Estudou-se a influência do fosfato na multiplicação de Saccharomyces cerevisiae em uma fermentação contínua em mini-fermentador. Determinou-se a massa seca, a concentração dos substratos, a velocidade específica de consumo dos substratos, a velocidade específica de formação de gás carbônico, velocidade específica de consumo de oxigênio e o quociente respiratório bem como, o fósforo intracelular em diversas vazões específicas de alimentação, em cultivo contínuo de levedura de panificação, em condições de substratos limitantes. Controlando-se a quantidade de fosfato no meio de alimentação de tal modo que o fosfato residual no meio de fermentação mal pudesse ser detectado, o valor da vazão específica de alimentação crítica era aparentemente aumentado de 0,23 h-1 para 0,32 h-1. Isto sugere uma possível influência do fosfato nas funções anaeróbicas e aeróbicas da levedura de panificação. / The influence of phosphate in a continuous culture was studied using mini-fermentor on the Saccharomyces cerevisiae multiplication. Dry matter, substrate concentration, specific substrate comsumption, specific carbon dioxide release, specific oxygen uptake rates and respiration quotient , as well as phosphorous content of the cells were measured in dependence on the dilutionrate. In continuous culture glicose-limited, of baker\'s yeast if the supply of phosphorous were restricted to a extent that residual phosphate in the medium could hardly be observed, the value of critical dilution rate was apparently enhanced from 0,23 h-1 to 0,32 h-1. This observation suggests a possible mediation by phosphate between anaerobic and aerobic functions of the baker\'s yeast.

Estudou-se a influência do fosfato na multiplicação de Saccharomyces cerevisiae em uma fermentação contínua em mini-fermentador. Determinou-se a massa seca, a concentração dos substratos, a velocidade específica de consumo dos substratos, a velocidade específica de formação de gás carbônico, velocidade específica de consumo de oxigênio e o quociente respiratório bem como, o fósforo intracelular em diversas vazões específicas de alimentação, em cultivo contínuo de levedura de panificação, em condições de substratos limitantes. Controlando-se a quantidade de fosfato no meio de alimentação de tal modo que o fosfato residual no meio de fermentação mal pudesse ser detectado, o valor da vazão específica de alimentação crítica era aparentemente aumentado de 0,23 h-1 para 0,32 h-1. Isto sugere uma possível influência do fosfato nas funções anaeróbicas e aeróbicas da levedura de panificação. / The influence of phosphate in a continuous culture was studied using mini-fermentor on the Saccharomyces cerevisiae multiplication. Dry matter, substrate concentration, specific substrate comsumption, specific carbon dioxide release, specific oxygen uptake rates and respiration quotient , as well as phosphorous content of the cells were measured in dependence on the dilutionrate. In continuous culture glicose-limited, of baker\'s yeast if the supply of phosphorous were restricted to a extent that residual phosphate in the medium could hardly be observed, the value of critical dilution rate was apparently enhanced from 0,23 h-1 to 0,32 h-1. This observation suggests a possible mediation by phosphate between anaerobic and aerobic functions of the baker\'s yeast.

Über die Proteinphosphorylierung in den Mitochondrien der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist im Gegensatz zu anderen Kompartimenten nur wenig bekannt. Insbesondere hinsichtlich der physiologischen Bedeutung sowie den an der Modifikation beteiligten Enzymen sind kaum Daten verfügbar. Vor diesem Hintergrund stand die Identifizierung und molekularbiologische Charakterisierung mitochondrialer Proteinkinasen (PKasen) und Proteinphosphatasen (PPasen) im Fokus dieser Arbeit. Unter Verwendung komparativer 2D DIGE-Analysen konnten zwei Strategien erfolgreich verfolgt werden: Zum einen wurde die Konsequenz einer Gendeletion von ausgewählten PKasen bzw. PPasen mit putativer mitochondrialer Lokalisation untersucht. Dabei gelang es, die an der in vivo Regulation des Pyruvatdehydrogenase(PDH)-Komplexes