Primäre Nestin-positive adulte Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Phänotypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Primärzellen in Kultur begründet, das in der vorliegenden Arbeit ausführlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und führt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorläuferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen könnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile Überex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 fördernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-überexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zurückzuführen. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und Überlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zellähnlichen Phänotypen differenzierbarer Vorläuferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur Lösung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie für den Diabetes mellitus leisten. / The definitive treatment of type 1 diabetes, namely transplantation of isolated pancreatic islets, is limited by rareness of donor organs. Generation of insulin producing cells from human pancreatic islet derived nestin+ precursors is well feasible and has recently been demonstrated (Zulewski et al, Diabetes 50:521, 2001). We therefore characterized a putative stem population of human islet-derived progenitor cells grown out of human pancreatic islets (hIZ). As we show here, these cells have a mesenchymal phenotype, express the filament protein nestin and feature a mean life span of 16 passages with continuous decrease of growth from passage 6 until growth arrest. This hampers the development of efficient differentiation strategies. We therefore tested the growth enhancing properties of the proliferation associated protein p8 in human nestin+ hMSC-TERT bone marrow derived adult stem cells, which share a similar phenotype as hIZ and have excellent differentiation potential not only into endocrine phenotypes. hMSC-TERT cells were transfected with CMV promoter driven p8-IRES-GFP or mock-IRES-GFP vectors. Transient transfection results in significantly increased numbers of GFP+ cells after 12 and 18 hours which remain elevated for up to 30 h. Loss of growth induction at later timepoints is caused by dilution of cellular plasmid content during mitosis. In contrast, stably transfected and selected subclones with p8 overexpression display durable significant augmentation of growth index (cell numbers) by 1.75 fold mock, respectively. This effect is not only due to an extensive increase in proliferation (BrdU+ cells, 2,7 fold mock) but also to a decrease in basal apoptosis (Caspase+ cells, -40% mock), as we could demonstrate. We characterized p8 as a potent molecular mediator of growth and expansion of mesenchymal stem cells such as hMSC-TERT and hIZ acting through both induction of cell proliferation and inhibition of apoptosis. These properties of p8 may be useful in the development of stem cell based tissue regeneration strategies by providing sufficient supply of homogeneous and fast-growing stem cell cultures for differentiation. In this way, the problem of limited availability of human donor material for definitive treatment of diabetes mellitus type 1 could be solved.

Die Insulinbiosynthese in ß-Zellen des endokrinen Pankreas wird auf transkriptioneller Ebene durch die Aktivität des Insulingenpromotors reguliert. Die detaillierte Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors erfolgte bisher nur in speziesdifferenten ß-Zelllinien, da glukosesensitive ß-Zelllinien aus dem Pankreas des Menschen nicht verfügbar sind. Es ist jedoch bekannt, dass signifikante Unterschiede in der transkriptionellen Regulation der Genexpression in unterschiedlichen Spezies existieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die spezifische Untersuchung der Regulation des humanen Insulingenpromotors hochsensitiv in primären humanen ß-Zellen des endokrinen Pankreas des Menschen möglich ist. Dazu wurde ein Vektor kloniert, der das SEAP (secreted alkaline phosphatase)-Reportergen unter der Kontrolle des -336 bp langen humanen Insulingenpromotors enthält. Im Laufe verschiedener Transfektionsexperimente mit dem Vektor p-336hInsP-SEAP, pSEAP2-Control (Positivkontrolle) und pSEAP2-Basic (Negativkontrolle) sowohl in INS-1-ß-Zellen, in beta-TC3-Zellen als auch in primären humanen ß-Zellen, zeigten sich in den luminometrisch bestimmten SEAP-Aktivitäten, die als Maß für die Aktivität des humanen Insulingenpromotors dienen, deutliche Unterschiede zwischen den transkriptionellen Aktivitäten der einzelnen Vektoren. Dieses System eignet sich also ausgezeichnet für die hochsensitive Analyse der Insulingenpromotoraktiviät. Zur detaillierteren Analyse wurden 5’-Deletionskonstrukte des Vektors p-336hInsP-SEAP konstruiert und damit INS-1- und beta-TC3-Zellen transient transfiziert. In beiden Zelllinien wurden Experimente bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen durchgeführt, um daraus Rückschlüsse auf die Glukoseresponsivität des humanen Insulingenpromotors ziehen zu können. Dabei zeigte der humane Insulingenpromotor die aus Versuchen mit dem RattenInsulingenpromotor 1 erwartete Glukoseresponsivität. Allerdings ließ sich keine Abnahme der transkriptionellen Aktivität des Promotors bei Abnahme der Länge der Konstrukte beobachten. Unter Verwendung von Effectene® als Transfektionsreagenz eignet sich das SEAP-System zur Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors in primären insulinproduzierenden Zellen aus dem menschlichen Pankreas. / Insulin biosynthesis in pancreatic beta-cells is primarily regulated at the transcriptional level by the activity of the insulin promoter. Due to the lack of human pancreatic beta-cell lines, detailed analysis of the regulation of the human insulin promoter was restricted in the past to heterologous rat, mouse and hamster pancreatic beta-cell lines, although it is known, that substantial differences exist in transcriptional regulation of genes in different species. Here the development of a method for specific investigation of the regulation of the human insulin promoter in primary human pancreatic beta-cells in isolated pancreatic islets from human donor organs is described. A vector was constructed, that expresses secreted alkaline phosphatase (SEAP) as a reporter gene under the control of -336 base pairs of the human insulin promoter. Doing different transfection experiments using the vectors p-336hInsP-SEAP, pSEAP2-Control (positive control) and pSEAP2-Basic (negative control) in INS1-beta-cells, beta-TC3-cells and also in primary human pancreatic beta-cells, distinct differences between the activity of the several vectors were shown through SEAP activity monitored by a fluorescent assay in the culture supernatant. To get more detailed information, 5’-deletions of the human insulin promoter were made and used for transfection of INS1- and beta-TC3-cells. It was possible to demonstrate glucose dependent activation of the human insulin promoter in both cell-lines. Using Effectene® as transfection reagent it is possible to analyse the regulation of the human insulin promoter activity in primary human pancreatic beta-cells. This will help to elucidate the molecular mechanisms of insulin biosynthesis in the human endocrine pancreas in physiology and diabetes mellitus.

