Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007. / Title from PDF of title page. Document formatted into pages; contains 90 pages. Includes vita. Includes bibliographical references.

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007. / Includes vita. Includes bibliographical references (leaves 70-84). Also available online.

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A formulação HIVBr18, previamente desenvolvida e testada, é uma vacina de DNA que codifica 18 epítopos CD4, promíscuos e conservados do HIV-1, e que após imunização de camundongos transgênicos para diversas moléculas de HLA de classe II humanas, observou-se proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+ e produção de IFN-? direcionadas a múltiplos epítopos codificados pela vacina. Abordamos aqui estratégias baseadas na fusão ou combinação dos epítopos codificados pela vacina HIVBr18 à glicoproteína D (gD) do HSV-1, e também na coadministração de plasmídeos que codificam citocinas (IL-2, -12, -15 e GM-CSF) visando aumentar a imunogenicidade de HIVBr18. A sequencia de DNA que codifica os 18 peptídeos da vacina HIVBr18 foi amplificada por PCR e clonada em um plasmídeo que abrigava a sequencia da gD do HSV-1. dando origem ao plasmídeo pVAX-gDh-HIVBr18. Animais imunizados com gDh-HIVBr18 apresentaram resposta imunológica similar ao grupo que recebeu somente HIVBr18, não sendo diferente também daqueles que receberam plasmídeos gDh-HIVBr18 que sofreram alterações nas sequências para melhorar o padrão de distribuição hidrofóbica e permitir a migração da proteína de fusão para o meio extracelular. Construímos e testamos um plasmídeo bicistrônico que expressa gDh e HIVBr18 isoladamente, mas também não observamos aumento na resposta imune induzida. A coadministração com o plasmídeo HIVBr18 e plasmídeos que codificam as citocinas IL-12, IL-15 e GM-CSF, proporciona um aumento na magnitude da resposta imunológica induzida contra o pool de peptídeos codificados pela vacina, entretanto sem alteração da amplitude da resposta. Além disso, o plasmídeo de GM-CSF induziu maior número de células T CD4+ polifuncionais. Demonstramos também que a coadministração do plasmídeo que codifica GM-CSF, induz uma resposta imune celular de maior magnitude mesmo em uma condição de dose reduzida. Entretanto, observamos que esta citocina não é um bom adjuvante quando utilizamos como vetor de imunização um adenovírus que expressa os 18 epítopos / The formulation HIVBr18, previously developed and tested, is based on a DNA vaccine encoding 18 conserved and promiscuous HIV-1 CD4 epitopes and after immunization of transgenic mice for many human HLA class II molecules using this DNA vaccine, could be observed proliferation of CD4+ and CD8+ T cells and IFN-y production directed to multiple epitopes encoded by the vaccine. We intend to explore here, strategies based on fusion or combination of epitopes encoded by HIVBr18 vaccine with glycoprotein D (gD) of HSV- 1 and also the coadministration of cytokine-encoding plasmids (pIL-2, -12, -15 and pGM -CSF) aiming to enhance immunogenicity of HIVBr18. The DNA sequence of epitopes encoded by HIVBr18 vaccine was amplified by PCR and cloned into a plasmid that contained the sequence of gD, giving rise to plasmid pVAX-gDh-HIVBr18. After mice immunization, animals immunized with this construct showed similar immune response to the group that received HIVBr18, and also the group of animals that received gDh-HIVBr18 plasmid that had been modified by exchange in peptides order to assure to the molecule a better hydrophobic distribution and allow translocation to the extracellular face of cell membrane. We constructed and injected mice with a bicistronic plasmid expressing gDh and HIVBr18, simultaneously and isolated, but no increase in the magnitude of the immune response was observed. HIVBr18 coadministration with cytokine-encoding plasmids pIL-12, pIL-15 and pGM-CSF, provides an increase in the magnitude of immune response induced against the peptides encoded by the vaccine, and similar breadth. In addition, co-immunization with pGM-CSF induced greater number of polyfunctional CD4 + T cells. We also demonstrate that, even in a low dose approach coadministration of pGM-CSF induced a higher immune response than HIVBr18 alone in the same dose. However, we observed that this cytokine is not a good adjuvant when used in combination with an adenovirus that expresses the 18 HIV-1 epitopes.