beteiligten Enzyme erstmalig zu identifizieren und im Folgenden deren regulatorisches Zusammenspiel umfassend zu analysieren. Zum anderen wurde in einem inversen Ansatz beispielhaft für die PKase Sat4p untersucht, welche Auswirkungen eine Überexpression dieser Kinase auf das mt Proteom hat. Erste Hinweise, welche zur Identifizierung der PDH-Kinasen (Pkp1p und Pkp2p) bzw. PDH Phosphatasen (Ppp1p und Ppp2p) führten, lieferten die signifikanten Spotänderungen von Pda1p (E1α-Untereinheit des PDH-Komplexes) in den 2D-DIGE-Analysen. Im Folgenden wurde die mitochondriale Lokalisation der vier regulatorischen Enzyme unter Verwendung Epitop-getaggter Varianten nachgewiesen sowie Pda1p in unabhängigen phosphospezifischen Analysen als Target der Phosphorylierung verifiziert. Die Phosphorylierungsstelle von Pda1p konnte massenspektrometrisch dem Serin313 zugeordnet werden. PDH-Aktivitätsmessungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Pda1p den PDH Komplex inaktiviert, während eine Dephosphorylierung zur Aktivierung führt. Dabei war der Einfluss der Deletion der PDH Kinasen bzw. der PDH-Phosphatasen unterschiedlich stark ausgeprägt. Während Ppp1p und Ppp2p partiell redundante Funktionen besitzen, lassen die Analysen komplementäre Aktivitäten von Pkp1p und Pkp2p vermuten. Eine physikalische Interaktion der beiden Kinasen wurde in vivo nachgewiesen und deutet auf die Bildung funktioneller Heteromere hin. Durch Analysen in der 2D-BN/SDS-PAGE konnte eine Assoziation der PDH-Kinasen sowie PDH-Phosphatasen mit dem hochmolekularen, etwa 8 MDa großen PDH-Komplex sowie mit PDH-Subkomplexen geringeren Molekulargewichts gezeigt werden. Die Erkenntnisse dieser Arbeit ermöglichten in Verbindung mit denen eigener Vorarbeiten die Erstellung eines Modells zur PDH-Regulation in Saccharomyces cerevisiae. Neben der Aktivitätsregulation durch die von Pkp1p/Pkp2p bzw. Ppp1p/Ppp2p katalysierte Phosphorylierung wird eine Funktion der regulatorischen Enzyme – insbesondere der PDH-Kinasen – an der Assemblierung bzw. Stabilisierung des PDH-Komplexes postuliert. Es konnte somit gezeigt werden, dass in der Hefe ein ähnlicher, aber nicht identischer Regulationsmechanismus vorliegt wie in höheren Eukaryoten. Die zweite Strategie, welche in dieser Arbeit exemplarisch für eine PKase verfolgt wurde, führte zur Identifikation einer bislang unbekannten Funktion der Kinase Sat4p in den Mitochondrien. Es konnte gezeigt werden, dass Sat4p dual lokalisiert in der cytoplasmatischen sowie mitochondrialen Fraktion vorliegt und selbst Target der Phosphorylierung ist. Die Überexpression von Sat4p führte nicht nur zu einem verminderten Wachstum auf nicht fermentierbaren Medien, sondern auch zur Beeinflussung spezifischer mitochondrialer Proteingruppen. Während die Spots der Proteine Pil1p und Lsp1p eine höhere Intensität zeigten, wiesen die Fe/S-Proteine Aco1p und Lys4p eine verminderte „steady-state“-Konzentration auf. Darüber hinaus lagen die Proteine, welche Liponsäure als prosthetische Gruppe tragen (Lat1p, Kgd2p und Gcv3p), im Tet-Sat4-Stamm vorwiegend in ihrer nicht-lipoylierten Form vor. Die Lipoylierungsstellen aller drei Proteine konnten im Wildtyp unter Nutzung von nanoLC-MS/MS erstmals experimentell bestimmt und Lys75 (Lat1p), Lys114 (Kgd2p) bzw. Lys102 (Gcv3p) zugeordnet werden. Die fehlende Lipoylierung der Proteine bzw. die verminderte Proteinkonzentration der Aconitase führte zu einer stark verminderten Aktivität der betroffenen Enzymkomplexe. Neben den in der Literatur beschriebenen putativen Funktionen von Sat4p bei der Regulation cytoplasmatischer Proteine wurde basierend auf den Erkenntnissen der Analysen eine spezifische Funktion der Kinase in den Mitochondrien postuliert. Das Modell schlägt eine Rolle von Sat4p in den späten Schritten der Maturation einer spezifischen Gruppe von mitochondrialer Fe/S-Proteinen vor. Die Beeinträchtigung der Lipoatsynthase Lip5p, welche neben Aco1p und Lys4p ebenfalls zu dieser Gruppe gehört, führt vermutlich sekundär zum beobachteten Verlust der Lipoylierung von Lat1p, Kgd2p und Gcv3p.