Der Diabetes mellitus bezeichnet eine bislang unheilbare, metabolische Erkrankung, die mit schwerwiegenden Folgeerkrankungen einhergeht. Unter den potentiellen Strategien zur Heilung von Diabetes mellitus stellt die in vitro Generierung adulter β-Zellen des endokrinen Pankreas aus humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPS) einen vielversprechenden Ansatz dar. Zwar ermöglichen bisherige Protokolle die Herstellung von Zellen mit einem β-Zell-ähnlichen Charakter, jedoch zeigen diese eine zunächst eingeschränkte Funktion, die sich erst im Verlauf einer vollständigen, durch Transplantation induzierten, Reifung der Zellen, normalisiert. Vorangegangene Studien zeigen, dass sich die Extrazellularmatrix (EZM) von Geweben positiv auf das Überleben und die Funktion adulter, isolierter Langerhans-Inseln des Pankreas auswirkt. Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, ob Einflüsse der organspezifischen EZM die finale Reifung in vitro hergestellter β-Zellen herbeiführen können. Um diese Hypothese zu testen, wurde im Rahmen der vorliegenden Studie die Wirkung der pankreatischen EZM auf die in vitro Differenzierung von hiPS zu endokrinen Zellen des Pankreas untersucht sowie die Eignung der pankreatischen EZM zur Etablierung eines Organmodells des endokrinen Pankreas erprobt. Hierzu wurde zunächst eine pankreasspezifische EZM-Trägerstruktur (PanMa) durch Dezellularisierung von Pankreaten des Schweins mittels Natriumdesoxycholat hergestellt. Die generierte PanMa wurde anhand (immun-) histologischer Färbungen, Rasterelektronen-mikroskopie, Feststellung des DNA-Gehalts sowie durch Versuche zur Perfusion und Wiederbesiedelung mit Endothelzellen eingehend charakterisiert. Zudem wurde auf Basis der ermittelten Daten ein Bewertungssystem (PancScore) zur standardisierten Herstellung der PanMa entwickelt. Als Nächstes wurde untersucht, ob die PanMa über gewebespezifische EZM-Merkmale verfügt. Zu diesem Zweck wurden biophysikalische und strukturelle Eigenschaften wie Festigkeit, Porosität und Hygroskopie mittels rheologischer Messungen sowie Versuchen zur Teilchendiffusion und zum Wasserbindungsverhalten bestimmt und mit azellulären EZMs des Dünndarms (SISser) und der Lunge (LungMa) verglichen. Nach der eingehenden Analyse der PanMa wurde deren Effekt auf die Eigenschaften von Stammzellen sowie auf frühe Stadien der Stammzellentwicklung untersucht. Hierzu wurde die PanMa als Trägerstruktur während der Erhaltung sowie der spontanen Differenzierung von hiPS verwendet und der Einfluss der PanMa anhand von Genexpressionsanalysen und immunhistochemischer Färbungen analysiert. In einem nächsten Schritt wurde die Wirkung der PanMa auf die Differenzierung von hiPS zu endokrinen Zellen des Pankreas untersucht. Hierfür wurde die PanMa zum einen in flüssiger Form als Mediumzusatz sowie als solide Trägerstruktur während der Differenzierung von hiPS zu hormonexprimierenden Zellen (Rezania et al. 2012; Rezania et al. 2014) oder maturierenden β-Zellen verwendet (Rezania et al. 2014). Der Effekt der PanMa wurde anhand von Genexpressions-analysen, immunhistochemischer Färbungen und Analysen zur Glukose-abhängigen Insulinsekretion untersucht. In einem letzten Teil der Studie wurde die Eignung der PanMa zur verlängerten Kultivierung von hiPS-abgeleiteten endokrinen Zellen des Pankreas im Hinblick auf die Etablierung eines Organmodells des endokrinen Pankreas getestet. Hierzu wurde die PanMa zu einem Hydrogel weiterverarbeitet, welches zur Einkapselung und Kultivierung von hiPS-abgeleiteten hormonexprimierenden Zellen eingesetzt wurde. Um die Auswirkungen der Hydrogel-Kultur nachzuvollziehen, wurden die kultivierten Zellen mittels Genexpression, immun-histochemischer Färbungen und Analysen zur Glukose-abhängigen Insulinsekretion untersucht. Mittels Dezellularisierung porziner Pankreaten konnte eine zellfreie, pankreasspezifische EZM-Trägerstruktur mit geringen Restbeständen an DNA sowie einer weitgehend erhaltenen Mikro- und Ultrastruktur mit typischen EZM-Komponenten wie Kollagen I, III und IV hergestellt werden. Im Rahmen der Besiedelung arterieller Gefäße mit humanen Endothelzellen wurde die Zellkompatibilität der hergestellten PanMa sowie eine weitgehende Unversehrtheit der Gefäßstrukturen nachgewiesen. Verglichen zu SISser und LungMa zeichnete sich die PanMa als eine relativ weiche, stark wasserbindende, faserbasierte Struktur aus. Weiterhin konnten Hinweise für einen Effekt der PanMa auf den Stammzellcharakter und die frühe Entwicklung von hiPS beobachtet werden. Hierbei führte die Erhaltung von hiPS auf der PanMa zu einer leicht veränderten Expression von Genen des Kernpluripotenznetzwerks sowie zu einem reduziertem NANOG-Proteinsignal. Einhergehend mit diesen Beobachtungen zeigten hiPS während spontaner Differenzierung auf der PanMa eine verstärkte endodermale Entwicklung. Im Verlauf der pankreatischen Differenzierung führte die Kultivierung auf der PanMa zu einer signifikant verringerten Expression von Glukagon und Somatostatin, während die Expression von Insulin unverändert blieb, was auf eine Verminderung endokriner α- und δ-Zellen hinweist. Diese Veränderung äußerte sich jedoch nicht in einer verbesserten Glukose-abhängigen Insulinsekretion der generierten hormonexprimierenden Zellen. Unter Anwendung der PanMa als Hydrogel konnten hormonexprimierenden Zellen über einen verlängerten Zeitraum kultiviert werden. Nach 21 Tagen in Kultur zeigten die eingekapselten hormonexprimierenden Zellen eine unverändert hohe Viabilität, wiesen