A formulação HIVBr18, previamente desenvolvida e testada, é uma vacina de DNA que codifica 18 epítopos CD4, promíscuos e conservados do HIV-1, e que após imunização de camundongos transgênicos para diversas moléculas de HLA de classe II humanas, observou-se proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+ e produção de IFN-? direcionadas a múltiplos epítopos codificados pela vacina. Abordamos aqui estratégias baseadas na fusão ou combinação dos epítopos codificados pela vacina HIVBr18 à glicoproteína D (gD) do HSV-1, e também na coadministração de plasmídeos que codificam citocinas (IL-2, -12, -15 e GM-CSF) visando aumentar a imunogenicidade de HIVBr18. A sequencia de DNA que codifica os 18 peptídeos da vacina HIVBr18 foi amplificada por PCR e clonada em um plasmídeo que abrigava a sequencia da gD do HSV-1. dando origem ao plasmídeo pVAX-gDh-HIVBr18. Animais imunizados com gDh-HIVBr18 apresentaram resposta imunológica similar ao grupo que recebeu somente HIVBr18, não sendo diferente também daqueles que receberam plasmídeos gDh-HIVBr18 que sofreram alterações nas sequências para melhorar o padrão de distribuição hidrofóbica e permitir a migração da proteína de fusão para o meio extracelular. Construímos e testamos um plasmídeo bicistrônico que expressa gDh e HIVBr18 isoladamente, mas também não observamos aumento na resposta imune induzida. A coadministração com o plasmídeo HIVBr18 e plasmídeos que codificam as citocinas IL-12, IL-15 e GM-CSF, proporciona um aumento na magnitude da resposta imunológica induzida contra o pool de peptídeos codificados pela vacina, entretanto sem alteração da amplitude da resposta. Além disso, o plasmídeo de GM-CSF induziu maior número de células T CD4+ polifuncionais. Demonstramos também que a coadministração do plasmídeo que codifica GM-CSF, induz uma resposta imune celular de maior magnitude mesmo em uma condição de dose reduzida. Entretanto, observamos que esta citocina não é um bom adjuvante quando utilizamos como vetor de imunização um adenovírus que expressa os 18 epítopos / The formulation HIVBr18, previously developed and tested, is based on a DNA vaccine encoding 18 conserved and promiscuous HIV-1 CD4 epitopes and after immunization of transgenic mice for many human HLA class II molecules using this DNA vaccine, could be observed proliferation of CD4+ and CD8+ T cells and IFN-y production directed to multiple epitopes encoded by the vaccine. We intend to explore here, strategies based on fusion or combination of epitopes encoded by HIVBr18 vaccine with glycoprotein D (gD) of HSV- 1 and also the coadministration of cytokine-encoding plasmids (pIL-2, -12, -15 and pGM -CSF) aiming to enhance immunogenicity of HIVBr18. The DNA sequence of epitopes encoded by HIVBr18 vaccine was amplified by PCR and cloned into a plasmid that contained the sequence of gD, giving rise to plasmid pVAX-gDh-HIVBr18. After mice immunization, animals immunized with this construct showed similar immune response to the group that received HIVBr18, and also the group of animals that received gDh-HIVBr18 plasmid that had been modified by exchange in peptides order to assure to the molecule a better hydrophobic distribution and allow translocation to the extracellular face of cell membrane. We constructed and injected mice with a bicistronic plasmid expressing gDh and HIVBr18, simultaneously and isolated, but no increase in the magnitude of the immune response was observed. HIVBr18 coadministration with cytokine-encoding plasmids pIL-12, pIL-15 and pGM-CSF, provides an increase in the magnitude of immune response induced against the peptides encoded by the vaccine, and similar breadth. In addition, co-immunization with pGM-CSF induced greater number of polyfunctional CD4 + T cells. We also demonstrate that, even in a low dose approach coadministration of pGM-CSF induced a higher immune response than HIVBr18 alone in the same dose. However, we observed that this cytokine is not a good adjuvant when used in combination with an adenovirus that expresses the 18 HIV-1 epitopes.

The generation of recombinant antibodies (Abs) using phage display is a proven method to obtain a large variety of Abs that bind with high affinity to a given antigen. Traditionally, the generation of single-chain Abs depends on the use of recombinant proteins in several stages of the procedure. This can be a problem, especially in the case of cell-surface receptors, because Abs generated and selected against recombinant proteins may not bind the same protein expressed on a cell surface in its native form and because the expression of some receptors as recombinant proteins is problematic. To overcome these difficulties, we developed a strategy to generate single-chain Abs that does not require the use of recombinant protein at any stage of the procedure. In this strategy, stably transfected cells are used for the immunization of mice, measuring Ab responses to immunization, panning the phage library, high-throughput screening of arrayed phage clones, and characterization of recombinant single-chain variable regions. This strategy was used to generate a panel of single-chain Abs specific for the innate immunity receptor Toll-like receptor 2. Once generated, individual single-chain variable regions were subcloned into an expression vector allowing the production of recombinant Abs in insect cells, thus avoiding the contamination of recombinant Abs with microbial products. This cell-based system efficiently generates Abs that bind to native molecules on the cell surface, bypasses the requirement of recombinant protein production, and avoids risks of microbial component contamination. / Dissertation