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5322.pdf: 3668179 bytes, checksum: e3612c159bebd3f0a5be1640868316ae (MD5) Previous issue date: 2013-03-21 / Financiadora de Estudos e Projetos / The conversion of the hemicellulosic fraction in ethanol is a factor that impacts on the economic viability of the second generation ethanol production process from sugar cane bagasse. Hemicellulose from bagasse is a heteropolymer constituted by pentoses and glucose, being xylose the predominant sugar (~ 21 %). Among the available technological alternatives for ethanol production from xylose, SIF process (Simultaneous Isomerization and Fermentation), consisting of xylose conversion to xylulose by glucose isomerase (GI) enzyme and xylulose fermentation by the yeast S. cerevisiae, is considered a promising alternative. The main objectives of the present work were: i) evaluate the performance of different S. cerevisiae strains towards xylulose intake and ethanol productivity; ii) assess the influence of cultivation conditions (temperature, oxygen availability and initial xylose concentration) upon ethanol and xylitol production by the selected strains; iii) define the operation conditions for the continuous SIF process, using a system of fixed bed reactors associated in series. Preliminary experiments were conducted in 50 mL flasks, containing 4 g of pellets with a load of 20 % of immobilized GI, co-immobilized with yeast (load of 10 %) in alginate gel. For the screening of yeasts showing better performance on ethanol production from xylose, two commercial baker´s yeast strains (Itaiquara® e Fleischmann®), three industrial strains (BG-1, CAT-1 e PE-2) and one lab strain (CEN.PK113-7D) were evaluated. These experiments were performed at 35 oC, using a medium composed by xylose (60 g/L), urea (5 g/L), CaCl2 (1.9g/L) and several salts, at initial pH of 5.6. Additional SIF studies were carried out with the selected yeasts Itaiquara®, BG-1 or CEN.PK113-7D under different temperature conditions (40 oC), aeration (15 mL flasks) and initial xylose concentration (130 g/L) for comparison with the results obtained at the standard conditions. For SIF cultures, samples were withdrawal and the concentrations of reducing sugars were determined by DNS method while xylose, xylulose, ethanol and by-products (xylitol, glycerol etc) concentrations were assessed by liquid chromatography. Cell viability was also measured at the beginning and end of the experiment. When comparing the different yeasts, Itaiquara® strain presented the best performance, reaching ethanol concentrations of 22.4 g/L, with a productivity of 2.1 g/Lh. The conversion of xylose was similar for all studied industrial strains as well as among the baker s yeast and lab strains. Concerning the group of additional experiments, at 40 oC, a decrease of viability and ethanol selectivity was observed for Itaiquara®, whereas productivity and selectivity for CEN.PK113-7D. was improved. For the studies conducted under semianaerobic conditions, the yeast BG-1 showed an increase in selectivity and yield. However, the reaction time increased to app. 45 hours. On the other hand, the performance of strain Itaiquara® was not altered by the lower level of oxygen tested. In the experiment with 120 g/L of xylose, more than 40 g/L of ethanol was obtained in 24 hours of cultivation. Thus, we conclude that the SIF process proposed in the present work is a viable alternative for the production of ethanol from xylose or lignocellulosic residues. For the operation of the continuous system composed by fixed bed reactors associated in series, the recommended conditions include the Itaiquara® yeast with a temperature no higher than 35 oC, keeping the total residence time around 10 hours for a feeding supply containing 60 g/L of xylose. / A conversão da fração hemicelulósica da biomassa em etanol é um dos fatores que impactam a viabilidade econômica do processo de produção de etanol de segunda geração a partir do bagaço de cana-de-açúcar. A hemicelulose do bagaço é um heteropolímero constituído por pentoses e glicose, sendo a xilose o açúcar predominante (~ 21 %). Dentre as diversas alternativas tecnológicas para