allerdings bereits eine erste veränderte Zellanordnung sowie eine leicht verminderte Glukose-abhängige Insulinsekretion auf. Zusammengefasst konnte in dieser Studie ein biologischer Effekt gewebespezifischer EZM-Merkmale auf die Differenzierung von hiPS nachgewiesen werden. Darüber hinaus weisen die Daten auf eine relevante Funktion der EZM im Rahmen der endokrinen Spezifizierung von hiPS während der pankreatischen Differenzierung hin. Diese Beobachtungen verdeutlichen die eminente Rolle der EZM in der Herstellung von funktionalen hiPS-abgeleiteten Zellen und plädieren für eine stärkere Einbindung organspezifischer EZMs im Bereich des Tissue Engineering und der klinischen Translation in der Regenerativen Medizin. / Diabetes mellitus is an incurable, metabolic disease, which is associated with severe long-term complications. The in vitro generation of pancreatic β-cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent a promising strategy for a curative therapy of diabetes mellitus. However, current differentiation strategies largely fail to produce functional β-cells in vitro and require an additional in vivo transplantation to achieve terminal maturation. Previous studies demonstrated a beneficial effect of the extracellular matrix (ECM) on the survival and sustained function of adult, isolated islets of Langerhans. This raises the question whether organ-specific cell-ECM interactions might represent the missing link driving the final stage of β-cell development. In order to address this issue, this study investigated the impact of the pancreas ECM on in vitro β-cell differentiation and its use for the establishment of a pancreatic endocrine organ model. To this purpose, a pancreas-specific ECM scaffolds (PanMa) was derived from porcine pancreata using whole organ decellularization with Sodium Deoxycholate. In a first step, the generated PanMa was thoroughly characterized using (immuno-) histological stainings, scanning electron microscopy and DNA quantification as well as perfusion and recellularization experiments with endothelial cells. Based on these data, a scoring system (PancScore) for a standardized PanMa generation was developed. Next, the generated PanMa was tested for the presence of tissue-specific ECM features. Therefore, the biophysical and physico-structural characteristics, such as rigidity, porosity and hygroscopy were analyzed using rheological measurements, particle diffusion analyses as well as a water evaporation assay and compared to the properties of ECM scaffolds derived from porcine small intestine (SISser) and lung (LungMa) to examine organ-specific scaffold cues. Following the thorough scaffold characterization, the impact of the PanMa on pluripotency and early development of hiPSC was studied. To this purpose, gene and protein expression of hiPSCs during maintenance culture and spontaneous differentiation on the PanMa were assessed. In a next step, the impact of the PanMa on the pancreatic endocrine differentiation of hiPSCs was tested. Therefore, the PanMa was used as a liquid media supplement or as a solid scaffold during the directed differentiation of hiPSC towards either pancreatic hormone-expressing cells (Rezania et al. 2012; Rezania et al. 2014) or maturing β-cells (Rezania et al. 2014). The impact of the PanMa on the generated cells was examined by gene expression analysis, immunohistochemical staining of important stage markers, as well as glucose stimulated insulin secretion assays. In a last part of this study, the potential of the PanMa for the prolonged culture of hiPSC derived endocrine cells for the establishment of an in vitro organ model of the endocrine pancreas was examined. Therefore, a PanMa-derived hydrogel was generated and used for the encapsulation and culture of hiPSC-derived hormone-expressing cells (HECs). The influence of the PanMa-hydrogel culture was analyzed on gene, protein and functional level by gene expression analysis, immunohistochemical stainings and glucose stimulated insulin secretion. Whole organ decellularization resulted in the generation of an acellular PanMa scaffold, with low amounts of residual DNA and a preserved ECM micro- and ultrastructure, including important ECM components, such as collagen I, III and IV. Furthermore, the PanMa maintained an intact vessel system and was verified as cytocompatible as demonstrated by the successful recellularization of the arterial system with human endothelial cells. In comparison to SISser and LungMa, the PanMa was characterized as a relative soft, hygroscopic scaffold with a collagen-fiber based structure. Furthermore, the findings indicate that the ECM-specific properties have a relevant effect on the stem cell character and early multi-lineage decisions of hiPSCs. In this regard, maintenance of hiPSCs on the PanMa resulted in a slightly changed expression of pluripotency genes (OCT4, SOX2 and NANOG) and a weak immunohistochemical signal for NANOG protein, indicating a PanMa-dependent impact on hiPSC pluripotency. Strikingly, this presumption was corroborated by the finding that culture on the PanMa promoted an endodermal development of hiPSCs during spontaneous differentiation. In line with that, pancreatic differentiation of hiPSC on both the PanMa and SISser resulted in a significant decrease of glucagon and somatostatin gene expression as well as an unaltered insulin expression, suggesting an ECM-driven suppression of the development of non β-cell endocrine cells. However, this change did not