it was observed that a better cell growth can be conduced in a 100 rpm of agitation, in an inoculum s density of 1x106 cell/ml, using a combination of 1:1 between the mediums SF900 II and TNM-FH (Medium 50%), without the necessity of addition of Bovine Fetal Sorum. This last aspect represents a great advantage in relation to the bioprocesses, in a way that it uses Sf9 cells already known. It was construed the recombining baculovírus containing the Canacistatina s gene through the modified genome of the baculovirus Autographa californica Multiple Nuclear Polihedrosis Virus and the infection experiments of Sf9 cells was made under three MOI values (1, 5 e 10 pfu/cell) in the two culture mediums. The betters results indicates to infection of Sf9 cells in 50% Medium using MOI= 5 pfu/cell, conditions that the Canacistatina s productivity reached 28 µg/106cel. / O desenvolvimento da biotecnologia tem permitido a obtenção, entre tantos produtos biotecnológicos, de muitas proteínas recombinantes utilizadas amplamente como vacinas, hormônios, enzimas e outras formas de atividade terapêutica humana. Isto é possível através da multidisciplinaridade, onde por tecnologia do DNA recombinante clona-se a região codificadora do gene de interesse em um sistema de expressão adequado para super-expressão da proteína correspondente e, pela tecnologia de bioprocessos torna-se possível o aumento de escala de obtenção do produto recombinante, garantindo sua reprodutibilidade, integridade e funcionalidade. Envolvendo estas duas áreas do conhecimento, o presente trabalho tem como objetivo a expressão de uma proteína heteróloga, a Canacistatina, natural da cana-de-açúcar, através do sistema de expressão eucariótico células Sf9/baculovírus. Isto abrange a construção de um baculovírus recombinante, contendo o cDNA que codifica para a Canacistatina, e a caracterização do cultivo de células Sf9 e do processo de infecção por baculovírus, em termos cinéticos e fisiológicos. Para estes fins, foram realizados experimentos de cultivo de células Sf9 em frascos Schott de 100 mL, com volume de trabalho de 20 mL, a 27ºC, nos quais foram analisadas as condições ótimas de velocidade agitação, densidade de inóculo, meio de cultura e também o papel dos substratos, obtendo-se que um crescimento celular otimizado pode ser conduzido a 100 rpm de agitação, com densidade de inóculo de 1x106 cel/ml e utilizando uma combinação 1:1 entre os meios SF900 II e TNM-FH (Meio 50%), sem a necessidade de adição de Soro Fetal Bovino. Este último aspecto representa uma grande vantagem em relação aos bioprocessos utilizando células Sf9 já conhecidos. Foi construído o baculovírus recombinante contendo o gene da Canacistatina a partir do genoma modificado de Autographa californica Multiple Nuclear Polihedrosis Virus e os experimentos de infecção de células Sf9 foram realizados sob três valores de MOI (1, 5 e 10 pfu/cel) nos dois meios de cultura. Os melhores resultados obtidos apontam para a infecção de células Sf9 em Meio 50% com MOI de 5,0 pfu/cel, condições nas quais a produtividade de Canacistatina alcançou 28 µg/106cel.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-20T17:08:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BrunoArrivabeneCordeiro.pdf: 3457427 bytes, checksum: d1f3ce112f52ac941c0578ad24456bda (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-04T16:13:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BrunoArrivabeneCordeiro.pdf: 3457427 bytes, checksum: d1f3ce112f52ac941c0578ad24456bda (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-04T16:13:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BrunoArrivabeneCordeiro.pdf: 3457427 bytes, checksum: d1f3ce112f52ac941c0578ad24456bda (MD5) / Os túbulos de Malpighi constituem o principal órgão excretor de insetos. Suas funções vão além da excreção, podendo participar da desintoxicação e resposta imune do inseto. A infecção por baculovírus com deleção em seu gene egt em larvas de lepidópteros promove uma degeneração precoce dos túbulos, com conseqüente melhor atividade do baculovírus, resultando em uma redução no tempo de morte das larvas. Porém, não são observados indícios de infecção nas células dos túbulos. O gene ecdysteroid udp-glucosyltransferase (egt) codifica a enzima EGT que é responsável pela transferência de unidades de UDP-galactose ou UDP-glicose para a ecdisona, inativando-a. Utilizando baculovírus AgMNPV recombinantes contendo genes marcadores egfp ou lacZ, analisou-se as alterações causadas nos túbulos de Malpighi de A. gemmatalis, utilizando microscopia de luz e eletrônicas de transmissão (MET) e varredura (MEV). Verificou-se a relação destas alterações com a ausência do gene egt e/ou presença de um gene marcador. Realizou-se um bioensaio para comparar a atividade dos baculovírus entre si. As infecções pelos baculovírus causaram alterações