a produção de etanol a partir de xilose, o processo SIF (Simultânea Isomerização e Fermentação), consistindo na isomerização da xilose em xilulose pela enzima glicose-isomerase (GI) e na fermentação da xilulose pela levedura S. cerevisiae, é considerado uma alternativa promissora. Os principais objetivos do presente trabalho foram: i) avaliar o desempenho de diferentes cepas de S. cerevisiae em termos de assimilação de xilulose e produtividade em etanol; ii) estudar a influência das condições de cultivo (disponibilidade de oxigênio, temperatura e da concentração inicial de xilose) na produção de etanol e xilitol pelas cepas selecionadas; iii) definir as condições de operação para um processo SIF contínuo em sistema de reatores de leito fixo associados em série. Os experimentos preliminares foram conduzidos em frascos de 50 mL contendo 4 g de pelletes com carga de 20 % de glicose isomerase imobilizada, coimobilizada com levedura (carga de 10%) em gel de alginato. Para a seleção da levedura com melhor desempenho na produção de etanol a partir de xilose, foram avaliadas duas linhagens de levedura de panificação comercial (Itaiquara® e Fleischmann®), três cepas industriais (BG-1, CAT-1 e PE-2) e uma utilizada em laboratório (CEN.PK113-7D). Esses experimentos SIF foram conduzidos a 35ºC utilizando meio composto por xilose (60 g/L), ureia (5 g/L), CaCl2 (1,9 g/L) e sais diversos, em pH inicial 5,6. Experimentos SIF complementares foram realizados com as leveduras selecionadas Itaiquara®, BG-1 ou CEN.PK113-7D em diferentes condições de temperatura (40oC), aeração (frascos de 15 mL) e concentração inicial de xilose (130 g/L) para comparação com os resultados obtidos nas condições padrão. Em todos os experimentos SIF, amostras foram retiradas para determinação da concentração de açúcares redutores (método DNS) e de xilose, xilulose, etanol e subprodutos (xilitol, glicerol etc.) por cromatografia em fase líquida. Foi também acompanhada a viabilidade celular ao longo do cultivo. Na comparação entre as diferentes leveduras, destacou-se especialmente a levedura Itaiquara®, alcançando concentrações de etanol de 22,4 g/L, com produtividade em etanol de 2,1 g/Lh. A conversão de xilose foi semelhante entre as leveduras industriais e entre as leveduras de panificação e a de laboratório. Quanto ao conjunto de experimentos complementares, na temperatura de 40ºC houve diminuição de viabilidade e seletividade em etanol para a Itaiquara® e melhora na produtividade e seletividade para a CEN.PK113-7D. Nos experimentos realizados em condições semianaeróbias, a levedura BG-1 apresentou aumento de seletividade e rendimento em etanol, porém para um tempo de reação de 45 horas, aproximadamente. Já a levedura Itaiquara® não teve seu desempenho influenciado pela menor disponibilidade de oxigênio. No experimento realizado com 130 g/L de xilose, alcançou-se mais de 40 g/L de etanol em 24 horas de cultivo. Conclui-se, assim, que o processo SIF de xilose, proposto no presente trabalho, é uma alternativa viável para a produção de etanol a partir de xilose ou de resíduos lignocelulósicos. Para a operação em sistema contínuo composto por reatores de leito fixo associados em série recomenda-se a utilização de levedura Itaiquara® e de temperatura de, no máximo, 35ºC, mantendo-se o tempo de residência total em torno de 10 horas para uma alimentação contendo 60 g/L de xilose.

Über die Proteinphosphorylierung in den Mitochondrien der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist im Gegensatz zu anderen Kompartimenten nur wenig bekannt. Insbesondere hinsichtlich der physiologischen Bedeutung sowie den an der Modifikation beteiligten Enzymen sind kaum Daten verfügbar. Vor diesem Hintergrund stand die Identifizierung und molekularbiologische Charakterisierung mitochondrialer Proteinkinasen (PKasen) und Proteinphosphatasen (PPasen) im Fokus dieser Arbeit. Unter Verwendung komparativer 2D DIGE-Analysen konnten zwei Strategien erfolgreich verfolgt werden: Zum einen wurde die Konsequenz einer Gendeletion von ausgewählten PKasen bzw. PPasen mit putativer mitochondrialer Lokalisation untersucht. Dabei gelang