result in an improved glucose stimulated insulin secretion of the generated HECs. Moreover, use of the PanMa as a hydrogel allowed prolonged culture of these cells in a defined culture system. HECs were viable after 21 days of culture, however already showed an altered islet morphology as well as a slightly decreased glucose stimulated insulin secretion. Altogether, this study demonstrates a relevant biological effect of tissue specific ECM cues on the in vitro differentiation of hiPSCs. More specifically, the data indicate an involvement of the ECM in the endocrine commitment of hiPSC-derived pancreatic cells during directed differentiation highlighting the ECM as an important regulator of pancreatic development. Collectively, these findings emphasize the relevance of the ECM for the fabrication of functional hiPSC-derived cell types and suggest a much stronger consideration of organ specific ECM cues for tissue engineering approaches as well as clinical translation in regenerative medicine.

Background: Metastases to the pancreas are rare, accounting for less then 2 % of all pancreatic malignancies. However, both the benefit of extended tumor resection and the ideal oncological approach have not been established for such cases; therefore, we evaluated patients with metastasis to the pancreas who underwent pancreatic resection. Methods: Between 1994 and 2012, 676 patients underwent pancreatic surgery in our institution. We retrospectively reviewed patients’ medical records according to survival, and surgical and non-surgical complications. Student’s t-test and the log-rank test were used for statistical analysis. Results: Eighteen patients (2.7 %) received resection for pancreatic metastases (12 multivisceral resections and 6 standard resections). The pancreatic metastases originated from renal cell carcinoma (n = 10), malignant melanoma (n = 2), neuroendocrine tumor of the ileum (n = 1), sarcoma (n = 1), colon cancer (n = 1), gallbladder cancer (n = 1), gastrointestinal stromal tumor (n = 1), and non-small cell lung cancer (n = 1). The median time between primary malignancy resection to metastasectomy was 83 months (range, 0–228 months). Minor surgical complications (Grade I-IIIa) occurred in six patients (33.3 %) whereas major surgical complications (Grade IIIb-V) occurred in three patients (16.6 %). No patients died during hospitalization. The median follow-up was 76 months (range, 10–165 months). One-year, 3-year and 5-year survival for standard resection versus multivisceral resection was 83, 50, and 56 % versus 83, 66, and 50, respectively. Twelve patients died after a median of 26 months (range, 5–55 months). Conclusions: A surgical approach with curative intent is justified in select patients suffering from metastases to the pancreas and offers good long-term survival. The resection of pancreatic metastases of different tumor types was associated with favorable morbidity and mortality when compared with resection of the primary pancreatic malignancies. Our findings also demonstrated that multivisceral resection was feasible, with acceptable long term outcomes, even though morbidity rates tended to be higher after multivisceral resection than after standard resection.

Die Zelltherapie stellt einen neuen Ansatz zur Therapie des Diabetes mellitus Typ 1 dar und ist eine Alternative zur exogenen Insulinsubstitution. Um diese Therapieoption zu etablieren und zu optimieren benötigt man jedoch ausreichend Material, was angesichts des Mangels an Spenderorganen problematisch ist. Als potentieller unlimitierter Zellpool sind embryonale und adulte Stammzellen in den Fokus der Forschung gerückt. Da gegenüber der Verwendung embryonaler Stammzellen in Deutschland ethische Bedenken bestehen und die Forschung an ihnen rechtlich untersagt ist, konzentriert sich diese Arbeit auf die Etablierung einer Strategie zur Expansion und Differenzierung gewebsspezifischer adulter Stammzellen. Nestin als Stammzellmarker spielt hierbei eine zentrale Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Vektoren konstruiert, welche die zellspezifische Expression eines Reportergens in Nestin-positiven Zellen selektiv ermöglichen. Diese Ergebnisse tragen dazu bei, daß im weiteren Schritte folgen könnten, um die Proliferation adulter Stammzellen voranzutreiben und somit einen unlimitierten Zellpool zu generieren. Nach dessen Differenzierung in Insulin produzierende ß-Zellen und deren Präparation könnte der substantielle Mangel an Spenderorganen ausgeglichen und die Optimierung und Etablierung der ß-Zell-Ersatztherapie entscheidend vorangebracht werden. Zum jetzigen Zeitpunkt ist noch wenig über die molekularen Mechanismen, welche die Expansion und Differenzierung von ß-Zellen bzw. Stammzellen kontrollieren, bekannt. Ebenso unklar ist, ob die in Tiermodellen oder Zelllinien erarbeiteten Ergebnisse auf humane Zellen übertragbar sind. Dennoch geht man davon aus einen Punkt erreicht zu haben, an dem man mit Bestimmtheit davon ausgehen kann, in der Zukunft voll funktionelle Insulin produzierende ß-Zellen generieren zu können. Vor der Einführung in die Klinik werden jedoch noch mehrere Jahre vergehen. Inzwischen ist es notwendig, die derzeit bereits vorhandenen Therapiemöglichkeiten des Diabetes mellitus auszubauen und zu verfeinern. Denn bereits jetzt ist absehbar, dass auf den Großteil der derzeit zur Verfügung stehenden Behandlungsmöglichkeiten - selbst bei der optimalen Entwicklung einer Stammzell-basierten Therapie - nicht verzichtet werden kann.