visíveis a partir de 24 horas pós-infecção em microscopia de luz, sendo possível observar as proteínas marcadoras presentes em células traqueolares e em regiões dos túbulos associadas às mesmas. Com o avanço da infecção, as proteínas marcadoras apresentaram-se em maiores proporções e a degeneração dos túbulos aumentou. Em MET, observou-se um aumento progressivo da desorganização das microvilosidades, alterações nos espaços citoplasmáticos, nas invaginações basais e mitocôndrias, deformações da lâmina basal, secreções apócrinas e morte celular, conforme o progresso da infecção. Por sua vez, em MEV, observou-se mudanças na superfície, a qual apresentou aspecto flácido e ressecado, reentrâncias, protuberâncias, poros e cristais conforme a progressão da infecção. No entanto, em nenhuma das análises por microscopia, observou-se indícios de infecção nas células dos túbulos de Malpighi. Os resultados mostraram uma melhor atividade dos baculovírus contendo lacZ em relação aos que contém egfp, sendo que a ausência de egt implicou em maior intensidade e velocidade das alterações. O tempo médio de morte (LT50) calculado a partir do bioensaio para os diferentes vírus revelou melhor atividade dos recombinantes contendo lacZ, sendo que o recombinante contendo egt se mostrou mais eficaz. Devido à ausência de indícios de infecção nas células dos túbulos, acredita-se que a degeneração dos mesmos é provocada indiretamente pela infecção. A morte das células dos túbulos pode estar relacionada à oncose, que pode ser provocada pela depleção das reservas energéticas, e também à apoptose, que pode ser ativada pelo acúmulo das proteínas marcadoras EGFP e LacZ. A ausência do gene egt pode estar resultando em um maior gasto energético pelo hospedeiro, agravando o processo de morte celular que está ocorrendo nos túbulos de Malpighi, resultando em redução no tempo de morte do hospedeiro. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Malpighian tubules constitute the main excretion organ of insects. Its functions go beyond excretion and may play a role in detoxification and immune defense of the insect. The infection by baculoviruses with their egt gene deleted in lepidopteron larvae promotes an early degeneration of the tubules with consequent better baculovirus activity resulting in reduction of the larvae time of death. However, there was no trace of infection in the tubules cells. The ecdysteroid udp-glucosyltransferase (egt) gene encodes the EGT enzyme, which is responsible for the transfer of UDP-galactose or UDP-glucose units to the ecdisone, inactivating it. Using AgMNPV recombinant baculoviruses containing egfp or lacZ, the alterations caused in the Malpighian tubules of A. gemmatalis were analyzed by light microscopy and transmission (TEM) and scanning (SEM) electronic microscopies. The relationship of the alterations observed with the absence of the egt gene and/or presence of a marker gene was verified. A bioassay was made to compare the baculoviruses activities among them. The infections by the baculoviruses caused visible alterations from 24 hours post-infection by light microscopy, being possible to observe the marker proteins in the tracheolar cells and regions of the tubules associated with them. As the infection advanced, the marker proteins appeared in higher proportions and the degeneration of the tubules increased. In TEM, a progressive increase was observed in the disorganization of the microvilli, alterations in cytoplasmic spaces, basal infolds and mitochondria, deformations in the basal lamina, apocrine secretions and cell death, accordingly to the progress of the infection. Meanwhile, in SEM, changes in the surface as a loose and parched aspect, reentrances, protuberances, pores and crystals, were observed according to the progression of infection. However, there was no trace of infection in the cells of the Malpighian tubules by the microscopic analyses. The results showed best activity for the baculoviruses containing lacZ compared to the ones containing egfp and the absence of egt implied in higher intensity and speed of the alterations. The mean time to death (LT50) calculated for the different baculoviruses revealed best activity of the recombinants containing lacZ but the recombinants containing egt were more pathogenic. Due to the absence of vestiges of infection in the tubules cells, it is believed that the degeneration of the tubules is provoked by infection indirectly. The cell death in the tubules might be related to oncosis, which may be activated by depletion of energy reserves and also related to apoptosis, which may be activated by accumulation of EGFP and LacZ. The absence of egt gene might be resulting in a higher energetic expense by the host, aggravating the cell death process that is taking place in the Malpighian tubules, resulting in reduction of host time of death.