Nas últimas décadas, tem sido relatado o aumento de casos de infecções fúngicas invasivas por agentes oportunistas, tais como Aspergillus spp., Fusarium spp. e fungos da ordem Mucorales, em pacientes hospitalizados, particularmente os imunocomprometidos. Como os sintomas são frequentemente inespecíficos, esses patógenos não são identificados inicialmente como agentes causais. Além disso, muitas vezes o diagnóstico só é estabelecido em estágios tardios da infecção, pois as metodologias diagnósticas de rotina, como cultura e microscopia, apresentam limitações caracterizadas, sobretudo, por baixa sensibilidade e especificidade. Os métodos moleculares, incluindo as amplificações de material genômico por PCR, em tecidos a fresco e parafinados, têm sido mais aplicados para a melhoria na detecção e identificação desses patógenos. A técnica de PCR em tempo real apresenta a vantagem de fornecer resultados com rapidez e elevada sensibilidade, além de minimizar os riscos de contaminação ambiental das amostras. Para aprimorar o conhecimento sobre a eficácia desta técnica na detecção e identificação dos patógenos, neste estudo foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c para o desenvolvimento de modelos de infecção invasiva por Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani. Após inoculação dos fungos por via intravenosa, os órgãos (pulmão, fígado, rins, cérebro e coração) foram retirados para realização dos exames de cultura, histopatologia, PCR semi-nested e PCR em tempo real. As culturas foram realizadas em ágar Sabouraud dextrose e incubadas por 3 a 5 dias à temperatura ambiente. Para as análises histopatológicas, uma parte dos órgãos foi emblocada em parafina e cortes foram submetidos às colorações por hematoxilina-eosina e Gomori-Grocott. Para as análises moleculares, foram realizadas clonagens dos amplicons obtidos com os mesmos primers gênero-específicos (Aspergillus spp. e Fusarium spp.) e ordem-específicos (mucoráceos) empregados nas reações de PCR. Os clones foram empregados na técnica de PCR em tempo real para avaliação da sensibilidade analítica dos ensaios e como controles positivos. Os tecidos a fresco e parafinados foram submetidos a extrações de DNA, e as amostras foram avaliadas por PCR do tipo semi-nested, e por PCR em tempo real, empregando-se os primers gênero e ordem-específicos. Após 48-72 horas, observou-se crescimento fúngico nas culturas, porém a identificação macroscópica foi possível somente após 96 horas. Nos exames histopatológicos foram observadas presença de estruturas fúngicas e alterações na morfologia tecidual, confirmando a disseminação da infecção nos três modelos experimentais. Os dois métodos de PCR (convencional e tempo real) empregando os primers para Aspergillus e mucoráceos demonstraram 100% de especificidade. Além disso, os primers para mucoráceos amplificaram amostras de DNA dos gêneros Rhizopus, Mucor e Lichtheimia, confirmando serem ordem-específicos. Por outro lado, os testes moleculares com emprego de diversos primers de Fusarium apresentaram reatividade cruzada, principalmente com amostras de DNA de Aspergillus e Rhizopus. O limiar de detecção (LD) das PCR semi-nested para Aspergillus e Rhizopus foi de 50 fentogramas de DNA, enquanto na PCR em tempo real o LD foi de 20 fentogramas de DNA e 2x102 plasmídios/ul. Os dois métodos moleculares detectaram DNA de Aspergillus e Rhizopus, em 100% das amostras de tecido a fresco e parafinado, corroborando com os resultados de cultura e histopatologia. Os resultados do estudo demonstraram que a PCR em tempo real foi capaz de detectar e diferenciar Aspergillus e Rhizopus nos tecidos a fresco e parafinados, com 100% de especificidade e maior sensibilidade analítica quando comparada à PCR semi-nested. Entretanto, os resultados obtidos com diversos primers de Fusarium utilizados nos ensaios de PCR foram inconsistentes em relação à especificidade das amplificações. A PCR em tempo real constituiu um método rápido para diagnosticar, com acurácia, aspergilose e mucormicose em tecidos, podendo ser implementada como alternativa na rotina diagnóstica de laboratórios de patologia ou microbiologia. Por outro lado, a técnica apresentou baixa especificidade com os primers de Fusarium selecionados neste estudo. Outras sequências gênicas deste fungo deverão ser avaliadas na técnica molecular para se atingir resultados precisos / Increase of invasive fungal infections by opportunistic agents, such as Aspergillus sp., Fusarium sp. and fungi from the order Mucorales, in immunocompromised patients has been reported in the last decades. As the symptoms are often non-specific, diagnosis are only established in late stages of infection. Routine diagnostic methodologies, such as culture and direct microscopy, have limitations due to their low sensitivity and specificity. Molecular methods, including amplifications of nucleic acids by PCR in fresh and paraffined tissues, have been more frequently applied to improve the detection and identification of these pathogens. The real-time PCR (qPCR) technique has the advantage of providing fast results with high sensitivity, as well as minimizing the risks of environmental contamination of the samples. This study aimed to evaluate the effectiveness of this technique for detection and discrimination of the fungal pathogens in tissues taken from BALB/c mice intravenously inoculated with Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus and Fusarium solani. The organs (lung, liver, kidneys, brain and heart) were removed from animals and analysed by culture, histopathology, semi-nested PCR and qPCR. Recombinant plasmid clones containing small sequences of Aspergillus, Fusarium and mucoraceous were used to draw qPCR standard curves and to evaluate the analytical sensitivity of the assays. The fresh and paraffined tissues were submitted to DNA extractions, and samples were evaluated by semi-nested PCR and qPCR with genus-specific primers for Aspergillus and Fusarium, and order-specific primers for mucoraceous. Cultures were positive for all fresh tissue samples. Presence of typical fungal structures and alterations in tissue morphology were observed in the histopathological examinations, confirming the dissemination of infection in the three experimental models. Both PCR assays employing Aspergillus and mucoraceous primers demonstrated 100% specificity. On the other hand, molecular tests using at least six different Fusarium primers showed cross reactivity, mainly with Aspergillus and Rhizopus DNA samples. The limit of detection (LD) of the semi-nested PCR for Aspergillus and Rhizopus was 50 femtograms of DNA, while for the qPCR it was 20 femtograms of DNA, and 2x102 plasmids/?l. Both molecular methods detected Aspergillus and Rhizopus DNA in 100% of fresh and paraffined tissue samples, corroborating the results with cultures and histopathology. The results of the study demonstrated that qPCR assay was able to detect and differentiate Aspergillus and Rhizopus in fresh and paraffined tissues, with 100% of specificity and higher analytical sensitivity when compared to semi-nested PCR assay. However, the results obtained with several Fusarium primers in the PCR assays were inconsistent regarding specificity of the amplifications. Real-time PCR assay is a fast and accurate method to diagnose aspergillosis and mucormycosis in tissues, and could be implemented as an alternative tool for diagnostic routine in pathology or microbiology laboratories. On the other hand, the technique showed low specificity with the Fusarium primers selected in this study. Other gene sequences should be evaluated by PCR assays techniques to achieve accurate results