Insulin-produzierende Zellen als Ersatz für die beim Diabetes mellitus Typ 1 zerstörten Betazellen stellen einen hochattraktiven Forschungsansatz dar. Ziel dieser Arbeit war, Insulin-positive Zellen aus in vitro modifizierten Blutmonozyten zu gewinnen. Blutmonozyten sind nicht nur, wie bereits seit längerem bekannt, in der Lage, sich in Makrophagen und dendritischen Zellen zu differenzieren, sondern auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen, wie z.B. Insulin-produzierender Zellen. Für die optimale Zelltherapie ist zu fordern, dass die gewünschten Zellen in vivo nicht nur ihre Funktion beibehalten, sondern dass von diesen Zellen auch kein immunologisches Risiko für den Patienten ausgeht. Eine dauerhafte Immunsuppression, wie sie für die Vollorgantransplantation notwendig ist, ist für Zelltransplantate nicht angebracht. Hier besteht Übereinkunft, dass Immunsuppressiva, wenn überhaupt, nur kurzfristig einzusetzen sind. Blutmonozyten lassen sich einfach gewinnen und stünden somit als autologer Zellersatz für eine mögliche Zelltherapie zur Verfügung. Ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit war, die in vitro Differenzierung von Blutmonozyten zu charakterisieren. Dabei sollte die Expression von Insulin, Gluka¬gon und dem Glukosetransporter Glut-2 nachgewiesen werden. Auch morpho¬logische Veränderungen während der Kultur sollten beobachtet werden. Die kultivierten Monozyten entwickelten sich mit zunehmender Kulturdauer eindeutig zu Makrophagen. Dabei waren zwei verschiedene Zellmorphologien zu unterscheiden: Der erste Zelltyp (Typ 1) war oval mit Ausläufern. Der zweite Zelltyp (Typ 2) war sehr groß, teilweise mit einem Durchmesser von über 500 μm, häufig von ovaler Form und polynukleär. Dieser Zelltyp wies zudem häufig einen breiten, um das Kerngebiet gruppierten Saum auf. Mit zunehmender Kulturdauer dominierte dieser Zelltyp die Kultur. Der Großteil der Typ 1-Zellen blieb CD14 positiv. Gab es CD14-negative Zellen in der Kultur, so gehörten sie mit großer Wahrscheinlichkeit zu den Typ 2-Zellen. Nur in den in vitro modifizierten, nicht aber in den frisch isolierten Monozyten waren Insulin, C-Peptid, Glukagon und GLUT-2 immunhistochemisch nachzu¬weisen. Mit zunehmender Kulturdauer dominierten stark adhärente Makrophagen die Kultur. Das aus ca. 5x106 Monozyten isolierte Insulin senkte den Blutzuckerspiegel diabetischer Mäuse innerhalb einer Stunde nach Injektion um 66,1±12,8 Prozent (n=5). Zum Vergleich: 170 pg Humaninsulin senkten den Blutzuckerspiegel um 84,2±8,4 Prozent (n=4). Insulin-negative Monozyten beeinflussten nicht den Blutzuckerspiegel diabeticher Mäuse. Zudem lassen erste elektronenmikroskopische Aufnahmen von in vitro modifizierten Monozyten Insulin-haltige Vesikel erkennen. Zum jetzigen Zeitpunkt ist gesichert, dass in vitro modifizierte Monozyten über biologisch aktives Insulin verfügen, das den Blutzuckerspiegel diabetischer Tiere senkt. Der Nachweis von C-Peptid deutet zudem darauf hin, dass es sich hierbei um de novo Insulin handelt. Dies bedeutet, dass das Insulin-Gen in den in vitro modifizierten Monozyten aktiv ist und sie Insulin mRNA exprimieren, die anschließend in Insulin translatiert wird. Der elektronenmikroskopische Nachweis Insulin-haltiger Granula deutet außerdem darauf hin, dass diese Zellen Insulin speichern können. Inwieweit sie jedoch auch zur Glukose-ab¬hängigen Insulin-Ausschüttung in der Lage sind, ist in weiteren Experimenten zu überprüfen. / Promising cell replacement strategies may restore insulin-secretion in patients with type 1 diabetes. Cells suitable for such a strategy must demonstrate prolonged function in vivo and should not induce immunological responses. A chronic immuno¬suppressive therapy which is requisite for organ grafts is not suitable for cell grafts. Peripheral human blood monocytes easily obtained from patients can be modified in vitro into insulin-positive cells and, therefore may be perfect for autologic cell replacement strategies. The purpose of this study was to characterise cultured monocytes for the presence of insulin and C-peptide as a well-defined indicator for insulin synthesis by immunohistochemistry. In addition, the expression of glucagon and the glucose transporter Glut-2 was proved. During culture, monocytes differentiated into cells with unique morphology. The cell type 1 showed a lengthy-oval shape with branches, like fibroblasts. The cell type 2 was very large, oval in shape and often polynuclear. These cells demonstrated the morphology of long-term cultured macrophages and dominated the culture in the course of time. Cultured monocytes were positive for insulin, C-peptide, glucagon and Glut-2 in contrast to freshly isolated monocytes. Evidence from the electron microscopy indicated that insulin-positive monocytes store their insulin in vesicles. Insulin isolated from 5x106 insulin-positive monocytes was able to reduce blood glucose levels of diabetic mice (> 22 mmol/L) about 66.1±12.8 percent (n=5) within one hour after injection. In comparison, 170 pg of human insulin decreased blood glucose levels of diabetic mice about 84.2±8.4 percent (n=4). Insulin-negative monocytes were unable to reduce blood glucose levels. In this study the possibility of modifying monocytes into insulin-positive cells during culture was confirmed. The detection of C-peptide supports the existence of de novo insulin within these cells which was stored in granula and biologically active. In further studies these cells have to prove whether they are really able to secrete insulin in a dose-dependent manner qualifying them as long-term cell replacements.