es, die an der in vivo Regulation des Pyruvatdehydrogenase(PDH)-Komplexes beteiligten Enzyme erstmalig zu identifizieren und im Folgenden deren regulatorisches Zusammenspiel umfassend zu analysieren. Zum anderen wurde in einem inversen Ansatz beispielhaft für die PKase Sat4p untersucht, welche Auswirkungen eine Überexpression dieser Kinase auf das mt Proteom hat. Erste Hinweise, welche zur Identifizierung der PDH-Kinasen (Pkp1p und Pkp2p) bzw. PDH Phosphatasen (Ppp1p und Ppp2p) führten, lieferten die signifikanten Spotänderungen von Pda1p (E1α-Untereinheit des PDH-Komplexes) in den 2D-DIGE-Analysen. Im Folgenden wurde die mitochondriale Lokalisation der vier regulatorischen Enzyme unter Verwendung Epitop-getaggter Varianten nachgewiesen sowie Pda1p in unabhängigen phosphospezifischen Analysen als Target der Phosphorylierung verifiziert. Die Phosphorylierungsstelle von Pda1p konnte massenspektrometrisch dem Serin313 zugeordnet werden. PDH-Aktivitätsmessungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Pda1p den PDH Komplex inaktiviert, während eine Dephosphorylierung zur Aktivierung führt. Dabei war der Einfluss der Deletion der PDH Kinasen bzw. der PDH-Phosphatasen unterschiedlich stark ausgeprägt. Während Ppp1p und Ppp2p partiell redundante Funktionen besitzen, lassen die Analysen komplementäre Aktivitäten von Pkp1p und Pkp2p vermuten. Eine physikalische Interaktion der beiden Kinasen wurde in vivo nachgewiesen und deutet auf die Bildung funktioneller Heteromere hin. Durch Analysen in der 2D-BN/SDS-PAGE konnte eine Assoziation der PDH-Kinasen sowie PDH-Phosphatasen mit dem hochmolekularen, etwa 8 MDa großen PDH-Komplex sowie mit PDH-Subkomplexen geringeren Molekulargewichts gezeigt werden. Die Erkenntnisse dieser Arbeit ermöglichten in Verbindung mit denen eigener Vorarbeiten die Erstellung eines Modells zur PDH-Regulation in Saccharomyces cerevisiae. Neben der Aktivitätsregulation durch die von Pkp1p/Pkp2p bzw. Ppp1p/Ppp2p katalysierte Phosphorylierung wird eine Funktion der regulatorischen Enzyme – insbesondere der PDH-Kinasen – an der Assemblierung bzw. Stabilisierung des PDH-Komplexes postuliert. Es konnte somit gezeigt werden, dass in der Hefe ein ähnlicher, aber nicht identischer Regulationsmechanismus vorliegt wie in höheren Eukaryoten. Die zweite Strategie, welche in dieser Arbeit exemplarisch für eine PKase verfolgt wurde, führte zur Identifikation einer bislang unbekannten Funktion der Kinase Sat4p in den Mitochondrien. Es konnte gezeigt werden, dass Sat4p dual lokalisiert in der cytoplasmatischen sowie mitochondrialen Fraktion vorliegt und selbst Target der Phosphorylierung ist. Die Überexpression von Sat4p führte nicht nur zu einem verminderten Wachstum auf nicht fermentierbaren Medien, sondern auch zur Beeinflussung spezifischer mitochondrialer Proteingruppen. Während die Spots der Proteine Pil1p und Lsp1p eine höhere Intensität zeigten, wiesen die Fe/S-Proteine Aco1p und Lys4p eine verminderte „steady-state“-Konzentration auf. Darüber hinaus lagen die Proteine, welche Liponsäure als prosthetische Gruppe tragen (Lat1p, Kgd2p und Gcv3p), im Tet-Sat4-Stamm vorwiegend in ihrer nicht-lipoylierten Form vor. Die Lipoylierungsstellen aller drei Proteine konnten im Wildtyp unter Nutzung von nanoLC-MS/MS erstmals experimentell bestimmt und Lys75 (Lat1p), Lys114 (Kgd2p) bzw. Lys102 (Gcv3p) zugeordnet werden. Die fehlende Lipoylierung der Proteine bzw. die verminderte Proteinkonzentration der Aconitase führte zu einer stark verminderten Aktivität der betroffenen Enzymkomplexe. Neben den in der Literatur beschriebenen putativen Funktionen von Sat4p bei der Regulation cytoplasmatischer Proteine wurde basierend auf den Erkenntnissen der Analysen eine spezifische Funktion der Kinase in den Mitochondrien postuliert. Das Modell schlägt eine Rolle von Sat4p in den späten Schritten der Maturation einer spezifischen Gruppe von mitochondrialer Fe/S-Proteinen vor. Die Beeinträchtigung der Lipoatsynthase Lip5p, welche neben Aco1p und Lys4p ebenfalls zu dieser Gruppe gehört, führt vermutlich sekundär zum beobachteten Verlust der Lipoylierung von Lat1p, Kgd2p und Gcv3p.