Antigen-reaktive CD4+ T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung schützender Immunität. So sind Kenntnisse über die Bildung und Erhaltung CD4+ T-Zellen möglicherweise bedeutend für die Entwicklung verbesserter Impfstoffe und neuer Therapieansätze bei akuten und chronischen Infektionserkrankungen. Mit dieser Arbeit wurde eine genaue Charakterisierung CD4+ T-Zell-Antworten im Vergleich zu CD8+ T-Zellen am Infektionsmodell der murinen Listeriose vorgenommen. So konnten erstmals wichtige Unterschiede zwischen den beiden T-Zell-Kompartimenten beschrieben werden, insbesondere die Beobachtung, dass - im Gegensatz zu CD8+ T-Zellen - CD4+ Effektor-Gedächtniszellen nach bakterieller Infektion kontinuierlich im gesamten Organismus über die Zeit abnehmen.

Antigen-reaktive CD4+ T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung schützender Immunität. So sind Kenntnisse über die Bildung und Erhaltung CD4+ T-Zellen möglicherweise bedeutend für die Entwicklung verbesserter Impfstoffe und neuer Therapieansätze bei akuten und chronischen Infektionserkrankungen. Mit dieser Arbeit wurde eine genaue Charakterisierung CD4+ T-Zell-Antworten im Vergleich zu CD8+ T-Zellen am Infektionsmodell der murinen Listeriose vorgenommen. So konnten erstmals wichtige Unterschiede zwischen den beiden T-Zell-Kompartimenten beschrieben werden, insbesondere die Beobachtung, dass - im Gegensatz zu CD8+ T-Zellen - CD4+ Effektor-Gedächtniszellen nach bakterieller Infektion kontinuierlich im gesamten Organismus über die Zeit abnehmen.