Die Studie des menschlichen T1D (Type 1 Diabetes), als eine Autoimmunerkrankung der Bauchspeicheldrüse, könnte man mit der Entdeckung von Insulin unter Verwendung von pankreatectomisierten Tieren argumentieren. Es folgten Studien zur Verfeinerung des Insulinersatzes, Verbesserung der Technologien und zur Untersuchung von Stoffwechsel- und Autoimmunphänomenen in Blutproben. Während Tiermodelle eine Endorgananalyse erlaubten, war die Untersuchung der menschlichen Bauchspeicheldrüse im Vergleich zu Studien mit peripherem Blut stark eingeschränkt. Anhand der so genannten peripheren Blutstudien, die nPOD (Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes), konnte eine menschliche Bauchspeicheldrüsenbank mit Proben von Personen zusammenzustellt werden, die durch die Analyse peripherer Blut-Autoantikörper (Wasserfall, et al., 2016) für T1D als risikoreich eingestuft wurde [CW 1]. Das Hauptziel meiner Dissertation bestand darin, mit diesen noch immer ansteigenden Proben, einige grundlegende Fragen der menschlichen T1D-Biologie zu beantworten. Zuerst konnten meine Kollegen und ich Insulitis bei Autoantikörper-positiven Probanden und bei Patienten mit T1D-Diagnose (Campbell-Thompson, et al., 2016a) studieren [CW 2]. Dabei fanden wir in 2 von 5 Pankreasproben Insulitis von Autoantikörper-positiven Probanden, beide mit der Kombination GADA und IA-2A. In Pankreasproben von T1D-Spendern mit weniger als einem Jahr Krankheitsdauer hatten 100% der Patienten eine Insulitis. Während, in denen mit mehr als einem Jahr Krankheitsdauer, 23% der Insulitis aufzeigten. Dies impliziert, dass die Insulitis vorwiegend zum Krankheitsbeginn auftritt und danach abnimmt. Das steht im extremen Gegensatz zum NOD-Mausmodell, bei dem Insulitis sehr früh auftritt und bei 100% der Inzuchtmäuse, unabhängig davon, ob sie T1D entwickeln oder nicht. Auch im Gegensatz zum NOD, während β-Zellmasse in T1D-Pankreasproben reduziert wurde, fehlte es nicht ganz. Wir bestätigten ebenfalls die Ergebnisse einer reduzierten Gesamtmasse menschlicher T1D-Pankreasproben, die nicht durch fehlende β-Zellen erklärt werden, da die nur einen kleinen Teil des Organs ausmachen. Dies impliziert den Verlust von exokrinem Gewebe in einer Art und Weise, die bis heute ungeklärt bleibt. Weiterhin haben wir getestet, ob Komplement eine potenzielle Rolle in T1D spielt, indem die C4d-Deposition als Marker für (Auto) Antikörpervermittelte Ereignisse verwendet wurde (Rowe, et al., 2013) [CW 3]. Unerwarteterweise fanden wir heraus, dass es erhöhte C4d Antikörperfärbung in T1D Pankreasproben gab. Dies implizierte die Verteilung potentieller exokriner Entzündungen und nicht unbedingt Insel-spezifische Ereignisse. Ob dies mit den Befunden der kleineren Bauchspeicheldrüse in T1D zusammenhängt, ist eine naheliegende Frage für zukünftige Studien. Bei der Zusammenstellung dieser Begriffe verwendete ich eine Technik, um Proteine aus gefrorenen Abschnitten der Bauchspeicheldrüse zu extrahieren und fand die Persistenz von Proinsulin, während die Insulin- und C-Peptid-Konzentrationen niedrig bis nicht nachweisbar durch ELISA in T1D-Proben waren (Wasserfall, et al., 2017) [CW 4]. Weiterhin konnten wir zeigen, dass INS mRNA durch ISH und RT-qPCR zusammen mit Proinsulin und Insulin durch Immunhistochemie anwesend war. Wir waren ebenfalls in der Lage, die Progression von T1D semi-quantifizieren, durch den Verlust von Insulin in Inselchen, sondern die Persistenz von Insulin-positiven Einzelzellen mit längerer Krankheitsdauer. Das Enzym PCSK1 wurde außerdem in T1D-Proben durch RT-qPCR reduziert, was auf einen möglichen Mechanismus für die unvollständige Verarbeitung von Proinsulin zu reifem Insulin und CPeptid hindeutet. Die Aufklärung dieses Prozesses und die Frage, ob die einzelnen insulinpositiven Zellen als therapeutische Option gerettet werden können oder ob sie die Zellen von β dedifferenzieren, werden in Zukunft weiterverfolgt.:TABLE OF CONTENTS II LIST OF ABBREVIATIONS IV LIST OF FIGURES V SUMMARY 1 1 MOTIVATION 1 2 STATE OF THE ART 6 2.1 Type 1 diabetes is an autoimmune disease 6 2.2 Models of type 1 diabetes 6 2.3 Humoral immune responses in type 1 diabetes 7 2.4 Genetics and Cell mediated immunity in type 1 diabetes 8 2.5 The lesion in type 1 diabetes 11 2.6 Prediction of type 1 diabetes in the general human population 14 3 OBJECTIVES 17 4 OWN RESEARCH RESULTS 19 4.1 Screening organ donors for type 1 diabetes autoantibodies is feasible 19 4.2 The insulitis lesion in humans reveals the heterogeneity of type 1 diabetes 20 4.3 Complement deposition in the human pancreas is not specific to islet blood vessels 22 4.4 The pancreas of individuals with type 1 diabetes shows progressive loss of insulin, but proinsulin persists 22 5 DISCUSSION 26 5.1 Even with a low prevalence disease such as T1D it is possible to screen organ donors for the presence of disease specific autoantibodies 26 5.2 Insulitis in the natural history of T1D 26 5.3 Complement deposition in the natural history of T1D 28 5.4 Presence of endocrine hormones in the natural history of T1D 29 6 RESUME 31 SUMMARY GERMAN 33 BIBLIOGRAPHY 35 LIST OF PUBLICATIONS 53 [CW1] Validation of a rapid type 1 diabetes screening assay for community-based screening of organ donors to identify subjects at increased risk for the disease 54 [CW2] Insulitis and β-Cell Mass in the Natural History of Type 1 Diabetes 66 [CW3] Increased Complement Activation in Human Type 1 Diabetes Pancreata 82 [CW4] Persistence of Pancreatic Insulin mRNA Expression and Proinsulin Protein in Type 1 Diabetes Pancreata 87 CURRICULUM VITAE 101 ACKNOWLEDGEMENTS 121 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 124 ANLAGE 1 125 ANLAGE 2 127

Die kardialen Hormone Atriales (ANP) und B-Typ (BNP) Natriuretisches Peptid üben bekannte renale und kardiovaskuläre Effekte aus, welche durch ihren gemeinsamen, cGMP-bildenden Guanylatzyklase-Rezeptor A (GC-A) vermittelt werden. Diese Effekte sind entscheidend an der physiologischen Aufrechterhaltung des arteriellen Blutdrucks sowie des intravaskulären Blutvolumens beteiligt. Darüber hinaus zeigen aktuelle Studien, dass NPs die Mobilisierung von Fettsäuren aus dem Fettgewebe und deren Oxidation durch die Skelettmuskulatur steigern sowie die Thermogenese in braunem und weißem Fettgewebe aktivieren können. Dadurch können NPs den Energieverbrauch erhöhen und die Insulinsensitivität verbessern. Desweiteren ist Übergewicht mit einer gestörten NP/GC-A/cGMP-Signalübertragung verbunden, die möglicherweise zur Entwicklung von Diabetes Typ 2 und dessen kardio-metabolischen Folgeerkrankungen beiträgt. In vitro stimuliert synthetisches ANP über GC-A die Glukose-stimulierte Insulinsekretion aus kultivierten pankreatischen Inseln und die β-Zellproliferation. Die Bedeutung für die systemische Insulin/Glukosehomöostase in vivo ist jedoch unklar. Um zu untersuchen, ob die endogenen Herzhormone die sekretorische Funktion und/oder die Proliferation von β-Zellen unter (patho)physiologischen Bedingungen in vivo modulieren, haben wir ein neues genetisches Mausmodell mit selektiver Deletion des GC-A-Rezeptors in β-Zellen (ß GC-A KO) generiert. In kultivierten Inseln von β GC-A KO-Mäusen waren die insulinotropen und proliferativen Effekte von ANP aufgehoben. Übereinstimmend damit führte die Infusion von BNP bei Kontroll-Tieren in vivo zu leicht erhöhten basalen Plasma-Insulinspiegeln und verbesserter Glukose-induzierter Insulinsekretion. Dieser Effekt von exogenem BNP konnte bei β GC-A KO-Mäusen nicht beobachtet werden, was die effiziente Deletion des GC-A-Rezeptors in β-Zellen bestätigt. Interessanterweise hatte die Ablation des GC-A-Rezeptors auf ß-Zellen unter basalen Bedingungen keinen Einfluss auf physiologische und metabolische Parameter in vivo. Sowohl männliche als auch weibliche ß GC-A KO-Tiere zeigten keine Unterschiede in der basalen Insulin- und Glukosehomöostase, da sie ähnliche Nüchtern-Blutzucker- und Insulinspiegel (nach Fasten über Nacht) aufwiesen wie die Kontroll-Mäuse. Allerdings zeigten die mit HFD gefütterten β GC-A KO-Tiere frühzeitiger Glukose-Intoleranz sowie eine verminderte adaptive β-Zellproliferation. Abgesehen davon war das konsistenteste Ergebnis der in vivo-Studien der geschlechtsabhängige Unterschied in der Auswirkung der ß-Zellspezifischen GC-A-Deletion auf die Glukose-stimulierte Insulinsekretion. Weibliche, aber nicht männliche ß GC-A KO-Mäuse zeigten erhöhte Nüchtern-Insulinspiegel und eine signifikant erhöhte Glukose-stimulierte Insulinsekretion, was zu einer deutlich verbesserten Glukosetoleranz führte. Der postulierte und untersuchte Mechanismus beinhaltet eine Interaktion von Östrogenen und NPs, welche die Expression des mitochondrialen Uncoupling Protein 2 beeinflussen. Diese Arbeit erweitert das derzeitige Wissen über die metabolischen Effekte des NP/GC-A-Systems. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, dass Natriuretische Peptide zu einer gesteigerten ß-Zellfunktion und Vitalität in frühen Stadien eines erhöhten Insulinbedarfs, d.h. bei Diabetes Typ 2, beitragen. Da die Studien eine wesentliche Rolle dieser kardialen Hormone im endokrinen Pankreas aufdecken, ist es umso wichtiger die pleiotropen Eigenschaften von NPs und ihre möglichen therapeutischen Anwendungen bei kardio-metabolischen Erkrankungen weiter zu untersuchen. / The cardiac hormones atrial (ANP) and B-type (BNP) natriuretic peptide exert well-known renal and cardiovascular actions which are mediated by their shared cGMP-forming guanylyl cyclase A receptor (GC-A). These actions are critically involved in the physiological maintenance of arterial blood pressure and intravascular volume homeostasis. In addition, recent studies indicate that NPs can increase fatty acid mobilization from adipose tissue and their oxidation by skeletal muscles and activate a thermogenic program in brown and white fat. Thereby NPs increase energy expenditure and improve insulin sensitivity. Moreover, obesity is associated with impaired NP/GC-A/cGMP signaling, which possibly contributes to the development of type 2 diabetes and its cardiometabolic complications. In vitro, synthetic ANP, via GC-A, stimulates glucose-dependent insulin release from cultured pancreatic islets and β-cell proliferation. However, the relevance for systemic insulin/glucose homeostasis in vivo is not known. To dissect whether the endogenous cardiac hormones modulate the secretory function and/or proliferation of β-cells under (patho)physiological conditions in vivo, here we generated a novel genetic mouse model with selective disruption of the GC-A receptor in β-cells (ß GC-A KO). In vitro, the insulinotropic and proliferative actions of ANP were abolished in islets isolated from β GC-A KO mice. Concordantly, in vivo, infusion of BNP mildly enhanced baseline plasma insulin levels and glucose-induced insulin secretion in control mice. This effect of exogenous BNP was abolished in β GC-A KO mice, corroborating the efficient inactivation of the GC-A receptor in β-cells. Interestingly, the ablation of the GC-A receptor under basal conditions had no effect on physiological and metabolic parameters in vivo. Both male and female ß GC-A KO animals showed no differences in basal insulin and glucose homeostasis, as they have similar fasting blood glucose and insulin levels (after overnight fasting) as the control mice. However, HFD-fed β GC-A KO animals had accelerated glucose intolerance and diminished adaptative β-cell proliferation. Apart from that, the most consistent result of the in vivo studies was the gender dependent difference in the impact of ß-cell GC-A deletion on glucose-stimulated insulin secretion. Female, but not male, ß GC-A KO mice showed enhanced fasted insulin levels and a markedly enhanced glucose-stimulated insulin secretion resulting in a distinctly improved glucose tolerance. The postulated and investigated mechanism involves an interaction of estrogens and NPs affecting expression levels of mitochondrial uncoupling protein 2. This thesis extends the current knowledge of the metabolic actions of the NP/GC-A system. Specifically the results indicate that natriuretic peptides contribute to enhanced ß-cell function and vitality during early stages of increased insulin demand, i.e. in type 2 diabetes. Since the studies show an essential role of these cardiac hormones in the endocrine pancreas, it becomes even more important to further investigate the pleiotropic actions of NPs and their potential therapeutic applications in cardio-metabolic diseases.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) has an extremely poor prognosis. To improve the prognosis, novel molecular markers and targets for earlier diagnosis and adjuvant and/or neoadjuvant treatment are needed. Recent advances in human genome research and high-throughput molecular technologies make it possible to cope with the molecular complexity of malignant tumors. With DNA array technology, mRNA expression levels of thousand of genes can be measured simultaneously in a single assay. As several studies using microarrays in PDAC have already been published, this review attempts to compare the published data and therefore to validate the results. In addition, the applied techniques are discussed in the context of pancreatic malignancies. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Background: Pancreatic métastases from renal cell carcinoma (RCC) are clinically rare but highly resectable. The aim of this article is to identify patients who profit from pancreatic resection of RCC despite the invasiveness of the surgery. Methods: Between January 1996 and December 2007, data from 744 patients were collected in a prospective pancreatic surgery database, and patients with metastasis into the pancreas from RCC were identified. Results: Resective surgery was performed in 14 patients with metastasis to the pancreas from RCC. Most patients were clinically asymptomatic. The median interval between primary treatment of RCC and occurrence of pancreatic metastasis was 94 months (range 32–158). The morbidity rate was 42.8%. Patients with a metastasis size <2.5 cm had a much better survival after resection (100 months) than those with a metastasis size >2.5 cm (44 months). Moreover, the number of métastases predicts the survival after resection. Conclusions: In patients with pancreatic métastases from RCC who have only limited disease, complete resection of all lesions can be successfully performed with a low rate of complications. Thus, patients with a history of RCC should be monitored for more than 10 years after nephrectomy to detect recurrence. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.